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应用DPO引物技术同时检测5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法
目的 应用双启动寡核苷酸引物(Dual Priming Oligonucleotide,DPO)技术建立同时检测日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)、黄热病毒(Yellow Fever Virus,YFV)、西尼罗病毒(West Nile Virus,WNV)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus,SLEV)和登革病毒(Dengue virus,DV)5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法.方法 利用Primer Premier 5.0软件设计5种病毒的特异性DPO引物,对引物浓度、Mg2+浓度和退火温度进行优化,测定多重RT-PCR反应的特异性和敏感性.结果 应用DPO引物技术建立的多重RT-PCR方法可特异性扩增JEV、YFV、WNV、SLEV和DV的142bp、293bp、377bp、630bp和521 bp基因片段,灵敏度分别为5000PFU/ml、4 500 PFU/ml、2.3×105 copies/μl、2.6×104 copies/μl和1.37×104 copies/μl,蚊虫模拟添加实验未发生非特异反应.结论 应用DPO引物技术建立的针对5种蚊媒病毒的多重RT-PCR检测方法有良好的敏感性和特异性,可以同时对JEV、YFV、WNV、SLEV和DV进行检测.
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四重RT-PCR快速检测2013新型H7N9禽流感病毒
目的 建立能快速准确检测发热病人咽拭子样本中2013新型H7N9禽流感病毒的四重RT-PCR方法.方法 针对甲型流感病毒的M基因设计通用引物,针对2013新型H7N9禽流感病毒的HA和NA基因设计特异性引物,选择人源看家基因beta-actin设计质控引物,通过优化实验条件建立一步法四重RT-PCR反应体系.与商品化实时荧光RT-PCR试剂盒进行方法比对.结果 成功建立四重一步法RT-PCR筛查2013新型H7N9禽流感病毒的检测技术.结论 该方法简便、实用、成本低廉,适用于2013新型H7N9禽流感病毒的快速检测.
关键词： 多重RT-PCR 甲型(H7N9)禽流感病毒 甲型流感病毒 -
GeXP多重基因表达遗传分析系统对2009～2012年济南市手足口病病原谱的研究
本研究旨在利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,检测与手足口病密切相关的多种肠道病毒类型,探明济南市手足口病病原谱的构成.选取济南市2009～2012年6月手足口病病例标本274例,经多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,研究与手足口病密切相关的15种肠道病毒:肠道病毒71型(Human enterovirus 71,EV71)、柯萨奇病毒A组(Coxsackievirus A,CVA) 16、4、5、6、9、10型和柯萨奇病毒B组(Coxsackievirus B,CVB)1、3、5型,以及埃可病毒(Echovirus,Echo)6、7、11、13、19.结果显示:2009～2012年济南市手足口病274例标本中,检出EV71 69例(25.18％),CVA16 44例(16.06％),CVA10 39例(14.23％),CVA6 20例(7.30％),CVB1 3例(1.09％),Echo6 2例(0.73％),CVA9 1例(0.36％),CVB3 1例(0.36％);两种以上病原体混合感染14例(5.11％).CVA10和CVA6是引起济南市手足口病的两大病原体,仅次于EV71和CVA 16;流行季节为4～8月,发病高峰分别在4月和6月.利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,首次明确了济南市手足口病的肠道病毒主要类型,为济南市手足口病疫情的防控及临床治疗提供了科学依据.
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GeXP多重基因表达遗传分析系统在手足口病病原分型检测中的应用
利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,建立一种多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,同时检测引起手足口病的9种常见的人肠道病毒一人肠道病毒71型(HEV71)、柯萨奇病毒A组(CVA)16、4、5、9、10型和柯萨奇病毒B组(CVB)1、3、5型.优化多重反应体系中针对5'UTR区的肠道病毒通用引物和11对针对9种血清型人肠道病毒VP1区的特异性引物的浓度比例,分别以病毒细胞培养物和阳性粪便标本来验证多重反应体系的特异性,以TCID50定量的细胞培养物和克隆质粒体外转录的RNA梯度稀释液来检测多重检测体系的灵敏度.结果表明,优化后的多重检测体系,可扩增出人肠道病毒共有的保守片段的和型特异性片段,HEV71和CVA16细胞培养物的检测下限为100.5TCID50/μL,并可在103copies/μL水平同时、特异地检测出9种病毒RNA.该方法灵敏度高、特异性强,可快速对大量临床样本进行高通量检测,用于手足口病的分子流行病学调查.
