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日本血吸虫尾蚴标本制作流程的改进
目的:探索日本血吸虫尾蚴标本制作流程的改进.方法:启用灿烂甲酚兰、伊红染色,改革制作流程,省略了传统制作中的固定、分色、脱水、透明等步骤.结果:制成的日本血吸虫尾蚴标本,结构清晰美观,虫体弯曲自然,无卷曲、重叠.结论:改进后的方法效果好,提高了标本的制作质量,而且操作简单易行,值得在有关教学与科研单位推广.
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湖南省日本血吸虫病新流行形势下的防治思考
血吸虫病防治仍然采用吡喹酮化疗,吡喹酮的化疗对再感染却没有抵抗力,研制预防血吸虫病疫苗成为迫切需要.结合现阶段家畜已经成为湖南省血吸虫病重要的传染源这一流行的新趋势,建议应采用综合防治措施,大力发展畜用血吸虫病疫苗,遏制血吸虫病的流行;同时作为预防血吸虫病临床前的试验,为人用疫苗的研制打下坚实的基础.
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日本血吸虫再感染危险因素的探讨
目的探讨山丘型疫区日本血吸虫再感染的有关危险因素.方法选取一山丘型疫区,随访观察居民吡喹酮普治后疫水接触及血吸虫再感染状况,对可能影响血吸虫再感染的有关因素进行非条件logistic回归分析.结果多因素非条件logistic回归分析结果显示再感染与下列因素有关:化疗前每克粪便虫卵数(OR=2.066,95%CI:1.173～3.639),性别(OR=4.260,95%CI:1.275～14.235),4～10月份疫水接触平均指数B(OR=1.138,95%CI:1.045～1.240),性别与4～10月疫水接触平均指数B间的交互作用(OR=0.875,95%CI:0.817～0.982).结论性别、化疗前感染度、疫水接触的持续时间及暴露面积与再感染的发生有关,其中性别与疫水接触之间尚存在弱的拮抗作用.
关键词： 日本血吸虫 化疗 危险因素 非条件Logistic回归分析 -
应用聚合酶链反应检测日本血吸虫基因组DNA
中国是日本血吸虫病主要流行区[1],疫情形势严峻.准确评估钉螺感染和水体污染情况,对疫情防制意义重大.传统的压碎法、逸蚴法和哨鼠法灵敏性都较低[2],影响了血防工作的效率.有人尝试将PCR方法用于血吸虫病的诊断和流行监测[3-5],其中根据埃及和曼氏血吸虫中发现的串联重复序列建立的PCR方法都表现出极高的灵敏性[6-8],实用前景乐观[9].本研究的主要目的是揭示日本血吸虫中可能存在的该序列,优化PCR条件,评价其灵敏性.
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山区日本血吸虫中间宿主钉螺的世代交替研究
目的 探索自然生态环境下山区钉螺的世代交替情况.方法 2008年2月至2009年7月选择四川省普格县境内的一块典型钉螺孳生地为现场,随机抽样查螺,并观察钉螺交配情况.在实验室条件下测量钉螺体型指标,经压螺鉴定死活后分框计数,随机抽样解剖钉螺确定性别构成.绘制活螺密度、钉螺体型均值、性别构成和交配对数的时间分布图,成螺和幼螺的时间分布图.结果 全年均有活螺存在,其密度呈现高和低的波动变化.三种体型均值表现出一致的时间变化趋势,呈现动态更替现象.幼螺全年存在,幼螺所占的比例从5月开始持续上升,在10月超过成螺成为优势螺.成幼螺存在循环往复的新老交替过程.钉螺各月性别构成的差异无统计学意义.每年4-6月钉螺交配对数较多,为其主要的繁衍期.结论 山区钉螺幼螺全年存在,除10月外的其他各月,成螺均为优势螺.山区钉螺存在一个循环往复的世代交替过程,该过程从5月开始,于10月完成,钉螺种群呈现动态平衡.
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聚合酶链反应及基因芯片技术检测日本血吸虫的研究
目的探索研制检测日本血吸虫的基因芯片.方法依据日本血吸虫高度保守的编码免疫原性毛蚴抗原的5D基因,筛选、设计聚合酶链反应(PCR)的引物和基因探针,制成日本血吸虫基因芯片.检测时首先抽提尾蚴、成虫、虫卵、感染性钉螺的DNA,同时利用对照华支睾吸虫、姜片虫、卫氏并殖吸虫的DNA分别进行PCR扩增及不对称PCR荧光标记,然后用荧光标记后的靶序列与制备的检测芯片进行杂交,杂交结果用ScanArray 3000扫描仪扫描.结果研制的基因芯片能有效地检测出单个尾蚴、虫卵、阳性钉螺或极微量成虫组织DNA,而常见的华支睾吸虫、姜片虫、卫氏并殖吸虫等未见阳性结果.结论成功制备了检测日本血吸虫的基因芯片,并具有快速、灵敏、特异等特点.
