首页 > 文献资料
-
甲氨蝶呤对单核细胞样细胞系U937的生长影响及其促凋亡作用
一般认为急性髓细胞白血病(AML)是对甲氨蝶呤(MTX)原发耐药的恶性肿瘤.AML细胞除急性单核细胞白血病(AML-M5)细胞与MTX孵育时,由于不能象急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞一样形成足够量的长链聚谷氨酸盐甲氨蝶呤(MTXPG),而被认为对MTX不敏感.为了开发对AML-M5新的治疗,本实验采用了具有单核细胞特征的U937细胞系进行研究.细胞分别通过不同浓度(1 nmol/L-100μmol/L)MTX孵育24小时或48小时后,通过XTT法评估细胞生长抑制情况.24小时的半数抑制浓度(IC50)为0.04μmol/L;48小时的IC50为0.037μmol/L,90%细胞抑制浓度(IC90)为0.39μml/L.为了解MTX细胞毒作用的发生机制,进一步分析了细胞的死亡过程.采用了系列实验,包括台盼蓝拒染法、流式细胞术、显微镜(瑞氏染色法)及DNA片段分析进行研究.结果在MTX作用后短时间内(4或6小时)无明显的细胞凋亡特征出现.随5 nmol/L-10μmol/L MTX作用8小时后,亚G1(凋亡)峰的比率从0.1μmol/L的3.2%增加到5.0μmol/L的18.2%,S期的比率从0.01 μmol/L的41.2%到10 μmol/L的19.1%.可见到DNA片段电泳后细胞凋亡的特征性改变.MTX所引发U937细胞的生长阻滞和凋亡特征,提示它可用于AMLM5治疗的潜在可能.
-
人髓性白血病细胞系U937定向克隆cDNA表达文库的构建及其意义
本研究的目的是构建髓性白血病U937细胞系表达型cDNA文库,为肿瘤抗原的筛选奠定工作基础.提取U937细胞总RNA,分离mRNA,反转录合成双链cDNA,消平cDNA末端,连接EcoRⅠ适配子,磷酸化EcoR Ⅰ适配子5′端;XhoⅠ酶切后,丙烯葡聚糖凝胶-S400柱除去小于400 bp cDNA片段,与λZAP表达载体连接,包装蛋白包装后建成cDNA文库;取出1 μl倍比稀释感染大肠杆菌XL1-Blue-MRF′,测定文库大小、重组率;随机挑取10个噬斑,在ExAssist辅助性噬菌体的作用下,释放出PBK-CMV噬菌粒;感染大肠杆菌XLOLR,铺于卡那霉素抗性的LB平板;挑取克隆,37℃震摇过夜;抽提质粒,经EcoR I和Xho I酶切后,初步确定片段的大小及多样性. 结果:构建成含2.87×106重组子的U937细胞cDNA文库,重组子平均插入外源片段长约1.7 kb. 结论:所建文库合格,适合用于筛选目的cDNA克隆.
-
EKI-785对U937细胞系的生长调节作用
目的 探讨erbB家族受体在急性单核细胞白血病细胞系U937中的表达及其对细胞生长的影响.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测erbB家族成员在U937细胞中的表达情况, Western blot检测erbB2在蛋白水平的表达.以erbB受体抑制剂EKI-785处理细胞后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验并绘制细胞生长曲线,观察细胞的生长变化情况;应用AnnexinV/PI双染和流式细胞仪计数,观察细胞是否发生凋亡;Western blot检测细胞增殖生长信号的变化.结果 在U937细胞中,除了erbB1外,其他erbB受体均有表达,且erbB2有蛋白水平的表达.经过1、2、4和8 μmol/L EKI-785处理48 h后,U937细胞的生长受到不同程度的抑制,抑制率分别为(10.49±3.69)%、(13.79±2.13)%、(31.42±3.90)%和(44.05±1.56)%,并呈现出比较明显的浓度依赖关系.EKI-785诱导U937细胞发生了早期凋亡,4 μmol/L EKI-785处理U937细胞48和72 h,Annexin-V+/PI-标记的早期凋亡细胞所占的比例分别为相应对照组的2.03倍和6.64倍.经4 μmol/L EKI-785作用24、48、72 h后,磷酸化的MEK和Akt蛋白水平随着时间延长不断下降,72 h时磷酸化的MEK和Akt几乎消失.结论 erbB家族受体很可能在某些类型的白血病发生中发挥重要作用,有望成为这些白血病的新治疗靶点,EKI-785具有治疗白血病的应用前景.
