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急性淋巴细胞白血病融合基因研究进展
急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种造血干细胞恶性克隆性疾病,准确的形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学分型是制订治疗方案和判断预后的基础,其中染色体异常与发病密切相关,是一项独立的预后因素.迄今报道涉及50多种特异的染色体易位形成的融合基因.采用多重聚合酶链式反应(PCR)方法,同时筛选划分不同ALL危险度的染色体易位,包括t(9;22)、t(12;21)、t(1;19)、t(4;11)、t(9;9)、t(16;21)等,为进一步诊断、治疗、评价患者的预后及微小残留病,提供了良好的平台.
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ERG 相关融合基因在前列腺癌早期诊断中的应用
高级别前列腺上皮内瘤（high grade prostatic ；intraepithelial neoplasia ，HGPIN ）是前列腺癌（prostatic cancer ，PCa ）癌前病变的唯一形态表现［1］。穿刺活检诊断为 HGPIN 的患者存在以下3种情况：①已经伴发 PCa ，因未穿刺到癌变部位而漏诊；②在一定时期会发展为 PCa ；③不会进展为PCa 。对于前2种情况，重复穿刺是必要的，而对于第三种情况却是不必要的。遗憾的是，目前尚缺乏有效的病理形态学指标进行有效甄别［2］。近年来，分子病理学飞速发展，为恶性肿瘤的早期诊断提供了依据。新研究发现，ERG 相关融合基因对诊断 PCa 具有高度的特异性，不少证据证实其在 PCa的早期诊断中具有重要的潜在价值［3］。我们前期采用 ROC 曲线确立了 ERG 相关融合基因畸形率诊断 PCa 的佳阈值为1．6％。本研究按照此阈值将首次穿刺诊断为 HGPIN 的患者，分为阳性组和阴性组，比较2组患者终发现 PCa 的概率，希望能为改变现有 HGPIN 重复穿刺策略提供一定的参考。
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常见白血病融合基因筛查在白血病诊断与分型中的意义
目的:研究分析常见白血病融合基因筛查在白血病诊断与分型中的意义.方法:回顾性分析本院2013年9月至2016年2月收治的131例白血病患者的临床资料,所有患者均进行反转录PCR(RT-PCR)融合基因筛查,监测融合基因阳性者同时进行流式细胞分析术(FCM)并检测微小残留病灶(MRD),探讨白血病融合基因与白血病分型的关系.结果:131例白血病患者中共筛查出10种白血病融合基因(dupML、AML/ETO、PML/RARα、PLZF/RARα、MLL/A取0、CBFβ-MYH11、MLL/AF6、Evi1、BCR/ABL、BCR/ABL),融合基因阳性的检出率为71.76％ (94/131).结论:选择多重RT-PCR方式再结合临床中较为常见的白血病融合基因进行筛查,可有效提高白血病的诊断准确率,并为今后临床诊断白血病及为其制订有针对性、个体化的治疗方案提供有效的参考依据.
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急性淋巴细胞性白血病HOX11基因阳性复发1例
病历资料患儿,男,8岁,2008年6月3日因"发热8天,咳嗽5天"入院.入院查体:淋巴结大,肝肋下3.0cm.骨髓穿刺证实为急性淋巴细胞性白血病,原始淋巴细胞89%;染色体46XY[6];免疫分型表达HLA-DR、CD34、CD22、CD19、CD10;14种常见融合基因阴性;强的松窗口试验敏感;化疗后第35天骨髓提示完全缓解.参照XH99方案,将该患儿划为低危组,但因为DNA指数未检测,故按照XH99中危方案予以化疗.现治疗23个月,2010年2月22日末次骨穿提示骨髓完全缓解,末次化疗为HDMTX+6MP方案,2010年5月VDLD方案化疗前,在无任何临床症状情况下,常规骨穿检查中提示骨髓复发,故留取骨髓标本送检,做免疫分型、染色体及找相应融合基因,免疫分型与病初完全一致,染色体正常,14种常见融合基因为阴性,但发现HOX11基因阳性.目前再次给予VDLP方案诱导缓解中,第35天骨穿提示完全缓解.
