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黄热病研究进展
黄热病(Yellow Fever,YF)是由黄热病毒引起的一种急性传染病,主要经伊蚊叮咬传播.目前主要在非洲及南美洲流行.2016年1月21日安哥拉暴发黄热病疫情[1],随后在2016年3月13日,中国向世界卫生组织(WHO)报告亚洲首例黄热病病例[2],2016年我国共向WHO报告黄热病11例[3],均为输入性病例.随着我国与非洲各国贸易往来、留学、旅游等越来越频繁,黄热病曾经的地理屏障被打破,以后可能会出现更多的输人性病例,在此之前,我国并无诊治黄热病的经验,对黄热病的认识也不充分,因此就黄热病研究进展进行综述.
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应用DPO引物技术同时检测5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法
目的 应用双启动寡核苷酸引物(Dual Priming Oligonucleotide,DPO)技术建立同时检测日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)、黄热病毒(Yellow Fever Virus,YFV)、西尼罗病毒(West Nile Virus,WNV)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus,SLEV)和登革病毒(Dengue virus,DV)5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法.方法 利用Primer Premier 5.0软件设计5种病毒的特异性DPO引物,对引物浓度、Mg2+浓度和退火温度进行优化,测定多重RT-PCR反应的特异性和敏感性.结果 应用DPO引物技术建立的多重RT-PCR方法可特异性扩增JEV、YFV、WNV、SLEV和DV的142bp、293bp、377bp、630bp和521 bp基因片段,灵敏度分别为5000PFU/ml、4 500 PFU/ml、2.3×105 copies/μl、2.6×104 copies/μl和1.37×104 copies/μl,蚊虫模拟添加实验未发生非特异反应.结论 应用DPO引物技术建立的针对5种蚊媒病毒的多重RT-PCR检测方法有良好的敏感性和特异性,可以同时对JEV、YFV、WNV、SLEV和DV进行检测.
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随机引物在黄热病毒核酸检测中的应用
目的 将随机引物应用于黄热病毒核酸检测,为口岸快速准确地检测黄热病毒提供技术支持.方法 采用随机引物和特异性引物进行逆转录,分别用自行设计的引物、探针和参考文献的引物、探针,用实时荧光PCR方法对6份黄热病毒阳性尿液样本进行黄热病毒核酸检测,并对检测结果进行比较.结果 与特异性引物逆转录相比,随机引物逆转录的实时荧光PCR Ct值差别不显著(F值=0.11,P＞0.05).结论 随机引物可直接应用于黄热病毒检测,也可在口岸传染病监测中发挥其他作用.
关键词： 黄热病毒 随机引物 实时荧光RT-PCR -
黄热病毒特异性抗原片段的筛选与鉴定
目的 通过系统的生物信息学分析和实验验证,筛选黄热病毒的特异抗原片段,为免疫诊断试剂的研制奠定基础.方法 分别利用DNAStar及ANTHEPROT软件对黄热病毒蛋白进行分析,参考亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性及二级结构信息,对黄热病毒可能的共有及特异性抗原表位进行系统的预测分析,分析其在不同毒株中的保守性,并对预测得分值较高的抗原区域进行RT-PCR扩增,利用pMal-c2x原核表达系统进行原核表达,Western blot验证其免疫学反应原性,检测阳性抗原片段经亲和纯化后,包被ELISA微孔板,进一步验证其免疫学反应特异性及检测敏感性.结果 其中27段抗原片段获高效表达,经Western blot筛选及ELISA进一步验证,原核表达抗原片段YFV22表现良好特异抗,可检测低至1:12 800倍稀释的黄热病毒多克隆抗体,与所试其他参考病毒多克隆抗体无交叉反应.结论 经系统筛选、验证,获黄热病毒特异性抗原片段1段,为其免疫学诊断试剂的研制奠定了基础.