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应用EST和电子克隆策略研究血吸虫表达基因谱
目的开展血吸虫表达基因谱的研究,寻找新的疫苗候选分子和药物靶标.方法应用表达序列标签(EST)和电子克隆策略.结果获得了552个EST序列和487个电子延伸序列,其中104个EST序列在延伸前未表现同源性,而延伸后表现出有意义的同源性;获得了日本血吸虫基因表达谱的信息以及发现了有潜在药物和疫苗价值的新基因序列.结论本研究为日本血吸虫基因表达谱的研究提供更有效的研究思路.
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日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原54kD等抗原保护力的鉴定
用SDS-PAGE制得的日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原SIEA 54kD抗原免疫小鼠,用尾蚴攻击感染后,其肝内的总虫卵数和成熟卵的比例与对照组小鼠比较有显著的减少.SIEA 54kD抗原分子诱导的免疫有很强抗雌虫生殖和抗胚胎发育效果,因此可望作为日本血吸虫抗病疫苗候选分子.
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血吸虫病小鼠动物模型在人体寄生虫学教学中的应用
为了加深学生对人体寄生虫学课程中血吸虫病内容的理解,探索行之有效的辅助教学手段将有助于提升教学效果.本文通过小鼠感染日本血吸虫建立血吸虫病动物模型,设计规范的教学内容,充分合理使用动物模型资源,在实习课堂上对日本血吸虫生活史主要发育阶段、寄生特征、小鼠血吸虫病模型的症状、重要脏器的病变特点和病理变化一一进行展示和解读,培养学生实践操作能力,应用动物模型来弥补理论课堂上抽象教学的不足,建立学生对血吸虫病的系统性认识,从而提升人体寄生虫学课程的教学质量,促进医学基础课程教育.
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巢式PCR检测日本血吸虫感染的研究
本研究通过设计2对巢式引物扩增日本血吸虫高拷贝的Sjα1基因片段,建立检测日本血吸虫感染的巢式PCR技术,并对感染小鼠血清、全血样本以及实验和现场钉螺样本进行检测.建立的巢式PCR方法特异性扩增日本血吸虫420 bp的Sjα1片段,和曼氏血吸虫没有交叉,基因组DNA作为模板时低检测量为0.1fg.小鼠感染日本血吸虫后2周的血清样本中即能检测出特异性DNA,建立的方法能同时检测血清和全血标本.钉螺实验感染4 h后能检测到日本血吸虫DNA,现场采集钉螺的检测结果显示比传统的镜检方法敏感性高.建立的巢式PCR检测日本血吸虫感染具有较高的敏感性和特异性,为疾病诊断和媒介调查提供了新的分子生物学检测技术.
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日本血吸虫卵壳蛋白基因的克隆及真核表达载体的构建
血吸虫卵壳蛋白基因是探讨血吸虫病免疫预防的重要靶标.本研究根据已发表的多个血吸虫卵壳蛋白基因的核苷酸序列,设计合成了特异引物,体外扩增和克隆了编码日本血吸虫中国大陆株卵壳蛋白基因SjESG的cDNA,测序结果表明与已发表的卵壳蛋白基因序列有较高同源性.为进一步研究该基因的功能,将其克隆入pcDNA3中,成功构建了真核表达载体,为SjESG DNA疫苗的研究打下了基础.
