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多头带绦虫脑多头蚴cDNA表达文库的构建及初步分析
从甘肃景泰羊源脑多头蚴原头节提取总RNA,以Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,利用Lambda ZAP II XR文库构建试剂盒构建了脑多头蚴cDNA表达文库.从构建的原始文库随机挑选单个噬菌斑进行PCR,确定文库重组率和插入外源基因片段大小,鉴定文库质量.结果表明脑多头蚴cDNA表达文库的原始库容量为1.0×106 pfu,扩增后文库滴度为1.6×109 pfu/mL.随机挑选的165个噬菌斑克隆中,0.25 kb以上的克隆155个,重组率为93.9%,对其中0.5 kb以上的115个克隆测序共获得104个表达序列标签(EST),分析后得到96个单一EST序列(Unique EST),其中20个EST与绦虫基因有同源性,38个EST与吸虫基因有同源性,4个EST与线虫基因有同源性,17个EST与其他物种有同源性,其余17个EST没有同源基因.这些EST编码的氨基酸序列有多头带绦虫六钩蚴Tm16抗原、猪带绦虫副肌球蛋白、猪带绦虫免疫原蛋白Ts76等绦虫抗原的同源蛋白以及烯醇化酶等一些酶类、热休克蛋白、肌动蛋白、核糖体蛋白等同源蛋白.
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血红蛋白A2单克隆抗体的制备与鉴定
本研究目的是制备鼠抗人血红蛋白A2(HBA2)单克隆抗体(McAb)并进行初步鉴定.将正常人胎肝组织匀浆离心并分离出人胎肝核总蛋白,用人胎肝核总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,并通过间接ELISA法、Western blot及免疫组织化学的方法对单克隆抗体进行特异性鉴定,通过免疫沉淀和Uni-ZAP XR表达文库筛选鉴定抗原.结果表明:通过间接ELISA筛选获得分泌AEE091抗体的杂交瘤细胞1株,其分泌的单克隆抗体Ig亚类(型)为IgG1(κ);Western blot结果显示,该抗体识别分子量为15 kD的蛋白;Western blot识别AEE091免疫沉淀获得的分子量为15 kD的抗原;同时应用单克隆抗体AEE091对人肝脏cDNA表达文库(Uni-ZAP XR)进行筛选,筛选所获得的阳性噬菌斑测序结果显示两个阳性克隆插入序列均为HBA2.结论:经筛选获得了分泌AEE091抗体的杂交瘤细胞株.AEE091抗体能特异识别HBA2抗原,因而其在HBA2的功能研究和珠蛋白生成障碍性贫血筛查等方面具有应用价值.
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抗尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2单克隆抗体的制备与鉴定
本研究制备抗人尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2(UDP-glucose pyrophosphorylase 2)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定.将正常成人肝组织匀浆离心并分离肝脏胞浆总蛋白,用肝脏胞浆总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,通过间接ELISA法、Western blot及免疫组织化学的方法对单克隆抗体进行特性鉴定,通过Uni-ZAP XR肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗体特异性.结果表明:通过间接ELISA筛选获得1株可稳定分泌抗人UGP2 mAb的杂交瘤细胞系BAD062,其分泌的单克隆抗体的Ig亚类(型)为IgG2b(κ),Western blot结果显示该抗体可以特异地识别分子量为56 kD的蛋白;应用单克隆抗体BAD062对人肝脏cDNA表达文库(Uni-ZAP XR)进行筛选,阳性噬茵斑测序结果显示2个阳性克隆插入序列均为UGP2.结论:单克隆抗体BAD062特异地识别抗原UGP2,该抗体可用于ELISA检测、Western blot、免疫组织化学实验,为UGP2的研究提供了有力的工具.