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中国黄热疫苗减毒株和世界卫生组织黄热疫苗标准株基因全序列分析
目的 研究中国黄热疫苗生产用减毒株与世界卫生组织(WHO)黄热疫苗标准株的基因序列,了解其核苷酸序列变异程度,和与其相关的氨基酸是否发生突变.方法 根据基因库(GenBank)中收录的黄热病毒(Yellow Fever Virus,YFV)17D序列设计引物,提取该两株YFV的核酸,逆转录后进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增病毒各部分基因片段,PCR产物纯化后直接测序,5'和3'端TA克隆后进行测序,然后进行遗传进化分析.经核苷酸序列测定进行序列比对分析.结果 经序列测定后,进行两株YFV的序列比对,并与GenBank中收录的其它相关YFV17D疫苗株和野毒株进行序列比对,发现中国黄热疫苗生产株与WHO黄热疫苗标准株间的核苷酸序列并未发生较大变异,核苷酸和氨基酸的同源性分别约为99%和99%.其重要病毒抗原E蛋白也未发生较大突变,但发现E区与毒力密切相关的173位氨基酸发生回复突变,进一步通过系统发生分析说明两者亲缘关系十分接近.结论 传代过程中,中国黄热疫苗株和WHO黄热疫苗标准株在基因水平上除个别外未发生较大改变,其基因组具有一定的稳定性.
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黄热疫苗
1 背景1.1公共卫生方面黄热(Yellow Fever,YF)是一种经蚊虫传播的病毒性出血热,在非洲和南美洲热带地区呈地方性流行,几个世纪以来,这些地区会不定期地发生YF爆发.同鼠疫和霍乱一样,YF也必须遵循<国际卫生条例>规定的控制措施.据世界卫生组织(wHO)估计,全球每年YF发病20万例,约3万例死亡.其中>90%发生在非洲,约有5亿人生活在赤道南北15°间的YF高风险地区(YF风险地区的定义为已有证据证明存在黄热病毒的地区,且该地区生态因素表明黄热病毒可传播至人).而且,每年约有>300万旅行者出入YF流行区,YF对他们也是严重的健康威胁.
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黄热病减毒活疫苗的研究进展
黄热病毒疫苗17D (yellow fever attenuated live vaccine-17D,YF-17D)问世于20世纪30年代,至今已有70多年的使用历史,接种人群超过6亿.我国早在20世纪50年代就按照WHO规范开展了黄热病疫苗YF-17D的生产,已有近60年的历史,主要供潜在暴露危险的人群使用;至今我国仍保持年均生产数万份YF-17D疫苗的规模用于计划接种.由于黄热疫苗的安全性高、保护性好,已被国际公认为成功疫苗的典范.新兴的系统疫苗学(systemic vaccinology)是一门综合学科,采用完整的设计、全方位的试验,以及系统地组织和分析各类研究数据,通过总结归纳疫苗引起的生物反应的特征和规律来探求有效疫苗的免疫保护机制的方法.因此近些年,利用系统疫苗学手段研究黄热病毒减毒活疫苗接种后激活的免疫应答类型,将使我们利用YF-17D这一成功的疫苗深入研究免疫系统识别、活化机制,并为以YF-17D为载体的嵌合疫苗研究以及其他病毒性疾病疫苗的设计提供新思路.
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2009年全球传染病疫情聚焦
2009年全球各种传染病频繁暴发和流行,3月份至年底各大洲均面临甲型H1N1流感的严峻挑战,防控形势非常严峻.现就2009年全球传染病重点疫情、疫点,结合我国防控情况作一回顾.
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微孔杂交快速检测主要黄病毒方法的建立
目的 建立特异、敏感、实用的登革病毒Ⅰ-Ⅳ型、流行性乙型脑炎病毒及黄热病毒检测及分型方法.方法 在系统分析上述病毒基因组序列基础上,分别设计针对6种病毒的特异性包被探针,扩增、克隆、测序后包被聚乙烯微孔板.随后设计检测用PCR引物,并于引物5'端标记生物素,对待检样品进行扩增后用检测探针进行微孔杂交(PCR-ELISA)反应,并对包被DNA浓度、包被时间、杂交温度、杂交时间等反应条件进行优化.结果 初步建立了微孔杂交快速检测上述病毒的方法,试验结果直观,阳性标本吸光度(A)值在0.5以上,阴性结果A值在0.1以下,S/N值在10.0以上.结论 PCR-ELISA方法敏感、特异,为上述病毒的快速诊断提供了新的方法.