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基于淋病奈瑟菌外膜蛋白pIA-pIB融合基因重组产物酶联免疫吸附试验的建立和应用
目的 克隆淋病奈瑟菌外膜蛋白pIA、pIB基因并构建pIA-pIB融合基因及其原核表达系统以及建立基于rPIA-PIB的酶联免疫吸附试验(ELISA).方法 采用连接引物PCR构建pIA-pIB融合基因,按常规分子生物学方法构建其原核表达系统.采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和BioRad凝胶图像分析系统检测目的重组蛋白rPIA-PIB表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rPIA-PIB.以rPIA-PIB为包被抗原建立检测淋病患者血清标本中rPIA和/或rPIB特异性IgG的ELISA,以rPIA-PIB抗血清为一抗建立检测淋病患者脓液标本中rPIA和/或rPIB的ELISA,实验中以rPIA、rPIB及其抗血清相关ELISA为对照.结果 pIA-pIB融合基因与原始核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%.rPIA-PIB表达量为细菌总蛋白的29.8%,其提纯物SDS-PAGE后显示单一条带.rPIA-PIB-IgG-ELISA检测119例淋病患者血清标本的阳性率(98.3%)明显高于rPIA-IgG-ELISA(30.3%)或rPIB-IgG-ELISA(66.4%)(P＜0.01).rPIA-PIB-ELISA检测119例淋病患者脓液标本的阳性率(91.6%)也明显高于rPIA-IgG-ELISA(27.7%)或rPIB-IgG-ELISA(62.2%)(P＜0.01).结论 成功构建淋病奈瑟菌pIA-pIB融合基因及其原核表达系统;较之单一的rPIA或rPIB,rPIA-PIB作为淋病相关检测试剂盒抗原具有明显的优越性.
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问号钩端螺旋体lipL41基因表达及重组抗原分析
目的构建问号钩端螺旋体(钩体)ltB/ctB-lipL41/1融合基因及其原核表达系统.方法采用连接引物聚合酶链反应(PCR)构建ltB-lipL41/1和ctB-lipL41/1融合基因,常规方法构建其原核表达系统.采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目的重组蛋白rLTB-rLipL41/1和rCTB-rLipL41/1表达情况;用免疫印迹和神经节苷脂-酶联免疫吸附试验(GM1-ELISA)分别检测上述目的重组蛋白的免疫原性和佐剂活性;采用PCR和显微镜凝集试验(MAT)分别检测97株问号钩体野生株lipL41/1基因及其表达情况;用ELISA检测228例钩体患者血清lipL41基因产物的抗体.结果与报道的相关序列比较,ltB-lipL41/1和ctB-lipL41/1融合基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.6%～99.9%和99.8%～100%.rLTB-rLipL41/1和rCTB-rLipL41/1表达产量均约为细菌总蛋白的10%,主要以包涵体形式存在.rLTB-rLipL41/1和rCTB-rLipL41/1均分别能与rLipL41/1兔抗血清和牛GM1结合.87.6%(85/97)问号钩体野生株含有lipL41基因,84.5%(82/97)问号钩体野生株分别与rLipL41/1和rLipL41/2兔抗血清出现效价范围为1:4～1:128的MAT阳性结果.84.6%(193/228)和78.5%(179/228)的患者血清分别rLipL41/1和rLipL41/2抗体阳性.结论成功地构建了ltB-lipL41/1和ctB-lipL41/1融合基因及其原核表达系统.所表达的rLTB-rLipL41/1和rCTB-rLipL41/1融合蛋白有良好的免疫原性和佐剂活性.lipL41基因存在于不同问号钩体血清群中并高频率表达.rLTB-rLipL41/1和rCTB-rLipL41/1具有成为钩体属特异性疫苗抗原的良好前景.