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GeXP多重PCR技术同时检测12种常见呼吸道病毒
本研究建立了一种基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的多重RT-PCR检测方法,该方法可以同时检测12种呼吸道病毒,包括流感病毒A型和B型、季节性H1N1、副流感病毒1～3型、人鼻病毒、人偏肺病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒A型和B型、人博卡病毒.针对病原体保守区序列设计12种病毒的特异性引物,分别用已验证的阳性标本为模板检验多重体系的特异性.多重检测体系在103拷贝/μL水平可同时检测到12种病毒.另检测24份临床标本,以real-time RT-PCR为参考标准,进一步验证检测体系.结果表明,这种基于GeXP系统的新方法灵敏度高、特异性强,可以快速同时检测12种常见呼吸道病毒.
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建立新型的常见腹泻相关病毒的多重检测方法
利用GenomeLab(tm)GeXP遗传分析系统建立一种同时检测A组轮状病毒、诺如病毒GI、GⅡ型、札如病毒、肠道腺病毒、星状病毒、人博卡病毒Ⅱ型7种常见腹泻相关病毒的方法.对反应条件进行优化后,非同日三次重复实验表明至少在104拷贝/μL水平可同时特异地检测出7种病毒,对Enterovirus71、Human Parechovirus、PicobirnayirusⅡ阳性标本无交叉反应.本研究初步建立了一种高通量、快速的常见腹泻相关病毒的检测方法,为腹泻病原的分子诊断提供了新的方法.
关键词： 多重RT-PCR 病毒性腹泻 GeXP system 分子鉴别诊断 -
8种脑炎相关虫媒病毒GeXP检测方法的初步建立
利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,建立一种多重逆转录-聚合酶链反应( mRT-PCR)方法,同时检测与病毒性脑炎相关的乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)等8种虫媒病毒.优化多重反应体系及反应条件,分别以病毒分离培养物和阳性标本来验证多重反应体系的特异性,以克隆质粒体外转录的RNA梯度稀释液来检测多重检测体系的灵敏度.结果表明,优化后的多重检测体系,可扩增出各病毒对应的特异片段,并可在102拷贝/μL水平同时并特异地检测出8种(共13个特异片段)脑炎相关病毒RNA.该方法具有高通量、灵敏度高、特异性强且快速等优点,对病毒性脑炎的分子诊断及流行病学调查具有重要意义.
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2011年河北省发热呼吸道症候群的病毒病原学研究
目的 建立和完善河北省呼吸道传染病病原监测平台,了解河北省发热呼吸道症候群的病毒病原谱构成情况,为临床诊断、治疗和预防策略提供依据. 方法 选择1家儿童医院和1家综合医院作为监测哨点医院,采集发热呼吸道感染病例的咽拭子标本,采用多重RT PCR方法检测15种发热呼吸道症候群相关病毒,并进行统计分析. 结果 187例发热呼吸道感染病例中相关病毒检测阳性75例(40.11％),其中鼻病毒(HRV)、呼吸道合胞病毒A(RSV A)感染各13例(6.95％)、腺病毒(ADV)感染12例(6.42％),居病毒感染的前3位.病毒混合感染13例(6.95％),以HRV合并其他病毒感染多见.0～岁组感染率高,10～12月份为感染高峰季节. 结论 2011年河北省发热呼吸道症候群感染以HRV、RSV-A和ADV为主,多重感染常见.
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应用多重巢式RT-PCR检测骨髓增生异常综合征中MLL基因相关的10种融合基因
本研究探讨应用多重巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测骨髓增生异常综合征MDS)患者MLL基因相关的融合基因的临床价值.采用多重巢式RT-PCR方法检测了221例MDS患者10种MLL基因相关融合基因(dupMLL、MLL-ELL、MLL-ENL、MLL-AF6、MLL-AF9、MLL-AF10、MLL-AF17、MLL-CBP、MLL-AF1P、MLL-AF1Q).结果表明:在221例MDS患者中检测出以上融合基因者20例(9.05％),以上10种基因的阳性例数及阳性率分别依次为7(3.16％)、2(0.9％)、1(0.45％)、1(0.45％)、2(0.9％)、2(0.9％)、1(0.45％)、2(0.9％)、1(0.45％)、1(10.45％).结论:多重巢式RT-PCR技术能同时检测MDS患者中的10种融合基因,可作为MDS诊断及疗效判定的重要依据,同时也为微小残留痛(MRD)及预后提供相关的重要信息.