-
血清药漏芦对ox-LDL诱导U937细胞形成泡沫细胞过程中PPARγ表达的影响
目的观察血清药漏芦对ox-LDL诱导U937细胞形成泡沫细胞过程中PPARγ表达的影响.方法用ox-LDL与U937细胞孵育造成泡沫细胞模型,采用免疫组织化学染色方法观察PPARγ的表达情况.结果光镜下,正常对照组细胞内无明显棕染颗粒,模型组棕色颗粒粗大,见于胞膜和胞浆中;用药组棕色颗粒色浅,且数量明显少于模型组.结论血清药漏芦能抑制ox-LDL诱导U937细胞形成泡沫细胞过程中PPARγ的表达.
-
应用U937细胞泡沫化模型检测人血高密度脂蛋白生物学功能
目的准确检测人血高密度脂蛋白(HDL)的生物学功能.方法采用U937细胞泡沫化模型,检测HDL逆向转运细胞内胆固醇(Ch)的生理功能.用Brad Ford方法检测蛋白质(Pro)含量,Ch试剂盒检测细胞内Ch含量,并比较不同剂量HDL转移出细胞内Ch的量.结果在一定的HDL浓度范围内相关性好(r≥0.98),重复性高(CV=6.1%),回收率为91.8%～110.5%.结论该方法能更直观地反映HDL转运胆固醇的功能.且具有使用人源细胞、操作简便和易于推广应用的特点.
-
对黄芪调节革兰阳性菌脓毒症炎症反应部分机制的探讨
目的 观察脂磷壁酸(LTA)对单核细胞系(U937)刺激后中药黄芪对其所表达的炎性因子的影响,探讨其调节革兰阳性菌脓毒症炎症反应的部分机制.方法 体外培养U937细胞,选取不同浓度LTA进行孵育,在不同时间点进行相关测定.MTT法检测细胞的增殖活性,酶联免疫吸附测定法(ELISA法)检测上清液中促炎因子IL-8及抗炎因子IL-10的表达,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞核内IL-8 mRNA及IL-10 mRNA的表达.结果 LTA(3 ～ 30 mg/mL)刺激U937细胞32 h内,细胞增殖活性无明显变化(P＞0.05);而以LTA60 mg/mL组及3～30 mg/mL LTA刺激40 h时,细胞增殖活性明显降低(P＜0.05).ELISA结果显示,LTA能明显上调U937表达促炎因子IL-8及抗炎因子IL-10,且其表达与LTA浓度及时间呈正相关,其中LTA 30 mg/mL在8～32 h时IL-8及IL-10表达有统计学意义(P＜0.05),且以16 h时IL-8的释放量为高峰,以24h时IL-10的释放量为高峰.黄芪可减低LTA刺激U937表达促炎因子IL-8含量,促进LTA刺激U937表达抗炎因子IL-10的释放量,且黄芪0.2 mg/mL组在16 h、24 h及32 h时与LTA30组比较差异有统计学意义(P＜0.05),IL-10的释放高峰提前至16 h.RT-PCR结果显示,LTA组和LTA+黄芪组IL-8 mRNA、IL-10 mRNA表达及变化趋势与IL-8和IL-10一致.结论 中药黄芪在革兰阳性菌脓毒症炎症反应中从细胞水平可抑制促炎因子基因及蛋白的表达,同时可促进细胞水平抗炎因子基因及蛋白的表达,并可使抗炎因子的释放高峰提前.