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VP1与C3d3融合基因疫苗诱生CVB3特异性免疫应答及其预防病毒性心肌炎的研究
目的：观察柯萨奇病毒B组3型（CVB3）衣壳蛋白1（VP1）与三拷贝补体3片段（C3d3）融合基因疫苗诱生特异性免疫应答及其对小鼠病毒性心肌炎的预防效果。方法 BALB/c小鼠随机分为3组，即空质粒组、VP1基因免疫组和VP1-C3d3融合基因免疫组，每4周免疫1次，共3次，检测小鼠血清中和抗体滴度、细胞免疫应答水平以及病毒攻击后的心肌病理切片。结果融合基因免疫组的体液免疫应答和细胞免疫应答水平均明显高于VP1基因免疫组（P＜0.05）；CVB3攻击小鼠后，经融合基因免疫的小鼠心肌病理学变化明显减轻。结论 VP1-C3d3融合基因疫苗可以诱导小鼠对CVB3产生较强的特异性免疫应答，有效的预防了病毒性心肌炎的发生。
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克唑替尼治疗EML4-ALK阳性NS CLC的疗效及对其融合基因、相关血清指标和预后的影响
目的 探讨克唑替尼治疗NSCLC的疗效及对其融合基因、相关血清指标和预后的影响分析.方法 回顾性分析我科收治的60例EML4-ALK阳性表达的NSCLC患者的临床资料,根据治疗方式的不同,分为研究组及对照组两组(各30例),其中研究组(采用化疗+克唑替尼靶向治疗)和对照组(单纯化疗治疗),比较2组患者的临床疗效等差异.结果研究组患者治疗的控制率(80.00％)显著高于对照组患者(53.33％),差异有统计学意义(P<0.05);治疗后,研究组EML4-ALK的阳性表达率(33.33％)显著低于对照组(63.33％)(P<0.05);与治疗前比较,两组患者的CEA及CYFRA21-1水平均降低,且研究组下降水平显著高于对照组(P<0.05);治疗后研究组1年生存率(76.7％)显著高于对照组(50.0％)(P<0.05);血清CEA及CYFRA21-1水平与患者的EML4-ALK阳性表达情况存在明显的正相关(r=0.253、0.438,均P<0.05),而1年生存率与患者的EML4-ALK阳性表达情况存在明显的负相关(r=-0.336,P<0.05).结论 克唑替尼可通过特异性抑制NSCLC的EML4-ALK基因来提高疗效,同时改善患者预后,值得临床大力推广.
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CEA-HBD2重组基因在人结肠癌细胞中表达初步研究
目的构建高表达人源化HBD2人结肠癌表达体系.方法构建人pLNCX2-CEA信号肽-HBD2抗菌肽(成熟肽序列)逆转录表达载体,DOTAP转染逆转录包装细胞,产生的含融合基因的侵袭性逆转录病毒,转染人结肠癌HCT116细胞,用免疫印迹法法鉴定转化细胞中HBD2蛋白的表达.结果正确构建了表达HBD2成熟肽的重组信号肽HBD2的人结肠癌表达体系,并出现正确的目的基因表达.结论此HBD2表达体系表达的特异性多肽经纯化后,可进行下一步检测等实验.
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结核分枝杆菌rPstS1-HspX融合蛋白的表达、纯化及其免疫反应性分析
目的 构建结核分枝杆菌rPstS1-hspX (rph)融合基因及其原核表达载体pET-23b(+)-rPstS1-hspX[pET-23b(+)-rph],表达、纯化rPstS1-HspX (rPH)融合蛋白,并分析其免疫反应性.方法 采用基因拼接技术将PstS1和HspX编码基因通过多肽接头(GSGSG)的DNA序列进行连接,构建融合基因rph.将融合基因定向克隆入原核表达载体pET-23b(+),构建重组原核表达质粒pET-23b(+)-rph.将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3) pLysE感受态细胞,IPTG诱导融合蛋白表达.SDS-PAGE和Western印迹法鉴定其表达情况.用镍离子鳌合亲和层析柱纯化融合蛋白,Western印迹法初步评价融合蛋白的免疫反应性.结果 融合基因rph及其原核表达载体pET-23b (+)-rph构建成功.融合蛋白rPH主要以可溶性非包涵体形式表达,相对分子质量为51 000,表达量约占菌体总蛋白的23％.经亲和层析后得到了纯度达92％的融合蛋白.Western印迹证实融合蛋白能与结核病阳性血清发生特异性免疫反应.结论 成功构建了原核表达载体pET-23b(+)-rph,获得了rPH融合蛋白,为rPH融合蛋白在结核病诊断中的应用提供了依据.