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三种呼吸道病毒实验室检测方法比较
目的在3种呼吸道多病原检测方法中筛选出敏感的实验室检测方法。方法以73份上呼道感染病例咽拭子标本作为检测对象，利用3种呼吸道多病原病毒检测方法，对17种呼吸道病毒检测指标进行平行检测，根据不同呼吸道病毒检测指标检出率，评价3种试剂检测效果。结果自建RT-PCR及PCR检测方法共检出56个阳性指标，市售多重RT-PCR检测试剂盒共检出41个阳性指标，市售多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒共检出87个阳性指标。结论多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒具有更高的检出率，可用于呼吸道多病原病毒的实验室检测。
关键词： 呼吸道病毒 普通PCR 多重RT-PCR 多重实时荧光RT-PCR -
多重RT-PCR检测儿童急性淋巴细胞白血病融合基因的临床研究
目的研究急性淋巴细胞白血病（ALL）患儿染色体畸变所致融合基因与临床危险度分层及治疗的关系。方法采用多重RT-PCR方法检测儿童ALL的常见融合基因，结合染色体核型分析、免疫表型及临床资料对152例ALL患儿进行临床研究。结果152例ALL患儿中有43例（29．5％）具有9种常见融合基因表达，包括 TEL/AML1、BCR/ABL（P190）、BCR/ABL（P210）、E2A/PBX1、MLL/ENL、MLL/AF9、TLS/ERG、CBF/MYH11、Hox11。TEL/AML1融合基因阳性23例，其中1例放弃治疗，1例因早期治疗反应不良，评估为高危，其他21例均早期治疗反应良好，目前停药10例（停药时间4～30个月），11例仍为完全缓解（CR），1例停药18个月后骨髓复发。E2A/PBX1融合基因阳性4例，其中3例评估为中危，目前均CR中，1例因早期治疗反应不良，评估为高危，化疗过程中复发死亡；BCR/ABL（P190）阳性5例，BCR/ABL（P210）阳性3例，其中5例行骨髓移植治疗（4例移植后数月骨髓复发，1例CR中），1例选择高危方案化疗后骨髓复发，另外2例临床未缓解，放弃治疗；MLL基因阳性2例，均评估为中危，1例MLL/AF9，经强化疗后目前已停药18个月，1例MLL/ENL，在化疗过程中复发，放弃治疗；TLS/ERG融合基因1例，早期治疗反应不良，经强化疗后达CR，目前已停药20个月；Hox11融合基因阳性4例，均评估为中危，化疗后3例CR中，1例因复发放弃治疗。结论 TEL/AML1表达者化疗效果良好；BCR/ABL、MLL基因重排等化疗效果差，需骨髓移植或强烈化疗。采用多重RT-PCR方法可快速同时检测儿童急性白血病29种常见融合基因，完善白血病的MICM分型、指导临床个体化治疗。
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重要呼吸道病毒病原的多重RT-PCR检测
目的 建立一种可同时快速检测引起人呼吸道感染的重要病毒病原的检测方法.方法 通过对PCR反应条件的优化,建立同时检测甲型流感病毒(IA)、呼吸道合胞病毒(RSV)和SARS冠状病毒(SARS-CoV)的多重RT-PCR方法.结果 该法可同时或分别扩增IA 258bp、RSV 348bp和SARS-CoV 438bp的基因片段.检测的敏感性分别为101.7TCID50/ml、10TCID50/ml和101.5 TCID50/ml.采用相同的反应体系和条件,分别对其他7种呼吸道病毒(包括乙型流感病毒,副流感病毒2型,柯萨奇病毒B3和B5血清型及腺病毒2、3和7血清型)进行扩增,均未检测出扩增产物.结论 此种多重RT-PCR法可在6h内完成,适用于三种重要呼吸道病毒的快速甄别.
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3种重要脑炎病毒的多重RT-PCR检测方法的建立
目的:建立针对西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalomyelitis virus,VEEV)和亨德拉病毒(Hendra virus,HeV)的多重RT-PCR检测方法.方法:分别针对WNV的NS1基因、VEE的NSP2基因和HeV的G基因设计3对引物,建立了同时检测WNV,VEEV和HeV的多重RT-PCR方法.以不同滴度的病毒评估该检测方法的敏感性,同时以中国地区流行的与脑炎相关的黄病毒属和甲病毒属成员为模板验证该检测方法的特异性.结果与结论:所建立的3种病毒的多重RT-PCR方法可同时或分别特异扩增WNV,VEEV和HeV的454 bp,541 bp和723 bp基因片段,敏感度分别达到10 PFU/ml,100 PFU/ml和100 fg/ml;而对中国流行的与脑炎相关黄病毒和甲病毒如日本脑炎病毒、森林脑炎病毒、黄热病毒、登革病毒、东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒的扩增均为阴性.结果表明所建立的多重RT-PCR敏感性和特异性良好,可用于3种脑炎病毒的快速鉴定和甄别.
