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20例嵌合型Turner综合征的辅助生殖助孕及相关文献复习
目的 探讨嵌合型Turner综合征患者的生育功能及辅助生殖助孕的方式. 方法 选择2011年4月至2017年10月于苏州市立医院生殖中心收治的20例因不孕症要求行辅助生殖助孕的嵌合型Turner综合征患者,回顾性分析临床资料、辅助生殖助孕治疗过程、妊娠结局及其子代核型. 结果 20例患者经过辅助生殖助孕,15例分娩正常核型子代(其中14例行IVF/ICSI,1例行PGS),1例孕早期稽留流产(绒毛染色体核型为47,XY,+13),1例生化妊娠,3例未孕(其中包括1例赠卵IVF). 结论 对于卵巢功能尚未衰竭的嵌合型Turner综合征患者,结合临床具体情况,可尊重患者意愿尝试自体卵母细胞的辅助生殖助孕,治疗前需知情同意、充分评估.
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嵌合体胚胎:移植还是丢弃
在体外受精(IVF)治疗中,有很大比例的种植前胚胎包含两种甚至更多的细胞遗传学不同的细胞系,这种现象称为嵌合体.尽管卵裂期和囊胚期的嵌合现象已经发现二十多年了,但是嵌合体的准确发生率和对胚胎发育结局的影响仍不明确.随着遗传学技术的发展,例如高分辨二代测序(NGS),对嵌合体的检测更加敏感.研究发现嵌合体胚胎种植率明显低于染色体正常的胚胎,但是部分嵌合体胚胎也可以正常活产.如何处置嵌合体胚胎以及移植嵌合体胚胎后的随访变得非常关键.
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胚胎干细胞嵌合体小鼠的制备及其影响因素
胚胎干细胞(ES cell)嵌合体制备在发育生物学,功能基因组学等研究领域发挥越来越重要的作用.其技术本身随着干细胞生物学,体细胞核移植技术进步而不断发展.但其制备过程受ES细胞,宿主囊胚遗传背景、生存状态及嵌合体制备程序等诸多因素影响,导致ES细胞嵌合体的制备程序颇为复杂.本文将对ES细胞嵌合体小鼠制备技术的新进展作一综述.
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冻融胚胎植入前遗传学筛查的研究
目的:对冻融胚胎进行植入前遗传学筛查和分析.方法:将2007～2009年冻存的42枚正常胚胎解冻,应用荧光原位杂交(FISH)技术对所有活检的卵裂球行18及X/Y染色体筛查,并分析胚胎染色体异常的影响因素.结果:活检成功率为92.8%,固定成功率为82.62%,杂交成功率为92.78%.正常受精胚胎中染色体异常率为35.90%,包括非整倍体、多倍体、单倍体和嵌合体等异常.随胚胎提供者年龄增长,Gn用量增加,非整倍体发生的几率也增加(P＜0.05).受精方式、超排方案和Gn使用天数与染色体异常的发生无关(均P＞0.05).结论:FISH是对胚胎进行特定染色体非整倍体筛查的一种行之有效的方法.胚胎解冻、高龄、Gn用量会影响非整倍体的发生.
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原钙黏蛋白19基因相关癫痫的遗传特点及临床表型谱研究
目的 分析原钙黏蛋白19(X-linked protocadherin 19,PCDH19)基因相关癫痫的遗传学特点及临床表型谱.方法 对2005年2月-2017年4月在北京大学第一医院儿科及武汉市儿童医院神经内科确诊的41例(女39例,男2例)PCDH19基因相关癫痫患儿及家系受累成员的临床特点进行总结.采用Sanger测序或靶向捕获二代测序(Next generation sequencing,NGS)和多重连接依赖的探针扩增技术(Multiple ligation-dependent probe amplification,MLPA)筛查PCDH19突变.结果 41例先证者中,测序发现40例携带PCDH19基因突变,MLPA发现1例为整个PCDH19基因缺失.2例男性患儿经NGS检测为PCDH19突变嵌合体,突变等位基因占比分别为85％和33％;39例女性患儿中,19例为遗传性突变,20例为新生突变.女性携带突变者外显率为90％ (53/59).12例半合子父亲和1例嵌合体父亲均无抽搐病史.突变携带者表型包括癫痫伴智力低下、Dravet综合征、热性惊厥,少数女性携带者表型正常.即使在同一家系内,携带相同PCDH19突变的女性表型具有异质性.46例PCDH19突变阳性患者(41例先证者及5例家系受累成员)的临床特点:起病中位年龄为11个月(4 ～ 42个月),病程中全面强直阵挛发作(Generalized tonic clonic seizures,GTCSs)占87.0％(40/46),局灶性发作占69.6％ (32/46),肌阵挛发作(6/46),不典型失神(3/46)和失张力发作(1/46)少见.丛集性发作见于所有患者(46/46),80.4％发作具有热敏感的特点(37/46),仅3例曾有发热诱发的癫痫持续状态,76％有不同程度的智力损害(35/46),少数有孤独症样表现(7/46,l5.2％).结论PCDH19基因突变可为遗传性突变或新生突变,受累者以女性为主,少数男性嵌合体可发病或无症状.PCDH19基因相关癫痫具有外显率不全和表型异质性,丛集性发作和热敏感为其主要临床特点.