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t(X;17)ASPL-TFE3型肾细胞癌临床病理特征及融合基因改变
目的 探讨t(X；17) ASPL-TFE3型肾细胞癌的临床病理特征及融合基因改变.方法 对3例t(X；17)ASPL-TFE3型肾细胞癌进行光镜观察及免疫组化染色.对癌以及癌旁组织进行融合基因的检测.结果 例1镜下可见癌细胞排列成宽阔的腺管状、乳头状结构,形态学符合经典的t(X；17) ASPL-TFE3型肾细胞癌.例2肿瘤组织呈不规则腺管状、巢状或条索状浸润性生长,界限不清,伴间质促纤维组织增生；瘤细胞高度异型,胞质丰富、嗜酸性,可见靴钉样内衬于管腔的生长方式,符合肾集合管癌的组织学形态.例3肿瘤细胞呈卵圆形或短梭形,片状或弥散性分布,并可见瘤细胞呈放射状围血管分布的结构形态,非常类似于肾上皮样血管平滑肌脂肪瘤.3例肿瘤TFE3为弱到强(+),癌旁组织为(-).RT-PCR结果示3例肿瘤组织及远离10 cm的癌旁组织均检测出ASPL-TFE3融合基因,并为测序所证实.结论 t(X；17) ASPL-TFE3型肾细胞癌可具有特殊形态,当形态学不典型时,RT-PCR检测法有助于肿瘤的精确诊断.此外癌旁组织被检测出融合基因,其原因尚需进一步研究.
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伴融合基因表达的上皮样梭形细胞软组织肉瘤3例临床病理观察
目的 探讨具有上皮分化的梭形细胞软组织肉瘤的临床病理特点和分子遗传学改变.方法 结合文献对3例梭形细胞软组织肉瘤的临床特征、组织形态、免疫表型和RT-PCR结果进行分析.结果 患者发病年龄38～70岁,肿瘤大小6 ～ 15 cm,主要临床表现为无痛性实性肿块.例1为存在PAX3-FKHR融合基因的腺泡状横纹肌肉瘤.镜下在束状或片状排列的梭形细胞背景中,可见少量呈巢状或梁状排列的上皮样细胞;上皮样细胞胞质丰富、嗜酸性;其间还散在细胞核偏位、胞质强嗜酸性的不典型横纹肌母细胞.免疫组化染色示AE1/3灶性(+),desmin、MyoD1和Myogenin散在(+).例2和例3均为存在SYX-SSX融合基因的滑膜肉瘤,肿瘤细胞形态在梭形细胞背景中,1例可见多量上皮样及多核巨细胞,另1例可见多量透亮细胞;免疫组化染色示EMA和vimentin均(+),bcl-2、CD99和AE1/AE3等表达不一致.以上病例均通过融合基因检测证实.结论 应用RT-PCR等分子手段检测特异性标记,为上皮样梭形细胞软组织肉瘤的诊断提供新的思路和视野.
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急性非淋巴细胞白血病的细胞和分子遗传学研究进展
随着细胞与分子遗传学技术在急性白血病(AL)的研究进展中的运用,AL的诊断分型已由1976年提出的以形态学为主的FAB分型发展到2001年的MICM分型,突出体现了细胞和分子遗传学的改变在AL诊断分型的重要地位.除此之外,细胞和分子遗传学改变还对急性白血病的危险度分层、预后判断、治疗指导及新药研发起着重要的指导作用.本文将论述染色体异常和融合基因的表达对急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)的诊断分型、预后评估和治疗的指导作用,并对染色体核型正常的ANLL几种常见的基因突变对疾病预后评估做个总结.近年来,对ANLL各型白血病分子细胞遗传学机制的进一步阐释有助于开发新的白血病治疗策略.