关键词： 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2 单克隆抗体 cDNA表达文库 -
人髓性白血病细胞系U937定向克隆cDNA表达文库的构建及其意义
本研究的目的是构建髓性白血病U937细胞系表达型cDNA文库,为肿瘤抗原的筛选奠定工作基础.提取U937细胞总RNA,分离mRNA,反转录合成双链cDNA,消平cDNA末端,连接EcoRⅠ适配子,磷酸化EcoR Ⅰ适配子5′端;XhoⅠ酶切后,丙烯葡聚糖凝胶-S400柱除去小于400 bp cDNA片段,与λZAP表达载体连接,包装蛋白包装后建成cDNA文库;取出1 μl倍比稀释感染大肠杆菌XL1-Blue-MRF′,测定文库大小、重组率;随机挑取10个噬斑,在ExAssist辅助性噬菌体的作用下,释放出PBK-CMV噬菌粒;感染大肠杆菌XLOLR,铺于卡那霉素抗性的LB平板;挑取克隆,37℃震摇过夜;抽提质粒,经EcoR I和Xho I酶切后,初步确定片段的大小及多样性. 结果:构建成含2.87×106重组子的U937细胞cDNA文库,重组子平均插入外源片段长约1.7 kb. 结论:所建文库合格,适合用于筛选目的cDNA克隆.
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从睾丸cDNA表达文库筛选胰腺癌肿瘤抗原
目的 利用胰腺癌患者血清筛选睾丸cDNA噬菌体表达文库,寻找胰腺癌特异性抗原,尤其是肿瘤-睾丸抗原.方法 采用血清学筛选重组cDNA表达文库(SEREX)技术筛选睾丸cDNA噬菌体表达文库.对获得的阳性克隆片段进行测序、鉴定和同源性比较.检测40例胰腺导管腺癌患者和40名健康对照血清中抗阳性克隆的抗体.结果 筛选共获得107个阳性克隆,代表14个不同抗原基因,其中有13个基因与基因库中已知基因有很高的同源性,这些基因为activin受体AⅡ、LOC92912、KLHL12、IFI16和CAGE等.另有1个阳性克隆HS1在基因库和SEREX数据库中均未发现有同源基因.胰腺癌患者组HS1和HS2克隆抗体阳性率显著高于健康对照组(分别15%与0%比较,x2=4.50,P＜0.05;22.5%与5%比较,X2=5.16,P＜0.05).结论 HS1可能是1个新的肿瘤-睾丸抗原基因.有必要进一步研究这些阳性克隆的生物学功能和临床价值.
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从大肠癌组织cDNA表达文库筛选肿瘤抗原基因
目的利用肿瘤患者血清筛选大肠癌cDNA噬菌体表达文库,寻找肿瘤特异性抗原基因.方法采用SMART技术构建中国人大肠癌cDNA噬菌体表达文库.用SEREX方法筛选中国人大肠癌组织cDNA噬菌体表达文库.对获得的阳性克隆片段进行测序、鉴定和BLAST同源性比较,并对其生物信息进行分析.结果成功地构建了大肠癌cDNA噬菌体表达文库,原始文库含2.39×106个重组子,重组率达到97.5%,文库扩增后滴度达到4.1×1010pfu/ml.插入外源性cDNA片段的大小为0.5～4.0kb.SEREX筛选共获得16个阳性克隆,代表12个不同抗原基因,其中10个基因片段为已知抗原基因,如IFITM1、CD24、Survivin、KLK6等,2个为未知 EST片段.根据序列分析,筛选出的抗原基因有结构基因、调节基因、代谢相关基因等.结论利用SEREX方法筛选出大肠肿瘤相关抗原基因并获得2个肿瘤抗原候选基因.
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赤（鱼,工）尾刺cDNA表达文库的构建
目的以赤（鱼,工）尾刺为出发材料,构建以真核表达载体pcDNA 3.0为基础的赤尾刺cDNA表达文库.方法应用SMARTTM cDNA Library Construction技术和初步生物信息学分析等方法.结果通过对亚文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,已获得了56个赤新EST序列,其中已确定的全长cDNA克隆有24个,包括IPL肿瘤抑制因子、亲环素cyclophilin A、硒蛋白selenop rotein W、半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin A、tyrosyl-tRNA synthetase和calcineurin 类似物蛋白等.结论这些基因在赤中绝大多数均为首次发现.赤尾刺cDNA表达文库的成功构建,将有利于对赤尾刺中药应用的分子作用机理的深入研究.