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45X/46XY,Yqh-嵌合体伴Y染色体AZFbc区缺失1例
临床资料患者,男,28岁,因婚后未避孕未育3年而就诊,查体:第二性征正常,身高173 cm,生殖器官发育正常,睾丸大小形态正常,附睾头、体、尾未及明显增粗增厚,精索静脉未见曲张;3次精液常规及沉渣图片镜检均未见精子及生精细胞,内分泌6项(泌乳素、促卵泡生成素、促黄体生成素、孕酮、雌二醇和睾酮)检查结果均正常.
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细菌人工染色体微珠技术在高危孕妇产前诊断中的应用
目的 探讨细菌人工染色体微珠技术(BACs-on-Beads,BoBs)在高危孕妇产前诊断中的应用价值.方法 选取2015年2月至2017年6月在杭州市妇产科医院产前诊断中心进行产前诊断的3 395例高危孕妇羊水样本,应用BoBs技术与传统核型分析技术同时进行检测,并对BoBs技术检出的染色体微缺失微重复样本用单核苷酸多态性基因芯片(single nucleotide polymorphism,SNP-oligo array)或荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)进行验证.结果 BoBs技术检出135例21号染色体拷贝数异常、18号染色体拷贝数异常和13号染色体拷贝数异常,与核型分析检测结果相符率100.00％,37例性染色体异常中,29例与核型分析结果一致,假阳性8例,相符率为78.38％.此外BoBs技术还检出传统核型方法无法检出的微缺失微重复综合征.结论 对于21、18、13号染色体拷贝数异常及9种染色体微缺失综合征,BoBs技术是一种快速、便捷、可靠的产前诊断方法,但对于BoBs提示性染色体异常的结果,好以核型或其他方法验证以避免假阳性的情况发生.
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小鼠非清髓单倍体造血干细胞移植物中脾细胞对植入及移植物抗宿主病的影响
目的:采用小鼠非清髓单倍体造血干细胞移植移植物抗宿主病(GVHD)模型,将单倍体相合供鼠的骨髓细胞和脾细胞混合移植给受鼠,探讨脾细胞数量对嵌合体形成及GVHD的影响.方法:30只受鼠CB6F1(H2Kd/b)分为A,B,C组,均接受"Co 4Gy全身照射,实验组4～6 h后混合输入供鼠C57BL/6(H2Kb)脾细胞(依组次分别输注1×107,3×107,6×107个)和骨髓细胞(1×107个).测定受鼠嵌合体水平,观察各组GVHD临床表现,进行评分,并观察生存期.结果:A及B组移植后3周达完全供者植入,C组于移植后2周达完全供者植入.A组小鼠未观察到GVHD表现,B组小鼠全部出现GVHD,其中部分小鼠有严重GVHD,C组小鼠均出现严重GVHD.各组小鼠临床GVHD评分有显著差异(各组间P＜0.01),且C组＞B组＞A组.移植后全部存活超过90 d.结论:增加小鼠单倍体造血干细胞移植物中脾细胞数量,有利于促进尽早形成完全供者嵌合体,但同时增加GVHD发生的可能性及严重程度.
