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小鼠实验感染不同种旋毛虫后血清IgG抗体水平的变化
目的 观察小鼠感染不同种旋毛虫后血清IgG抗体水平的变化. 方法 将50只小鼠随机分成5组(每组10只),分别感染旋毛虫(T1)、乡土旋毛虫(T2)、布氏旋毛虫(T3)、伪旋毛虫(T4)及纳氏旋毛虫(T7),每只感染300条幼虫,感染后1～6周每周尾部静脉采血,6周后每2周尾部静脉采血,至感染后20周,用旋毛虫肌幼虫ES抗原ELISA检测血清中抗旋毛虫IgG抗体水平. 结果 小鼠感染旋毛虫、乡土旋毛虫、布氏旋毛虫及纳氏旋毛虫后3～5周,血清IgG抗体水平快速升高,至感染后第8周达高峰,此后旋毛虫和乡土旋毛虫感染小鼠的血清IgG抗体水平缓慢下降,布氏旋毛虫及纳氏旋毛虫感染小鼠的血清IgG抗体水平迅速下降;小鼠感染伪旋毛虫后3～5周血清IgG抗体水平快速升高,至第16周达高峰,之后缓慢下降.5种旋毛虫感染小鼠的血清IgG抗体水平差异具有显著性(P＜0.05). 结论 5种旋毛虫感染小鼠的血清IgG抗体水平和动态变化不同;旋毛虫肌幼虫ES抗原可用于其他4种旋毛虫(乡土旋毛虫、布氏旋毛虫、伪旋毛虫、纳氏旋毛虫感染的血清学诊断及流行病学调查.
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伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的原核表达及其纯化
目的 原核表达并纯化伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(Trichinella pseudospiralis serine protease inhibitor,Tpserpin)基因,并鉴定其抗原性.方法 从伪旋毛虫肌幼虫提取总RNA,RT-PCR扩增Tp-serpin基因,插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-Tp-serpin,转化大肠埃希菌(E coli)Rosetta gami(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析后,用Ni-NTA Agarose亲和层析纯化,纯化产物经SDS-PAGE分析纯度,Western blot 鉴定反应原性.结果 重组表达质粒pET-28a-Tp-serpin经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确,与GenBank中登录的Tp-serpin基因相似性达99％.表达的重组Tp-serpin蛋白相对分子量约43 000,表达量约占菌体总蛋白的40％,主要以可溶性形式存在;纯化后的重组Tp-serpin蛋白纯度达95％以上,可被伪旋毛虫感染60 d的猪血清特异性识别,具有较好的反应原性.结论 成功构建了重组表达质粒pET-28a-Tp-serpin,并在E.coli Rosetta gami(DE3)中表达了重组蛋白,为旋毛虫病的血清学诊断候选抗原的研制及开发提供了科学依据,也为阐明serpin在伪旋毛虫入侵时期调节宿主免疫反应的作用奠定了基础.
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旋毛虫相对分子质量为43 000和45 000～50 000抗原的特性和功能
该文对旋毛虫排泄分泌抗原中相对分子质量为43000和45000～50000抗原的分子结构、定位、特性及功能等进行了综述.
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旋毛虫与伪旋毛虫肌幼虫抗原的SDS-PAGE和双向电泳分析
目的 鉴定旋毛虫(Trichinella spiralis,T1)与伪旋毛虫(T. pseudospiralis,T4)肌幼虫的差异蛋白.方法 应用SDS-PAGE和双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)对T1、T4肌幼虫的可溶性抗原与培养24 h的ES抗原的蛋白组分进行分析.结果 SDS-PAGE显示,T1肌幼虫可溶性抗原有22条蛋白带(221.62 kDa~14.88 kDa),其中6条为T1特异性蛋白带(59.72、44.37、23.66、22.36、18.26、16.34 kDa);T4可溶性抗原蛋白有18条带(185.28 kDa~14.27 kDa),其中4条为T4特异性蛋白带(132.60、119.30、35.26、31.02 kDa).T1的ES抗原有10条蛋白带(113.21 kDa~14.37 kDa),T4的ES抗原有9条蛋白带(104.71 kDa~14.51 kDa),T1、T4肌幼虫ES抗原的蛋白带均不相同.2-DE显示,T1可溶性抗原有193±12个蛋白点,分子量主要为11 kDa ~22 kDa、25 kDa ~64 kDa及100 kDa ~144 kDa,所对应的等电点(pI)分别为4.7~8.2、4.5~6.5及5~7;T4可溶性抗原有175±9个蛋白点,分子量主要为12 kDa ~21 kDa及25 kDa ~90 kDa,所对应的pI分别为4~9.5与4.5~9.6.T1的ES抗原具有82±6个蛋白点,分子量主要为13 kDa ~16 kDa、18 kDa ~22 kDa及40 kDa ~55 kDa,所对应的pI分别为4~7、3.8~6.2及5~9;T4的ES抗原具有69±5个蛋白点,分子量主要为10 kDa ~15 kDa、17 kDa ~25 kDa及29 kDa ~55 kDa,所对应的pI分别为4.7~6.5、4.6~6及5~7.结论 旋毛虫肌幼虫可溶性抗原及ES抗原的蛋白组分与伪旋毛虫的明显不同.
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伪旋毛虫肌幼虫cDNA表达文库的构建及筛选
目的 获取伪旋毛虫(Trichinella pseudospiralis)肌幼虫时期抗原性基因.方法 利用λZAP载体构建伪旋毛虫肌幼虫cDNA表达文库;以感染伪旋毛虫60天后的猪血清为抗体探针,对伪旋毛虫肌幼虫cDNA文库进行免疫学筛选,对筛选出的强反应原性克隆进行测序,利用相关分子生物学软件进行序列分析.结果 构建的伪旋毛虫cDNA表达文库的库容量为0.55×106pfu,重组率为95.6%,扩增后文库滴度为1.2×1010 pfu/mL.从2.0×105个重组噬菌体筛选获得阳性克隆27个.序列分析结果表明这27个阳性克隆共编码7种cDNA分子,其编码的类似蛋白分别为伪旋毛虫Tp21kDa蛋白、伪旋毛虫Tp28kDa蛋白、蛋白酶体激活因子亚单位(Proteasome activator subunit)类蛋白、Nudix水解酶(Nudix hydrolyase)类蛋白、凝集因子(Condensin)类蛋白、尿嘧啶糖基化酶(uracil glycosylase)类蛋白和一个未知蛋白.结论 获得两个反应原性较强且高拷贝的抗原基因,其分别编码Tp21kDa蛋白及蛋白酶体激活因子亚单位.