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人膀胱癌BLZ211细胞cDNA文库的构建分析
目的:构建人膀胱癌BLZ211细胞表达型cDNA文库,为肿瘤抗原的筛选奠定工作基础.方法:提取BLZ211细胞总RNA,分离mRNA.反转录合成双链cDNA,削平cDNA末端,连接EcoRI适配子,磷酸化EcoRl适配子5'端,XhoI酶切,Sephaeryl-S400柱除去小于400bp cDNA片段,与λZAP表达栽体连接,包装蛋白包装后建成eDNA文库;取出1μl倍比稀释感染大肠杆菌XL1-Blue-MRF',测定文库大小、重组率;随机挑取7个噬斑,在ExAssist辅助性噬茼体的作用下,释放出PBK-CMV噬菌粒;感染大肠杆菌XLOLR,铺于卡那霉素抗性的JB平板;挑取克隆,37℃震摇过夜;抽提质粒,经EcoRI和XhoI酶切后,初步确定片段的大小及多样性.结果:构建成含1.39×106重组子的BLZ211细胞cDNA文库,重组子平均插入外源片段长约1.3kb.结论:所建文库合格,适合用于筛选目的cDNA克隆.
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法国梧桐花粉变应原cDNA表达文库的构建和初步鉴定
目的 构建法国梧桐花粉变应原cDNA表达文库并初步鉴定. 方法 利用Trizol法抽提法国梧桐花粉总RNA,经过Oligo(dT)纤维素柱纯化后分离mRNA,反转录合成ds cDNA,连接EcoR Ⅰ接头,末端磷酸化,Xho Ⅰ消化,电泳分离并凝胶回收大于500 bp以上的cDNA片段,与Uni-ZAP XR Vector连接,经过体外包装,感染宿主菌,构建cDNA文库,检测文库容量和重组率,并采用PCR方法对插入的cDNA片段大小进行分析. 结果 成功构建了一个文库容量为3.5×106 pfu/ml,重组率为94％,平均插入片段长度约为0.7 kb的法国梧桐花粉变应原cDNA表达文库. 结论 所建文库容量及插入片段大小合适,适用于筛选目的cDNA,为进一步研究法国梧桐花粉主要变应原基因并制备重组标准化法国梧桐花粉主要变应原疫苗奠定基础.
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从卵巢癌cDNA文库中筛选新的肿瘤标志物
采用SEREX法筛选了自行构建的中国人卵巢癌cDNA表达文库,得到27个阳性克隆,其中3个为全长cDNA.序列分析和同源性比对结果表明所获得的27个克隆分属于分化抗原、细胞结构蛋白及功能未知三类.选择其中一个全长cDNAMY-OVA-13(该基因编码的蛋白是MAD2),利用基因工程方法克隆、表达和纯化得到目的蛋白,采用点杂交方法检测了MY-OVA-13目的蛋白与正常人和肿瘤患者中的血清学反应.MY-OVA-13抗体只在肿瘤组中检测到(5/74),在正常组中均为阴性;间接ELISA测定结果显示,MY-OVA-13抗体的水平在肿瘤组中均高于正常组,其中肝癌和前列腺癌组与正常组相比,在统计学上有显著差异,P值分别＜0.01和＜0.05.我们的初步结果表明MY-OVA-13及其抗体具有一定的肿瘤特异性,有可能作为肿瘤诊断的标志物.