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从基因水平对IL-5与IL-10在日本血吸虫感染小鼠中作用的探讨
本研究对日本血吸虫感染小鼠脾细胞体外在SEA与ConA诱导下产生的IL-5和IL-10 2种细胞因子从mRNA转录水平进行研究,以探索这2种细胞因子mRNA转录水平的动态变化与肉芽肿形成与调节的可能性.日本血吸虫尾蚴感染雄性BALB/C小鼠后,分别于感染后3周、5周、8周、10周和12周取小鼠脾脏,制备脾细胞单细胞悬液并于含ConA或SEA的培养基中培养后提取脾细胞总RNA.RT-PCR及凝胶分析法被用来分析总RNA样品中IL-5及IL-10mRNA转录水平. 研究结果显示,未感染和感染3周小鼠脾细胞均无IL-5和IL-10的表达,感染后第5周的小鼠脾细胞出现IL-5特异性条带,感染后第8周IL-5表达明显增强,感染后第10周IL-5mRNA 转录水平下降,感染后第12周未能检测到IL-5表达,表明IL-5表达的动态变化与肉芽肿的形成、发展及调节相平行.IL-10mRNA转录也于感染后第5周出现,但感染后第8周、第10周、第12周与第5周相比,IL-10的表达水平并无明显改变,显示IL-10mRNA转录水平并未随着肉芽肿的调节而变化.本研究结果提示IL-5可能在肉芽肿形成和调节过程中可能起重要作用;而IL-10可能并未直接参与肉芽肿的调节,但其转录可能与防止宿主过度肉芽肿炎症反应有关.
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18日龄日本血吸虫酵母双杂交cDNA文库的构建
为揭示血吸虫生长发育机理,深入研究血吸虫与宿主、血吸虫雌雄虫之间蛋白质的相互关系,本研究选取血吸虫进入终末宿主体内18天时的虫体(发育成熟初期),采用Clontech Matchmaker技术成功构建日本血吸虫的酵母双杂交cDNA文库.该文库具有基因多样性和足够大的库容量,库容量为2.5×106 pfu/mL,插入的双链cDNA片段的长度在0.25～2.0 kb之间,文库重组比率为97.9%,具有良好的代表性.该文库的构建为筛选相互作用蛋白并进一步阐明其生理意义提供了基础.
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检测日本血吸虫循环抗原的压电免疫传感器中抗体的纯化与固定
采用饱和硫酸铵沉淀法及凝胶过滤法从感染兔血清(InRS)和免疫兔血清(ImRS)中纯化出IgG抗体,分别经过SDS-PAGE鉴定其纯度及对流免疫试验、免疫双扩散试验鉴定其活性和效价,以便制成一种新型的液相压电免疫传感器,用于检测兔与病人血清中的日本血吸虫循环抗原(SjCAg).初步应用该法检测了不同感染度的兔血清,发现频移值变化在一定范围内与感染度成正比.
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检测日本血吸虫感染者血清中特异性IgG4的诊断价值
为评价日本血吸虫感染者血清中特异性IgG4的诊断和疗效价值,本研究以SEA为抗原,胶体金-抗人IgG4单抗结合物为检测标记物,以金标免疫渗滤法(DIGFA)检测急性和慢性血吸虫病患者治疗前后血清中特异性IgG4抗体.结果显示,急性和慢性血吸虫病病人血清中IgG4阳性率分别为90.9%(30/33)和98.0%(98/100);检测非疫区健康者血清及其他寄生虫(包括肺吸虫、华支睾吸虫、囊虫等)感染者血清共235人份,未有阳性出现(特异性为100%);检测急性血吸虫病病人治疗后6个月和12个月血清,IgG4抗体的阴转率分别为52.0%(13/25)和87.5%(21/24),均明显高于IgG阴转率;检测血吸虫病病人治后6个月血清,慢性病人与急性病人IgG4抗体阴转率无差异.结果表明DIGFA法检测病人血清特异性IgG4诊断血吸虫病敏感性高,与IgG相比有更高的特异性,具有一定的疗效考核价值.
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日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗的免疫保护效果研究
目的:观察已构建日本血吸虫大陆株31kDa组织蛋白酶B DNA疫苗VR1012-Sj31及VR1012-SjGST-Sj31在BALB/c小鼠体内的免疫保护效果.方法:用纯化的空白质粒载体VR1012、重组质粒VR1012-Sj31及VR1012-SjGST-Sj31于股四头肌注射免疫BALB/c鼠:将36只6～8周龄BALB/c鼠随机分为3组,每组12只,对照组(A组)注射空白质粒载体VR1012,B组注射重组质粒VR1012-Sj31,C组注射重组质粒VR1012-SjGST-Sj31.质粒剂量均为100 μg,每隔2周免疫1次,共免疫3次,第3次免疫后第21天,每只鼠经腹部感染10条尾蚴,42天后剖杀计数各小鼠成虫数和每克肝卵数,观察诱导产生的减虫和减卵效果,并用ELISA分析小鼠血清中的抗体.结果:ELISA分析表明,第3次免疫后小鼠出现特异性IgG抗体.与空白质粒对照组比较,2个实验组的减虫率分别为25.0%及30.0%(P<0.05),肝组织减卵率分别为54.90%及69.74%(P<0.001),每雌肝减卵率分别为47.96%、54.62%(P<0.001).与B组相比,C组的肝组织减卵率为32.92%(P<0.001),每雌肝减卵率为12.79%(P<0.05).结论:DNA疫苗VR1012-Sj31和VR1012-SjGST-Sj31能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染保护作用,二价疫苗的保护效果要大于单价疫苗.