关键词： 小鼠 非清髓 单倍体造血干细胞移植 移植物抗宿主病 嵌合体 -
金银花同源四倍体的诱导和鉴定
金银花是忍冬科忍冬属植物忍冬Lonwera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花,具有清热解毒,凉风散热之功效[1],是中医常用药.药用植物多倍体具有药效成分含量高,抗逆性强等特点[2].利用生物技术进行多倍体诱导,诱导效率高,嵌合体少[3].本研究利用生物技术,在离体组织水平上进行出金银花同源四倍体的诱导,以期为选育金银花四倍体新品种提供技术支持.
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小鼠胚胎干细胞构建嵌合体的方法
目的利用本实验室新近分离培养的远交系KM小鼠胚胎干细胞进行嵌合体构建实验.方法从KM小鼠囊胚的内细胞团中分离培养胚胎干细胞,进行近交系C57BL/6J小鼠受体囊胚腔内注射,进行嵌合体构建实验.结果从内细胞团中分离的胚胎干细胞具有胚胎干细胞的典型特征,克隆状生长,碱性磷酸酶染色呈强阳性,核型正常,悬浮培养能形成类胚体,已成功构建1只嵌合鼠.结论利用我们分离的KM小鼠胚胎干细胞可成功地构建嵌合体.
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STR-PCR对造血干细胞移植后植入证据的检测
本研究采用STR-PCR检测方法,观察比较15例异基因造血干细胞移植术后患者的植入情况.提取15例异基因造血干细胞移植术患者及其供者移植前的以及患者移植术后的不同时期的外周血或骨髓DNA,PCR扩增5个具有高度多态性的STR位点,通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染,分析其植入情况.结果表明:15例患者均有不同程度植入,其中完全供者植入10例,供受者混合嵌合体5例.持续缓解10例,死亡4例,1例复发但仍存活.混合嵌合体中供者DNA比例的下降预示着早期排斥或复发.Ⅱ度以下急性移植物抗宿主病的发生与混合嵌合体有明显相关性.结论:STR-PCR是分析异基因造血干细胞移植后供体是否植入的灵敏、准确度高的方法,混合嵌合状态对白血病复发有预警作用.嵌合状态的变化对疾病的治疗有指导作用.
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异基因造血干细胞移植后复发慢性髓系白血病患者嵌合体和融合基因的动态观察
本研究利用STR-PCR结合RT-PCR定量和定性检测异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后患者嵌合体和融合基因的表迭,分析其植入和微小残留病变情况,评价其对复发的预测价值.采用STR-PCR结合毛细管电泳进行定量检测嵌合体供体细胞嵌合率,采用RT-PCR方法检测融合基因转录本bcr/abl mRNA.结果表明:4例患者在移植后28天均为100%供者型嵌合,融合基因bet/abl mRNA均为阴性.但在以后的随访过程中发现4例患者在不同时间出现不稳定混合嵌舍(MC)状态(DC为0%-80.4%),融合基因bet/abl mRNA阳性;其中2例复发后一直处于混合嵌合状态,另外2例在临床干预治疗后又转变为完全嵌合状态,目前处于分子生物学缓解状态.上述4例复发患者均在出现临床症状前发生供体细胞嵌合率(DC)下降;融合基因表达阳性.结论:STR-PCR在敏感范围内,其结果与RT-PCR的结果符合率高,两种技术的结合是一种检测异基因造血干细胞移植后供体是否植入的有效手段,对判断疾病复发及GVHD均有预警作用,对实施临床干预治疗有重要指导价值.
关键词： 异基因造血干细胞移植 慢性髓系白血病 串联重复序列 嵌合体 融合基因 -
猕猴造血嵌合体检测方法的建立与应用
在受体内检测到供体细胞嵌合是判断动物移植模型成功建立的关键.为了研究猕猴移植模型中的造血细胞嵌合状态,本研究利用多聚酶链反应(PCR)扩增猕猴Y特异性序列,建立检测性别不同供受者猕猴移植模型嵌合体的方法;用体外雄性、雌性DNA混合稀释实验研究该方法的敏感性;用染色体分析法验证该方法的准确性,并对1例异基因外周血造血干细胞移植的猕猴和1例间充质干细胞(MSC)异体输注的猕猴进行嵌合监测.结果表明:雄性猕猴DNA扩增产物长度为176 bp,雌性无扩增产物,敏感性达0.05%(雄性/雌性DNA比例).对异基因外周血造血干细胞移植的猕猴,用Y特异性序列分析法和性别染色体检测法于移植后7及14天均检测到雄性供者嵌合.输注非亲缘雄性MSC的雌性猕猴,输注后1小时的外周血和30天的骨髓用本方法检出雄性供体嵌合,结果性别染色体检测未发现雄性供体嵌合.结论:采用PCR法扩增猕猴Y特异性序列检测猕猴移植模型嵌合体方法简便,样本需要量少,敏感性高.该法可用于猕猴各种异体器官移植和细胞输注实验的嵌合状态评价.