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长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库的构建及免疫学筛选
目的 构建长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库,筛选长角血蜱功能性抗原基因.方法 在无BNA酶污染的条件下提取长角血蜱总RNA,进而纯化mRNA,以寡脱氧胸腺核苷酸[oligo(dT)]为引物合成双链cDNA,并在其两端加EcoR Ⅰ/HindⅢ定向接头.将cDNA分子定向克隆至具有EcoR Ⅰ/HindⅢ黏性末端的λSCREEN载体.用噬菌体包装蛋白对以上连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,转化大肠埃希菌(Escherichia coli)ER1647,从而构建长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库.使用兔抗长角血蜱全蜱血清对该文库进行免疫学筛选,经过2次筛选得到的阳性噬菌体转化E coli BM25.8亚克隆为重组质粒,转化E coli JM109,提取重组质粒进行PCR和测序分析. 结果 长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库的基础库容量为1.8×106pfu.重组率为100%,扩增后的滴度为2.4×109pfu/ml.筛选获得42个阳性克隆,序列分析表明有12个新cDNA序列,其编码蛋白与长角血蜱原肌凝蛋白、环状扇头蜱幼蜱未知蛋白、黑腹果蝇染色体2R、褐黄血蜱线粒体DNA、青海血蜱HqL09、Hq05和肌球蛋白轻链mRNA等具有同源性.结论 构建了长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库,获得的阳性克隆为长角血蜱功能性抗原的研究奠定基础.
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猪囊尾蚴cDNA表达文库构建及抗原基因筛选
采用Quick Prep mRNA Purification试剂盒提取猪囊尾蚴mRNA; Time-Saver cDNA Synthesis试剂盒反转录合成双链cDNA,并在末端加上EcoRI/NotI adapto r,修饰后的cDNA与λgtll EcoRI臂连接,体外包装为λ噬菌体颗粒;感染E.coliY1090构建成功库容量为2×106、重组率为80%的cDNA表达文库.利用兔抗猪囊尾蚴虫体抗原和囊液抗原血清分别对一部分文库进行免疫印迹筛选,分别获得8个阳性克隆 .提取阳性克隆DNA,利用PCR法从重组噬菌体DNA中扩增出cDNA片段,长度自40 0-900bp.本文工作为研制猪囊尾蚴核酸疫苗打下了基础.
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伪旋毛虫肌幼虫cDNA表达文库的构建及筛选
目的 获取伪旋毛虫(Trichinella pseudospiralis)肌幼虫时期抗原性基因.方法 利用λZAP载体构建伪旋毛虫肌幼虫cDNA表达文库;以感染伪旋毛虫60天后的猪血清为抗体探针,对伪旋毛虫肌幼虫cDNA文库进行免疫学筛选,对筛选出的强反应原性克隆进行测序,利用相关分子生物学软件进行序列分析.结果 构建的伪旋毛虫cDNA表达文库的库容量为0.55×106pfu,重组率为95.6%,扩增后文库滴度为1.2×1010 pfu/mL.从2.0×105个重组噬菌体筛选获得阳性克隆27个.序列分析结果表明这27个阳性克隆共编码7种cDNA分子,其编码的类似蛋白分别为伪旋毛虫Tp21kDa蛋白、伪旋毛虫Tp28kDa蛋白、蛋白酶体激活因子亚单位(Proteasome activator subunit)类蛋白、Nudix水解酶(Nudix hydrolyase)类蛋白、凝集因子(Condensin)类蛋白、尿嘧啶糖基化酶(uracil glycosylase)类蛋白和一个未知蛋白.结论 获得两个反应原性较强且高拷贝的抗原基因,其分别编码Tp21kDa蛋白及蛋白酶体激活因子亚单位.