-
构建shRNA慢病毒载体抑制U937细胞株VEGFR-1基因的表达
目的 构建针对血管内皮生长因子受体1(vascular endothelial growth factor receptor 1,VEGFR-1)基因的siRNA前体表达栽体,鉴定其对U937细胞株VEGFR-1基因干扰效率.方法 体外设计并合成针对VEGFR-1基因的慢病毒shRNA干扰栽体,通过PCR及测序证实栽体构建成功.将慢病毒颗粒以适滴度转染人单核白血病细胞株U937,应用Real-Time PCR、Western印迹法检测抑制效率.结果 构建的慢病毒裁体的序列通过PCR、测序等鉴定,与设计序列相同.Real-Time PCR检测显示U937细胞干扰组VEGFR-1 mRNA表达率下降75.98%,Western印迹法显示U937细胞干扰组VEGFR-1蛋白表达量较空白裁体对照组明显减少.结论 构建的shRNA表达栽体可在mRNA和蛋白水平上有效抑制U937细胞株VEGFR-1基因的表达.
关键词： 血管内皮生长因子受体1 RNA干扰 慢病毒 U937细胞系 -
青蒿琥酯诱导U937细胞凋亡的研究
目的:研究青蒿琥酯体外诱导U937细胞凋亡及其过程中细胞内游离钙的变化.方法:采用光镜、透射电镜技术、DNA片段化电泳、流式细胞术对青蒿琥酯诱导U937细胞凋亡进行了观察,并应用激光共聚焦显微镜技术检测凋亡过程中细胞内游离钙浓度的变化.结果:6.250 mg/L的青蒿琥酯可诱导U937细胞凋亡,作用于细胞后30 min,Ca2+浓度即明显升高,1 h达高峰,48 h仍维持在较高水平.结论:青蒿琥酯可诱导U937细胞凋亡,细胞胞质内Ca2+是青蒿琥酯诱导U937细胞凋亡信号传导过程中重要的信号分子.
-
Bcl-2表达受抑可增加单核白血病细胞系对TNFα的敏感性
目的 探讨Bcl-2反义基因在单核白血病细胞系U937细胞中的作用,以期丰富Bcl-2及其反义核酸调控肿瘤细胞凋亡的资料.方法 将反义Bcl-2基因转染于U937细胞,建立U937/as-bcl2细胞模型,经流式细胞技术检测模型细胞Bcl-2的的表达水平,通过细胞计数观察模型细胞在正常培养条件下和有重组人肿瘤坏死因子α(rhTNFα)存在时的生长和存活特性变化.结果 ① U937/as-bcl2模型细胞的Bcl-2蛋白表达水平明显下降,但其在正常培养条件下的生长和存活能力无明显变化.②在rhTNFα的作用下,模型细胞的存活率较对照细胞者明显下降.结论 ①单独反义bcl-2基因转染可明显抑制U937细胞Bcl-2的表达,但对细胞在正常培养条件下的生长和存活能力无明显影响.②反义Bcl-2基因转染可增加U937细胞对TNFα的敏感性.
-
人单核巨噬细胞泡沫化抑制剂筛选模型的建立及应用
目的: 建立人单核巨噬细胞泡沫化抑制剂筛选模型,筛选得到可抑制细胞泡沫化的抑制剂.方法: U937单核细胞经100 nmol·L-1佛波酯(PMA)诱导72 h分化为巨噬细胞后,换无血清培养液于96孔板中,每毫升含巨噬细胞1×106个,每孔再加入80 mg·L-1氧化的低密度脂蛋白(ox-LDL),37 ℃培养48 h,建立单核巨噬细胞泡沫化模型.利用微生物发酵液,或单一的化合物样品与其共孵育,油红.染色后观察细胞胞内变化,寻找对泡沫细胞形成有抑制作用的样品.利用基因工程技术表达的人清道夫受体A类II型的胞外部分,在本模型中可抑制巨噬细胞泡沫化的形成,进一步验证了模型的可行性.结果: 从2000 个微生物发酵液中筛选到6株微生物发酵液为阳性,从10个化合物中发现一个有抑制巨噬细胞泡沫化活性的新化合物.结论: 本模型可用于细胞泡沫化抑制剂的高通量筛选.