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混合脐血成人移植定量监测植入状态的实验研究
为了定量监测和研究双份异基因脐血用于成人白血病患者移植后两份脐血的植入状态、嵌合体类型、供者细胞相对数量的动态变化及演变规律,采用荧光标记复合扩增短串联重复(STR)位点嵌合体定量检测技术,对1例急性髓细胞白血病成人患者移植两份(脐血1有核细胞数为2.5×107/kg,脐血2有核细胞数为1.53×107/kg)HLA各1个位点不相合的异基因脐血前后的序列血样进行9个STR位点的检测;利用供、受者之间的差异位点定性判断脐血是否植入以及嵌合体类型;而后根据377XLDNA测序仪上荧光扫描后两供者差异基因检出峰的峰面积计算脐血植入后患者体内两份脐血的细胞相对数量,定量分析供体细胞植入程度及演变规律;并与采用HLA差异基因对植入状态的分析结果进行对比.结果表明:移植后15天两份脐血同时植入,植入状态为完全双份供者嵌合体,患者体内脐血1的相对细胞数量占51.3%,脐血2占48.7%;30天时脐血1嵌合体细胞上升为70.0%,脐血2嵌合体细胞下降为30.0%.52天时只检测到脐血1的基因,植入状态转为完全单份供者嵌合体,有核细胞数少的一份脐血被排斥,有核细胞数多的一份长期植入.结论:荧光标记复合扩增STR嵌合体定量检测可精确地描述两份脐血的植入程度及变化过程,为临床脐血的应用及供者的选择提供了一个准确、可靠的实验依据,证明双份HLA各1个位点不合的脐血同时用于成人的移植是可行的.
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异基因造血干细胞移植植活状态的变性高效液相色谱检测研究的首次报告
异基因造血干细胞移植后动态检测供者嵌合状态对判断移植效果和实施临床早期干预治疗具有重要意义.在临床上已有多种方法用于植活检测,本研究用变性高效液相色谱(DHPLC)技术结合聚合酶链反应扩增短串联重复序列(STR-PCR)检测造血干细胞移植植活状态的特点及可靠性.用非亲缘个体的系列DNA混合体在体外检测此测定方法的可行性和半定量结果的准确性.结果表明,体外模拟混合嵌合体检测实验,显示扩增前供者DNA嵌合百分率与扩增后供受者DHPLC色谱峰峰面积比值呈直线相关,小检出DNA百分比为5%.用该方法分析51例移植对的结果显示:45例均至少有2个可以区分彼此的有信息位点(另外5例无移植前受者标本,1例为同卵双生双胞胎);39例与荧光标记多重PCR扩增STR结合毛细管电泳方法进行对照,准确性为100%;29例与性染色体FISH分析,27例与特殊基因标记的分析结果一致;所有病例均检测到完全供者细胞嵌合状态(FDC);对3例患者观察到临床复发的同时,检测到供者嵌合体的比例明显下降,其中2例为混合嵌合体,1例转变为受者自身型.在此基础上,我们将该方法首次用于对8例人类白细胞抗原(HLA)配型不同-单倍型亲缘供者干细胞及无血缘关系脐带血混合移植患者植活情况的动态检测.结果显示,8例混合移植患者STR-PCR检测结果均为FDC,来源均为亲缘供者.结论:用DHPLC技术结合短串联重复序列具有快速、经济、无污染和自动化高等特点,用于检测异基因造血干细胞移植物植活状态是可靠的.
