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应用DPO引物技术同时检测5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法
目的 应用双启动寡核苷酸引物(Dual Priming Oligonucleotide,DPO)技术建立同时检测日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)、黄热病毒(Yellow Fever Virus,YFV)、西尼罗病毒(West Nile Virus,WNV)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus,SLEV)和登革病毒(Dengue virus,DV)5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法.方法 利用Primer Premier 5.0软件设计5种病毒的特异性DPO引物,对引物浓度、Mg2+浓度和退火温度进行优化,测定多重RT-PCR反应的特异性和敏感性.结果 应用DPO引物技术建立的多重RT-PCR方法可特异性扩增JEV、YFV、WNV、SLEV和DV的142bp、293bp、377bp、630bp和521 bp基因片段,灵敏度分别为5000PFU/ml、4 500 PFU/ml、2.3×105 copies/μl、2.6×104 copies/μl和1.37×104 copies/μl,蚊虫模拟添加实验未发生非特异反应.结论 应用DPO引物技术建立的针对5种蚊媒病毒的多重RT-PCR检测方法有良好的敏感性和特异性,可以同时对JEV、YFV、WNV、SLEV和DV进行检测.
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携带圣路易斯脑炎病毒特异基因片段的重组假病毒颗粒的构建与鉴定
目的 制备含有圣路易斯脑炎病毒(SLEV)prM基因片段的假病毒颗粒,旨在提供安全、可靠、稳定的核酸阳性质控品.方法 根据armored RNA技术原理,构建携带含有SLEV prM基因片段的重组质粒pSE380-MS2-SLEV,转化大肠杆菌后利用IPTG进行诱导表达,三氯甲烷法纯化后利用透射电镜观察重组假病毒颗粒形态.通过DNaseⅠ和RNase A双酶消化实验评价重组假病毒颗粒的核酸酶耐受性,并结合温度敏感性实验分析假病毒颗粒中核酸片段的稳定性.利用荧光定量 RT-PCR法对该假病毒颗粒进行验证.结果 PCR扩增和测序分析显示,prM基因片段正确克隆至载体pSE380-MS2.经大肠杆菌表达可形成直径约为25 nm的均一、球形重组假病毒颗粒.核酸酶消化和温度敏感性实验表明假病毒样颗粒包装的病毒核酸能耐受核酶的降解,37℃条件下存放20 d仍保持稳定.荧光定量RT-PCR检测该假病毒颗粒检测限可达1.8×103 拷贝/ml,且与同属的其他病毒无交叉反应.结论 成功构建了含有SLEV prM基因片段的假病毒颗粒,具有良好的核酸酶耐受性和稳定性,可作为核酸阳性质控品对核酸提取与检测过程进行全程监控.