关键词： 急性非淋巴细胞白血病 分子遗传学 染色体异常 融合基因 -
细胞保存液提高中枢神经系统白血病检出率的实验研究
目的:探讨细胞保存液能否延长白血病细胞的存活时间,提高细胞存活率,从而提高中枢神经系统白血病的检出率.方法:在有细胞保存液或无细胞保存液的脑脊液上清中,分别加入Kasumi白血病细胞株,在不同时间点比较2组细胞的存活情况和生物学特性改变,研究方法包括细胞沉渣甩片镜检、细胞计数法、台盼蓝拒染法、CCK-8法和流式细胞术等,并以荧光定量RT-PCR检测肿瘤融合基因AML-ETO的表达.结果:在不同的时间点(8和24 h),已添加细胞保存液的脑脊液中细胞的存活状态和分子生物学特征,明显优于普通脑脊液的保存效果.结论:细胞保存液能有效提高白血病细胞的存活时间、存活率,从而提高中枢神经系统白血病检出率.
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两种方法动态监测急性早幼粒细胞白血病微小残留病变的前瞻性比较研究
本研究对比聚合酶链式反应(PCR)和多参数流式细胞术(FCM)在急性早幼粒细胞白血病(APL)患者微小残留病变(MRD)动态监测中的价值.2011年1月至2012年12月,在我院接受巩固治疗的APL患者,均于化疗前行骨髓穿刺,每例留取3份标本,同时行骨髓细胞形态学检查、融合基因PCR和FCM检查,并对结果进行统计分析.对48例入选患者共检查159例次,留取标本477份.结果表明:骨髓细胞形态学检查发现3份复发,余均为完全缓解;PCR检查中阳性7份,FCM检查中阳性19份(kappa检测,P＞0.05).结论:FCM与PCR检查对APL治疗效果的评估价值相似.
关键词： 融合基因 多参数流式细胞术 急性早幼粒细胞白血病 微小残留病变 -
成人急性髓系白血病患者AML1融合基因的快速检测及其临床意义
本研究旨在检测AML1相关融合基因在成人急性髓系白血病(AML)患者中的发生率,并初步分析AML1融合基因与AML发生、发展及预后的相关性.利用多重巢式RT-PCR方法对168例初治AML患者的骨髓标本进行AML融合基因(AML1-ETO,AML1-EVI,AML1-MDS1,ML1-M TG16,AML1-PRDM16,AML1-LRP16,AML1-CLCA2和AML1-PRDX4)的快速检测.结果表明,168例AML初治患者的骨髓标本中,有18例出现AML1融合基因,其阳性率为10.7％,其中12例AML1-ETO阳性(7.14％),2例AML1-EVI1阳性(1.19％),1例AML1-MDS1阳性(0.6％),1例AML1-MTG16阳性(0.6％),1例AML1-PRDM16阳性(0.6％),1例AML1-CLCA2阳性(0.6％).在AML1-ETO阳性患者中,有10例经过初次化疗达到完全缓解,2例经过了第二次化疗达到完全缓解;2例AML1-EVI1阳性患者经过初次化疗后并没有达到完全缓解;AML1-MDS1,AML1-MTG16,AML1-PRDM16及AML1-CACL2 阳性患者经过初次化疗后均未达到完全缓解.结论:AML1融合基因在AML中较为常见,可以作为急性白血病诊断和预后标志,同时也为微小残留病(MRD)的检测提供了分子标志.
关键词： AML1 融合基因 急性髓系白血病 多重巢式RT-PCR 完全缓解 -
异基因造血干细胞移植后复发慢性髓系白血病患者嵌合体和融合基因的动态观察
本研究利用STR-PCR结合RT-PCR定量和定性检测异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后患者嵌合体和融合基因的表迭,分析其植入和微小残留病变情况,评价其对复发的预测价值.采用STR-PCR结合毛细管电泳进行定量检测嵌合体供体细胞嵌合率,采用RT-PCR方法检测融合基因转录本bcr/abl mRNA.结果表明:4例患者在移植后28天均为100%供者型嵌合,融合基因bet/abl mRNA均为阴性.但在以后的随访过程中发现4例患者在不同时间出现不稳定混合嵌舍(MC)状态(DC为0%-80.4%),融合基因bet/abl mRNA阳性;其中2例复发后一直处于混合嵌合状态,另外2例在临床干预治疗后又转变为完全嵌合状态,目前处于分子生物学缓解状态.上述4例复发患者均在出现临床症状前发生供体细胞嵌合率(DC)下降;融合基因表达阳性.结论:STR-PCR在敏感范围内,其结果与RT-PCR的结果符合率高,两种技术的结合是一种检测异基因造血干细胞移植后供体是否植入的有效手段,对判断疾病复发及GVHD均有预警作用,对实施临床干预治疗有重要指导价值.