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含5种烈性出血热病毒的假病毒阳性参考品的制备
目的：利用慢病毒载体系统制备含有马尔堡病毒（Marburg virus）、扎伊尔型埃博拉病毒（Zaire Ebola virus）、苏丹型埃博拉病毒（Sudan Ebola virus）、拉沙热病毒（Lassa fever virus）和黄热病毒（Yellow fever virus）5种烈性病毒核酸片段的假病毒，为其核酸检测提供一种通用的阳性参考品。方法体外合成该5种病毒的目的基因片段，通过融合 PCR 技术将5个片段连接成一条基因，然后克隆到慢病毒表达载体上，并与其辅助载体共转染293T细胞；转染后分别于48、72 h 收集培养上清，用 DNase 和 RNase 进行消化处理及纯化浓缩，后提取核酸，利用普通PCR 和实时荧光定量 PCR 鉴定假病毒是否包装成功。结果测序结果表明，体外合成的该5种病毒的目的基因片段已正确连接并插入慢病毒载体中；载体转染293T 细胞后收集上清中的假病毒，提取核酸经上述两种 PCR 鉴定均可特异性检测到靶基因，表明已成功包装出含该5种出血热病毒靶基因的假病毒颗粒。结论该研究获得的假病毒颗粒可作为上述5种出血热相关烈性病毒核酸检测的通用阳性参考品。
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WHO关于黄热病疫苗的意见书
此文介绍了黄热病的流行病学、病原体,黄热病疫苗的免疫效果、不良反应和禁忌证,以及WHO对该疫苗接种,尤其是特殊人群接种的意见.
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重组酶介导扩增方法快速检测黄热病毒
目的 本研究采用重组酶介导的等温核酸扩增方法(RAA),通过使用逆转录酶,建立黄热病毒的一步法等温核酸扩增(RT-RAA)方法.方法 根据黄热病毒基因组保守序列设计引物和探针,建立并分析RT-RAA的重复性、特异性、灵敏度;以所建立方法对黄热病毒样本进行检测,同时以基因测序进行验证.结果 黄热病毒RT-RAA扩增,体系中加入40U的逆转录酶扩增效果佳.该方法检测时间短(＜20 min),并且灵敏度高,检测下限可达100 copy,与登革病毒、西尼罗病毒、日本乙型脑炎病毒、基孔肯雅热病毒等蚊媒病毒无交叉反应,具有良好的特异性.结论 构建的黄热病毒RT-RAA方法具有快速、特异以及灵敏的特点,适应于黄热病毒的口岸快速检测.
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黄热病毒与甲型流感病毒及其分型集合检测芯片的初步研制
目的:研制黄热病毒与流感病毒及其分型集合检测芯片.方法:设计并合成60mer寡核苷酸(Oligo)探针用于制备检测芯片.提取黄热病、甲型流感病毒核酸,以限制性显示技术进行扩增标记,完成杂交后对芯片进行扫描和数据分析.结果:Oligo探针与相应的荧光标记样本杂交后,大部分能检测出阳性荧光信号,而空白对照和阴性对照均为阴性信号.结论:寡核苷酸芯片技术可应用于多种病毒的检测及分型,从而为多种病毒感染的早期鉴别诊断提供科学依据.
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多重实时荧光定量RT-PCR法快速检测3种蚊媒病毒
目的 建立多重实时荧光定量RT-PCR快速检测方法,用于黄热病毒(YFV)、登革热病毒(DFV)、基孔肯雅热病毒(C HIKV)的同时检测和鉴别诊断.方法 分别针对YFV 3'UTR基因、DFV 3'UTR C-M基因和CHIKV nsp2基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立并优化多重实时荧光定量RT-PCR反应体系,评价方法的特异性、敏感性和稳定性,并用临床标本进行验证.结果 该方法可同时检测YFV、DFV和CHIKV,检测结果的特异性强,灵敏度达1×103 copy/ml,结果的重复性很好,其变异系数分别为1.03％、0.90％和0.34％.临床确诊的11例DFV标本,5例CHIKV标本和10例黄热病疫苗标本核酸检测结果皆为阳性.结论 研究建立的多重实时荧光定量RT-PCR方法可同时检测YFV、DFV和CHIKV,灵敏度高、特异性强、稳定性好,是一种可同时快速检测多种蚊媒病毒的新方法.