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水中肠道食源性病毒的多重RT-PCR检测法
目的 建立能同时检测水环境中肠道病毒(Enterovirus,EVs)、诺如病毒GⅡ(Norovorus,Nov GⅡ)、轮状病毒(Rotavirus,RVs)、腺病毒(Adenovirus,AdVs)的多重RT-PCR检测.方法 根据GenBank收录的肠道食源性病毒核酸序列,利用软件DNAMAN设计肠道病毒通用引物以及Nov GⅡ、RVs、AdVs的特异性引物；将这4对引物置于同一体系中进行多重RT-PCR,利用各种肠道食源性病毒的核酸模板检测其特异性并通过不同滴度[100～107 pfu(copies )/ml]病毒测试其灵敏度；利用加标实验验证该方法的准确性；通过对5份河水或某水厂出水大体积水样(50L)进行病毒富集与检测,以确定该方法的实用性,同时,采用传统细胞培养法验证其结果.结果 该方法对目的病毒均获得了理想的电泳条带,而对其他病毒无非特异扩增；对EVs、AdVs的低检出滴度均为10 pfu/ml,Nov GⅡ-4为10 copies/ml,对RVs的低检出滴度为102 pfu/ml;加标实验检测结果准确率为100％;对5份河水或某水厂出水大体积水样进行病毒富集与检测,对以上各种病毒均有检出且与细胞培养结果一致.结论 该方法不仅特异性强、灵敏度高、简便快捷,而且准确率高,实际应用性强,适用于水中肠道食源性病毒的快速检测.
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多重RT-PCR同步检测A组轮状病毒P基因型
目的建立A组轮状病毒VP4基因型的多重PCR分型方法,并用此方法对武汉地区婴幼儿腹泻样本进行检测.方法在分析A组轮状病毒VP4基因的基础上,选取引物con2、con3进行第一轮RT-PCR,然后以A组轮状病毒5个P基因型P[6]、P[8]、P[9]、P[4]和P[10]的特异性引物,进行第二轮巢式PCR,建立多重巢式RT-PCR同步检测A组轮状病毒P基因型技术.结果利用该方法可以同时检出5种不同基因型标准株混合物中的各个型别.将纯化的A组轮状病毒标准株RNA系列稀释后,用本方法进行检测,其灵敏度为0.1 ng/μl.同时还对40份从武汉市儿童医院采集的A组轮状病毒阳性的腹泻儿童大便样本进行检测,其中P[8]有29例、P[4]有5例,另外发现有P[8]与P[4]混合感染4例.说明该方法对实际样本中的混合感染也能很好地分型.结论应用多重巢式RT-PCR对A组轮状病毒基因型研究将为临床诊断和实验研究提供一种快速、灵敏和特异的检测手段.
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A型和B型人类流感病毒多重RT-PCR法同时检测
流感病毒根据病毒颗粒核蛋白和基质蛋白抗原特性及其基因型特征的不同,分为甲(A)、乙(B)、丙(C)3型,每型又可分为不同的亚型.流感病毒主要以A型和B型感染人类,A型流感病毒以H1、H3、H5为常见致病亚型,近年发现的高致病性禽流感病毒,也可跨越种群障碍对人类造成感染[1-2].