-
L929细胞条件培养液减轻氧化应激引起的U937细胞DNA断裂损伤
目的揭示巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的抗动脉粥样硬化作用是否与其保护单核细胞免受过氧化损伤有关.材料与方法用富含M-CSF的L929细胞条件培养液(L929-CM)作为M-CSF来源,以凝胶电泳、DNA断裂定量等方法观察了M-CSF对叔丁基氢过氧化物(tbOOH)诱导的U937细胞DNA断裂损伤的影响.结果 tbOOH可以引起U937细胞的DNA断裂损伤,且损伤随tbOOH作用时间的延长而趋明显;而L929-CM可以减轻tbOOH诱发的U937细胞DNA断裂损伤.结论 M-CSF对单核细胞具有一定的保护作用,可减轻其氧化损伤.
关键词： 巨噬细胞集落刺激因子 氧化应激 动脉粥样硬化 U937细胞系 凋亡 -
和厚朴酚对人白血病细胞系U937细胞增殖和凋亡的影响
[目的] 探讨和厚朴酚(HNK)对白血病细胞系U937细胞增殖和凋亡的影响.[方法] 将U937细胞和正常外周血单核细胞分别与HNK共培养,Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡形态,用噻唑蓝比色法(MTT)检测HNK对细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测凋亡;罗丹明123检测线粒体膜电位;Caspase3/7活性检测试剂盒检测Caspase3/7活性;荧光定量PCR(FQ-PCR)检测Caspase-3、Caspase-7 mRNA水平变化.[结果] HNK对U937的体外增殖有显著抑制作用,48 h半数抑制浓度(IC50)为11.8 μg/mL,而对正常外周血单核细胞的IC50为40.3 μg/mL,Annexin V/PI双标染色显示,细胞凋亡与和厚朴酚呈浓度和时间依赖相关.HNK明显降低U937细胞线粒体膜电位,增加Caspase3/7活性及mRNA表达水平,但对正常外周血单核细胞的增殖抑制和凋亡作用不明显.[结论] HNK可能通过激活caspase-3/7抑制U937细胞增殖、诱导U937细胞凋亡.
关键词： 和厚朴酚 U937细胞系 膜电位 线粒体 Caspase3/7 -
和厚朴酚抑制白血病U937细胞侵袭及血管新生作用
目的 探讨和厚朴酚(HNK)对人白血病U937细胞侵袭及血管新生作用的影响及其可能的分子机制.方法 应用不同浓度的HNK处理U937细胞不同时间,用MTT法检测HNK对细胞增殖抑制作用;基质黏附试验检测HNK对U937细胞黏附功能的影响;TranswellTM小室检测HNK对U937细胞侵袭抑制作用.实时定量PCR (qRT-PCR)检测血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)、基质金属蛋白酶9(MMP-9) mRNA水平变化.ELISA检测HNK处理U937细胞后上清VEGF蛋白表达水平.结果 HNK对U937的体外增殖有显著抑制作用,呈剂量和时间依赖性.低浓度HNK能够抑制U937细胞的黏附及侵袭能力.不同浓度HNK处理U937细胞24h后,细胞VEGF、VEGFR1及MMP-9表达水平呈剂量依赖性下调.结论 HNK可能通过抑制VEGF、VEGFR1及MMP-9表达,抑制U937细胞侵袭及血管新生功能.