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日本血吸虫毛蚴相关蛋白基因SjMP13的克隆表达及免疫学鉴定
利用日本血吸虫感染者唾液免疫筛选日本血吸虫虫卵cDNA文库,对获得的阳性克隆进行序列分析,其中一阳性克隆插入片段包含一个351 bp的开放读码框,其编码116个氨基酸,预测分子量为12.9 kDa,将其命名为SjMP13,该蛋白与血吸虫尾蚴相关蛋白(GenBank序列号:AF448823.1)同源性高达96%.将该序列克隆入原核表达质粒pET32a(+)并转化宿主菌B121/DE3,经IPTG诱导表达后,其重组表达产物经亲和层析纯化,再用Western-blot进行免疫学分析,该序列的原核表达产物能被日本血吸虫感染者唾液以及血清识别,提示该分子具有诊断抗原的开发价值.
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抗日本血吸虫SEA特异性IgY应用于循环抗原检测的研究
本研究应用抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)建立敏感、特异的检测循环抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验( ELISA).用SEA皮下多点注射法免疫海蓝鸡,水稀释法制备IgY抗体,以辣根过氧化物酶标记纯化的IgY抗体(IgY-E)和兔抗IgG抗体(IgG-E)分别作为检测抗体,IgY抗体和兔抗IgG抗体分别作为捕捉抗体,组合建立4种双抗体夹心酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测循环抗原,分析各种方法检测SEA的灵敏度,并平行检测急性日本血吸虫病人血清6份、慢性日本血吸虫病人血清29份、华支睾阳性者血清9份、卫氏并殖吸虫阳性者血清15份、弓形虫阳性病人血清7份、正常体检者血清118份.结果显示,以IgY为捕捉抗体或检测抗体,可检测到浓度为7.5 ng/mL的SEA,灵敏度是基于IgG的夹心ELISA的4倍.4种夹心ELISA法检测急血病人血清阳性率均为100％,检测正常人血清的特异性为99.1％；与弓形虫、华支睾吸虫阳性者血清无交叉反应；而检测慢血病人血清和并殖吸虫阳性者血清时,以IgY为捕捉抗体的2种ELISA( IgY+ IgY-E、IgY+ IgG-E)阳性率均分别为79.3％、6.7％；而IgG为捕捉抗体时,以IgY为检测抗体(IgG+ IgY-E)时的阳性率分别为75.8％、6.7％,以IgG为检测抗体( IgG+ IgG-E)时的阳性率分别为72.4％、13.3％,以IgY作为捕捉抗体的检测效果优于IgG.基于IgY抗体的双抗体夹心ELISA检测循环抗原具有良好的敏感性和特异性,可用于日本血吸虫病的免疫诊断.
关键词： IgY 日本血吸虫 循环抗原 双抗体夹心ELISA -
日本血吸虫抱雌沟蛋白基因表达的性别与时相差异性研究
用Southern blotting,Northern blotting技术对所克隆的日本血吸虫抱雌沟蛋白编码基因SjGcp进行了性别和时期差异表达研究.结果显示日本血吸虫抱雌沟蛋白基因为雄虫特异性表达基因,在感染后第14天即雌雄虫将合抱前可见转录表达.
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高效天然分子疫苗免疫猪血清筛选尾蚴抗原的结果分析
采用日本血吸虫天然分子(Schistosoma japonicum immature egg ws-vaccine,SjiEw)免疫猪血清识别日本血吸虫可溶性尾蚴抗原(Soluble cercariae antigen,SCA),以筛选新的具有保护性免疫潜在价值的抗原分子.按常规方法制备日本血吸虫尾蚴抗原.家猪随机分组并分次免疫日本血吸虫天然分子疫苗,制备SiiEw疫苗免疫猪血清,通过蛋白免疫印迹技术分析其与SCA的免疫反应性.结果显示SDS-PAGE中SCA有16条主带.SjiEw疫苗免疫猪血清共筛选6种具免疫学活性的抗原分子,分子量分别为:50、56、66、68、70、85kDa.这些抗原分子的获得为以后的天然分子编码基因工程疫苗的制备奠定基础.