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2010年哈尔滨市发热呼吸道症候群的病原学研究
目的 建立黑龙江省呼吸道传染病病原监测平台,了解发热呼吸道病症候群病原谱的构成.方法 在哈尔滨市儿童医院、社区医院及3家综合医院的内科、儿科、感染科的门急诊和住院病例中发现符合发热呼吸道症候群监测病例定义的患者进行信息收集和采集咽拭子,采用多重RT-PCR方法检测七种呼吸道病毒:流感病毒(FLU A,B型)、副流感病毒(PIV 1-4型)、呼吸道合胞病毒(RSV A,B型)、冠状病毒(HCoV)、偏肺病毒(hNIPV)、博卡病毒(HBoV),腺病毒(ADV).结果 2010年4月-12月共采集标本208份,检出各种呼吸道病毒16份,阳性率为7.69%,其中PIV阳性率高4.33%(9/208),其次为ADV 1.92%(4/208),HBoV、HCoV、FLUA各检出1例(0.48%),PIVI-4型均有检出,但以PIV3为主,未见混合感染或多重感染.阳性感染率在性别上统计学上无显著差异(x(2)=2.36,P>0.05).年龄分布主要是5岁以下儿童,占总阳性数的43.75%(7/16),其次是5～10岁年龄组25%(4/16).流行季节在5-8月份,PIV感染高峰是5月份,ADV感染高峰是8月份.结论 哈尔滨市呼吸道病毒的主要感染人群是10岁以下儿童,在春夏季节PIV和ADV是主要的病原.
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五种主要上呼吸道病毒多重RT-PCR检测方法的建立
目的:建立甲型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒A型、B型(RSV-A、RSV-B)和腺病毒(ADV)五种主要上呼吸道病毒的多重RT-PCR检测方法.方法:利用Primer premier5.0分别针对甲型流感病毒的M基因、乙型流感病毒的PBI基因、RSV-A和RSV-B的F基因及ADV的hexon基因设计五对特异性引物,对Mg2+、dNTP、引物浓度及退火温度等进行优化,建立同时检测甲型、乙型流感病毒、RSV-A、RSV-B和ADV的多重RT-PCR方法,并验证该检测方法的灵敏性.结果:所建立的五种病毒的多重RT-PCR方法可以同时或者分别扩增甲型、乙型流感病毒、RSV-A、RSV-B及ADV的141bp、635bp、525bp、377b和283bp基因片段,敏感度分别达到770PFU/ml、800PFU/ml、680PFU/ml、970PFU/ml和850PFU/ml,且五种病毒间无交叉反应.结论:所建立的多重RT-PCR方法可以迅速准确地检测甲型、乙型流感病毒、RSV-A、RSV-B和ADV,为五种病毒的检测提供了一种方便易行的方法.
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多重RT-PCR联合毛细管电泳法检测BCR-ABL融合基因
目的：建立多重逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）联合毛细管电泳法检测BCR-ABL融合基因，以期应用于慢性粒细胞白血病（CML）辅助诊断。方法采用重叠延伸法构建BCR-ABL融合基因阳性模板，设计并优化检测BCR-ABL融合基因的多重RT-PCR联合毛细管电泳体系，对检测体系进行初步的性能评估。结果多重RT-PCR技术检测BCR-ABL融合基因（e1a2、e13a2和e14a2）的低检测限在102～103拷贝/μL；50例临床确诊CML的患者应用该法检测BCR-ABL融合基因的阳性率为86．0％，其中e13a2型（20．0％），e14a2型（66．0％）；本方法与骨髓细胞培养染色体核型分析相比，阳性符合率为97．6％，阴性符合率为75．0％，总符合率为94．0％，2种方法具有较高的一致性（Kappa＝0．765，P＞0．05）。结论成功建立检测BCR-ABL融合基因的多重RT-PCR联合毛细管电泳方法。该方法操作简单快捷、特异性好、灵敏度高，适合于临床上CML的辅助诊断和分子分型。
关键词： BCR-ABL融合基因 慢性粒细胞白血病 多重RT-PCR 毛细管电泳 -
多重RT-PCR检测儿童急性髓细胞性白血病融合基因的临床与实验研究
目的研究儿童急性髓细胞性白血病(AML)染色体畸变所形成融合基因的临床和实验关系.方法采用多重巢式 RT-PCR方法对38例儿童 AML的融合基因联合染色体核型分析、免疫表型、临床资料进行研究.结果38例儿童AML中有23例(60.53%)具有 4种融合基因:MLLex7/AF9、TLS/ERG、AML1/ETO、PML1 RARα.8例患儿有HOX11原癌基因活化,7例为单纯表达 HOX11原癌基因活化,1例同时伴有其他融合基因表达.伴 AML1-ETO、PML-RAR α的20例患儿中接受化疗的11例全部达CR,且无复发.结论基因分型是儿童AL精确的分型方法,为临床化疗提供方向:AML表达HOX11者预后不良;伴MLL基因重排者预后极差.采用多重RT-PCR方法可快速同时检测儿童急性白血病29种染色体畸变所形成的融合基因,完善白血病的MICM分型、指导临床个体化治疗.