关键词： 黄热病毒 登革热病毒 基孔肯雅热病毒 多重实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应 检测 -
黄热病毒单克隆抗体的制备及免疫反应特性鉴定
目的 制备黄热病毒单克隆抗体并对其生物特性进行鉴定.方法 通过动物免疫、细胞融合、阳性克隆筛选等方法制备黄热病毒单克隆抗体,免疫Balb/c小鼠收集腹水,得到扩大制备的单抗,辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水.IFA法检测单抗与黄热病毒(YFV)、乙脑病毒(JEV)、登革病毒1-4型(DENV1-4)、西尼罗病毒(WNV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)的特异性反应,并对纯化前后的腹水进行效价分析；ELISA方法进行单抗的亚型分类.结果 获得8株黄热病毒的单克隆抗体,均与YFV有特异性反应,1株与JEV有交叉反应,余7株与其它4种虫媒病毒无交叉反应.抗体分型大部分为IgG；纯化后单抗蛋白含量大多在30 mg/ml以上.纯化后的4株单抗效价在1∶25600,3株在1∶12800,仅1株效价较低.结论 本研究目前获得了几株特异性好、效价高的黄热病毒单克隆抗体,为建立黄热病毒快速检测系统奠定了基础.
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几种重要虫媒病毒单克隆抗体的制备及初步鉴定
目的：制备登革病毒、乙型脑炎病毒、黄热病毒、西尼罗病毒和基孔肯雅病毒等几种重要虫媒病毒的单克隆抗体，并对其生物学特性进行初步鉴定，为快速检测方法的建立奠定基础。方法通过动物免疫、细胞融合、克隆和筛选等方法制备几种虫媒病毒的单克隆抗体，应用IFA、ELISA方法进行特异性和亚型等的鉴定。结果分别获得的单克隆抗体是登革病毒18株、乙型脑炎病毒5株、黄热病毒8株、西尼罗病毒5株和基孔肯雅病毒7株，大部分是IgG型；大多数单抗有良好的特异性，乙型脑炎病毒和基孔肯雅病毒的单抗无非特异交叉反应，黄热病毒和西尼罗病毒各有一株单抗与乙型脑炎病毒有交叉反应，登革病毒的单抗则表现出较为广泛的交叉反应。结论主要获得了几种重要虫媒病毒特异性好、高效亲和的单抗，为快速检测方法的建立奠定了基础。
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黄热病毒实时荧光定量PCR方法的建立
目的 建立黄热病毒的实时荧光定量PCR检测技术,以实现黄热病毒感染早期的筛选和检测.方法 以带有黄热病毒基因质粒为阳性模板,采用TaqMan探针法,制作标准曲线,以实现对黄热病毒的简单快速的高灵敏度、高特异性实时检测.结果 该方法检测的低拷贝数可以达到3.457 copies/μl.组内及组间变异系数均低于5％,证明该方法具有良好的敏感性及稳定性.以1～4型登革病毒和乙脑病毒基因组为模板,检测结果为阴性,证明该方法有良好的特异性.结论 该方法可快速、灵敏、特异、定量检测黄热病毒,能用于黄热病毒感染的早期诊断.
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黄热病毒实验诊断过程中的风险及其控制
目的 将黄热病毒实验诊断过程中的生物安全和生物安保风险降到低.方法 识别可疑黄热病病例样本在检测前、检测中及检测后的生物危害风险,依据风险分析和评估结果制定并采取风险防控措施.结果 在检测前进行风险识别和分析,优化病原检测所需场所、仪器、材料及人员,确定操作规程及人员防护措施;对检测中样本开启、处理、分装、暂存及检测后废弃物处理、实验环境消毒、样本保藏及上送等各阶段开展风险识别及风险再评估,持续优化、完善防控措施.结论 本研究为黄热病及其他蚊媒传播传染病的风险评估和应对措施制定提供了参考和依据.