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疟疾传播媒介斑须按蚊唾液腺cDNA表达基因库的构建及抗原基因的筛选
目的为寻找编码按蚊唾液腺分泌性蛋白质的基因. 方法应用RNeasy试剂盒提取斑须按蚊唾液腺总RNA;OrientExpressTM Oligo(d T)cDNA Library Construction 系统反转录合成双链cDNA,修饰后加上EcoRⅠ/Hi ndⅢ linker,经酶切、大小分馏后,与λSCREEN-1 臂相连,体外包装为λ噬菌体颗粒,构建成cDNA表达文库;在感染大肠杆菌ER1647后,检测cDNA表达文库的大小;应用兔抗唾液腺蛋白血清对部分文库进行免疫筛选,并将含cDNA片段的阳性λSCREEN克隆株转化成 pSCREEN质粒,经EcoRⅠ/HindⅢ消化后,分析cDNA片段.结果 cDNA表达文库容量为4×106/pfu.应用抗唾液腺蛋白血清筛选,获得3个阳性克隆株,酶切后cDNA片段的长度约为500pb.结论已筛选到与抗唾液腺蛋白的免疫血清反应的阳性克隆株,而且获得编码唾液腺蛋白抗原的基因片段,并将其转入pSCREE N质粒中,为进一步研究蚊唾液腺内编码分泌性蛋白质基因的作用奠定了基础.
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淡色库蚊对溴氰菊酯抗药性品系cDNA表达文库的构建和初步鉴定
目的构建淡色库蚊对溴氰菊酯抗药性品系cDNA表达文库.方法应用定向克隆技术将相应cDNA片段插入λExCell/NotⅠ/EcoRⅠ/CIP载体的NotⅠ和EcoRⅠ双酶切位点;并用PCR对插入片段大小进行分析.结果获得含4.72×105个重组子的cDNA表达文库,重组率为100%,插入片段大小平均约1.1kb.结论所建文库容量及插入片段大小适合进一步研究.
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采用SEREX方法从cDNA表达文库中筛选大肠癌抗原基因
目的 寻找人源性大肠癌特异性抗原基因.方法 采用SMART技术构建人大肠癌组织来源的eDNA噬菌体表达文库,以自体或异体大肠癌患者血清按SEREX方法进行免疫筛选,对平板法扩增获得的阳性克隆片段导人克隆载体PUCm-T后进行测序、鉴定和BLAST同源性比较,并根据cDNA序列进行生物信息分析.结果 构建了3个大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库,其滴度分别为2.39×106 pfu/mL、2.07 × 106 pfu/mL和1.86×106 pfu/mL,插入片段长度为0.5～4 kb,平均分别为1.4、1.6和1.3 kb,重组率高达到97.5%.选择高滴度文库扩增后滴度达到4.1×1010 pfu/mL.SEREX筛选共获得16个阳性克隆,代表12个不同抗原基因,其中10个基因片段为已知抗原基因,如IFITM1、CD24、Survivin、KLK6等,2个为未知EST片段.根据序列分析,筛选出的抗原基因有结构基因、调节基因、代谢相关基因等.结论 利用SEREX方法筛选出大肠肿瘤相关抗原基因并获得2个肿瘤抗原候选基因.
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结肠癌肿瘤自身抗体谱筛选及其应用
目的 本研究拟寻找鉴定结肠癌自身抗体谱,研究这些自身抗体作为结肠癌诊断候选血清标志物的可能性,同时鉴定这些自身抗体的抗原为研究结肠癌发生、发展相关的基因提供线索.方法 用结肠癌组织建立了库容量达5×105 pfu的cDNA表达文库,用结肠癌患者血清进行了文库血清学分析(SEREX),筛选获得了阳性抗原克隆,进一步分析了其中4个克隆与30例结肠癌和30例正常人血清的反应情况.结果 获得的33个阳性克隆中,31个剪切成功,2个克隆与已知EST序列明显无同源性,另外29个克隆与已知基因高度同源.Uracil-DNA glycosylase等4个抗原克隆与结肠癌患者和正常人血清反应阳性率分别为76%(23%)、80%(6%)、77%(0)、73%(66%).结论 本研究发现的29个结肠癌抗原可能参与了结肠癌的发生发展,可能作为结肠癌的治疗潜在分子靶点和结肠癌诊断新的候选血清学标志物.Uracil-DNA glycosylase等3个克隆与结肠癌患者血清的反应阳性率明显高于正常人的血清,其相关自身抗体可作为结肠癌诊断的血清标志物.