关键词： 异基因造血干细胞移植 慢性髓系白血病 串联重复序列 嵌合体 融合基因 -
bcr-abl基因检测寡核苷酸芯片的制备及分析
为了研究bcr-abl融合基因检测芯片在白血病诊断、分型、治疗方案选择及预后判断中的应用价值,设计了融合基因检测探针,制成寡核苷酸芯片;采用逆转录方法、荧光标记白血病细胞cDNA并进行杂交,以检测白血病细胞中bcr-abl基因.结果表明:通过对不同杂交温度、洗涤条件等的探索获得了较好的反应条件并用制备的芯片检测出了细胞株中的bcr-abl融合基因.结论:应用寡核苷酸芯片检测白血病细胞bcr-abl融合基因有独特的优势,具有一定的临床应用价值,但也存在一定的不足,若对芯片进一步改进,则今后在血液病方面应用前景是非常广阔的.
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四硫化四砷诱导K562细胞凋亡的机制研究
为了探讨四硫化四砷(As4S4)诱导慢性粒细胞性白血病(CML)细胞株K562凋亡及机制,用台盼蓝染色和MTS方法观察四硫化四砷对K562细胞生长抑制的影响,用瑞氏染色检测药物处理后的细胞形态学变化和细胞凋亡发生,流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期改变,实时定量逆转录聚合酶链反应(real-time quantitative PCR)检测BCR-ABL、Bcl-2、Bcl-XL、Bad和Bax等mRNA的表达,Western blot方法检测BCR-ABL、Akt和pAkt蛋白的表达.结果表明:四硫化四砷能明显抑制K562细胞活力,在0.5 μmol/L浓度下培养24小时,细胞生长明显受抑制且有剂量和时间依赖关系.小于0.1 μmol/L的四硫化四砷对K562细胞活力无明显影响.K562细胞经与四硫化四砷培养24至48小时后,出现典型的凋亡改变.与四硫化四砷培养12小时后,1.0 μmol/L条件下,K562细胞凋亡率上升,大于2.0 μmol/L浓度的四硫化四砷能明显诱导细胞凋亡,四硫化四砷能使K562细胞周期阻滞于G2/M期.四硫化四砷能使K562细胞Bcl-XL的mRNA表达下调,但对Bcl-2、Bad、Bax和BCR-ABL等的mRNA表达无影响.四硫化四砷能使K562细胞的pAkt蛋白表达下调,而BCR-ABL蛋白表达无变化.结论:四硫化四砷能有效地通过诱导凋亡抑制K562细胞生长,其机制可能与抑制凋亡途径因子Bcl-XL和pAkt等表达有关.
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应用多重RT-PCR结合寡核苷酸芯片方法检测儿童白血病常见融合基因
本研究探讨基因芯片在儿童白血病8种常见融合基因检测中的应用.采用多重巢式RT-PCR结合寡核苷酸芯片方法对84例临床收集的白血病标本进行融合基因检测.结果表明:此芯片可以从患者骨髓样本RNA中准确检测到阳性参照序列以及与融合基因相对应的特异基因片段.84例白血病患者骨髓标本中,31例(36.90%)具有8种染色体结构畸变产生的融合基因.包括tel/amll、e2a/pbxl、bcr/ablp190、ber/ablp210、mll/af4、amll/eto、pml/rarα、cbfβ/myhll.芯片检测的敏感性及特异性和RT-PCR方法相当.结论:采用多重巢式RT-PCR结合寡聚核苷酸芯片方法,可快速并同时筛选出8种染色体结构畸变产生的融合基因,为儿童白血病危险分层、治疗选择、预后判断提供重要依据.此种方法应用于筛查初治白血病儿童融合基因表达时优缺点并存,具有一定临床实用价值.
