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苏丹型埃博拉病毒糖蛋白原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立
目的 原核表达苏丹型埃博拉病毒(Sudan virus,SUDV)糖蛋白(GP),并作为包被抗原建立抗体间接ELISA检测方法. 方法 PCR扩增SUDV GP基因片段,克隆至pET30a(+)表达载体,IPTG诱导表达SUDV GP,经His-Ni柱纯化,SDS-PADE和Western blot鉴定正确的SUDV GP作为包被抗原建立SUDV抗体间接ELISA方法,并对实验条件进行优化. 结果 SUDV GP在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,建立的抗体间接ELISA检测方法佳SUDV GP包被量为2μg/孔,待检血清佳稀释度为1∶320,佳作用时间1.5h,HRP标记羊抗鼠IgG佳稀释度1∶10 000,TMB佳显色时间为7 min.该方法的特异性强,样品检测结果与已知血清的符合率为100％,检测SUDV阳性血清的敏感度为1∶40 960,SUDV GP批间及批内的实验结果变异系数(CV)均小于10％. 结论 成功表达SUDV GP并建立SUDV抗体间接ELISA检测方法,为疫苗免疫效果的评价、疫病的监测及SUDV抗体检测试剂盒的研发奠定了基础.
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含5种烈性出血热病毒的假病毒阳性参考品的制备
目的：利用慢病毒载体系统制备含有马尔堡病毒（Marburg virus）、扎伊尔型埃博拉病毒（Zaire Ebola virus）、苏丹型埃博拉病毒（Sudan Ebola virus）、拉沙热病毒（Lassa fever virus）和黄热病毒（Yellow fever virus）5种烈性病毒核酸片段的假病毒，为其核酸检测提供一种通用的阳性参考品。方法体外合成该5种病毒的目的基因片段，通过融合 PCR 技术将5个片段连接成一条基因，然后克隆到慢病毒表达载体上，并与其辅助载体共转染293T细胞；转染后分别于48、72 h 收集培养上清，用 DNase 和 RNase 进行消化处理及纯化浓缩，后提取核酸，利用普通PCR 和实时荧光定量 PCR 鉴定假病毒是否包装成功。结果测序结果表明，体外合成的该5种病毒的目的基因片段已正确连接并插入慢病毒载体中；载体转染293T 细胞后收集上清中的假病毒，提取核酸经上述两种 PCR 鉴定均可特异性检测到靶基因，表明已成功包装出含该5种出血热病毒靶基因的假病毒颗粒。结论该研究获得的假病毒颗粒可作为上述5种出血热相关烈性病毒核酸检测的通用阳性参考品。