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华支睾吸虫囊蚴cDNA表达文库的构建及鉴定
目的构建华支睾吸虫囊蚴cDNA表达文库,为筛选特异诊断抗原和疫苗候选抗原奠定基础.方法提取华支睾吸虫囊蚴总RNA;用Clontech公司SMARTTM cDNA文库构建试剂盒并按其操作方法进行,进行反转录合成双链cDNA.PCR产物经蛋白酶K消化、纯化后,进行SfiⅠ酶切;用ChromaSpin 400柱将酶切产物进行分级分离,经1.1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收0.4～4kb的组分,并与λTriplEx2载体连接;连接产物经体外蛋白包装,产生未扩增文库;检测未扩增文库滴度和重组效率后,进行文库的扩增,并测定扩增文库的滴度;随机挑取9个噬菌斑,用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增,以检测所构建的cDNA文库的质量.结果未扩增文库滴度达7.0×107pfu/ml,扩增文库滴度达2.5×108pfu/ml;用载体两端的引物进行PCR鉴定,结果显示:扩增文库中,含1kb以上的占30%左右,1kb～500bp占69%.结论已成功地获得一高质量的华支睾吸虫囊蚴cDNA表达文库.
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用长距PCR法构建恶性疟原虫cDNA表达文库
目的构建恶性疟原虫cDNA表达文库.方法 用Trizol试剂盒提取总RNA,以经修饰的SMART寡聚核苷酸引物-CDSⅢ引物直接用总R NA选择性地反转录成单链cDNA,再用长距PCR(LD)方法选择性地扩增出双链cDNA,经蛋白酶K 消化和酶切后,用玻璃奶试剂盒回收200bp以上DNA片断,经与载体λTriplEX2连接和蛋白抽提物体外包装后,构建成cDNA文库并对文库进行了初步的鉴定.结果构建了高滴度,高重组率的恶性疟原虫cDNA表达文库.结论所构建的疟原虫cDNA文库适合进一步筛选抗疟原虫药物结合蛋白基因.
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SEREX技术筛选及鉴定食管癌肿瘤抗原
背景与目的:正常细胞向癌细胞转化过程中,突变的基因或各种异常表达的蛋白可以成为肿瘤抗原诱导机体的免疫反应,因此肿瘤患者的血清中存在着与肿瘤相关的自身抗体.重组cDNA表达文库血清学分析法(serological analysis of recombinant cDNA expression libraries,SEREX)是利用肿瘤患者血清中的自身抗体筛选、鉴定肿瘤抗原的技术.本研究拟采用SEREX的方法寻找食管癌自身抗体的相关肿瘤抗原,鉴定与食管癌发生、发展相关的基因和免疫治疗分子靶点,并为食管癌的诊断提供候选血清标志物.方法:用食管癌组织建立库容量达1.6×106 pfu的cDNA表达文库,SEREX筛选获得21个不同cDNA序列的阳性克隆,进一步使用SADA法分析其中4个抗原在10例食管癌及10例正常人血清中的反应.结果:在Homosapiens desmin(DES)等21个阳性克隆中,4个克隆与已知EST序列明显无同源性,另外17个克隆与已知基因高度同源.Ribosomal protein S4等4个抗原与食管癌患者和正常人血清反应阳性率分别为40%和0%、60%和10%、70%和20%、30%和20%.结论:Ribosomal protein S4等4个抗原普遍参与了食管癌患者的体液免疫反应,与食管癌患者血清的反应阳性率明显高于正常人的血清.本研究发现的21个食管癌抗原可作为食管癌治疗的潜在分子靶点和食管癌诊断新的候选血清学标志物.