关键词： 异基因造血干细胞移植 短串联重复序列 变性高效液相色谱 嵌合体 -
非清髓造血干细胞移植后致敏供者淋巴细胞输注对嵌合状态及GVHD影响的实验研究
本研究目的是探讨经受者皮肤致敏后的异基因供者淋巴细胞输注(DLI)是否能在促进形成完全供者嵌合(CC)的同时减轻移植物抗宿主病(GVHD).以C57BL/6小鼠(H-2b,B6)为受者,于第0天接受60Co γ线全身照射(TBI),总剂量为5.5 Gy,照射当天移植经粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员后的BALB/c小鼠(H-2d,BA)外周血干细胞(2×107个),移植后第2天腹腔注射环磷酰胺200mg/kg,并分别于移植后第28天输注致敏/未致敏的供者淋巴细胞2×106.结果显示,致敏后DLI的受鼠(黑色)无1例出现GVHD,60天时转变为完全供者嵌合,表型明显呈现为供鼠(白色)特征,CD4+/CD8+T淋巴细胞比值在DLI后早期下降,半月后有所升高,但仍低于正常水平;未致敏的DLI受鼠出现不同程度的GVHD,嵌合率稍有上升,仍表现为混合嵌合体(MC),CD4+/CD8+比值在DLI后早期升高,后期降至正常水平.结论:经受者皮肤致敏后的DLI在诱导CC的同时降低GVHD发病率,CD4+/CD8+比值与GVHD发病率间具有良好的相关性.
关键词： 非清髓性异基因造血干细胞移植 供者淋巴细胞输注 嵌合体 移植物抗宿主病 -
利用新生大鼠建立人/大鼠造血嵌合体模型
本实验旨在通过输注脐血Lin-细胞,利用新生大鼠建立人/大鼠造血嵌合体模型.将脐血来源的Lin-细胞移植到正常一级新生SD大鼠的肝脏内,移植后的新生大鼠与同窝未接种的正常新生大鼠共同饲养和观察,于输注Lin细胞后2,4和8周时取嵌合鼠的外周血、脾脏等组织,检测人源细胞的比例及人特异性β2-微球蛋白基因片段.结果发现,通过流式细胞术检测到嵌合鼠外周血中存在有一定比例的人源细胞,PCR证明了嵌合鼠脾脏基因组DNA中存在人特异性β2-微球蛋白基因片段.结论:利用新生大鼠可以建立人造血嵌合体,它为今后利用此实验模型进行人造血干细胞体内生物学特性的检测及其它实验奠定了基础,具有潜在应用价值.
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STR-PCR分析嵌合体在同种异基因造血干细胞移植中的应用
利用荧光标记的多重PCR扩增短串联重复序列(STR-PCR)结合毛细管电泳检测供者细胞嵌合率(DC),以探讨该方法的连续检测对异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后转归的预警作用,采集27例清髓性外周血干细胞移植患者移植前、移植后不同时段的外周血或骨髓,DNA样本用Profiler Plus和Cofiler Plus商品化试剂盒扩增后,用ABI310遗传分析仪进行毛细管电泳,确定基因位点及峰面积,根据基因型的差异选择嵌合率计算公式.结果表明:两种试剂盒测得的DC嵌合率一致;在27对中能区别出供受差别的STR位点,Profiler Plus为6.3(4-9)个,Cofiler Plus为4.9(2-6)个.26例患者均在移植后28天出现供者细胞,1例患者未出现供者细胞.14例患者DC 100%,均获得持久植入,至今仍无白血病生存;另有9例患者出现不稳定混合嵌合(MC)状态(DC为0%-90.2%),其中5例为血液学复发.27例病人中有6例死亡.上述5例复发患者均在出现临床症状前发生DC量下降;供者细胞完全嵌合组移植物抗宿主病(GVHD)的发生率高于MC组.结论:动态检测DC可用于移植动力学研究,对移植物早期植入或被排斥、疾病复发以及GVHD的发生均有预警作用,对早期实施临床干预治疗有重要的指导意义.
关键词： 同种异基因造血干细胞移植 STR-PCR 毛细管电泳 嵌合体 -
利用红细胞Kidd血型基因实时荧光定量PCR法监测个体嵌合状态
本研究建立红细胞Kidd血型基因实时荧光定量PCR( RT-qPCR)技术以监测个体嵌合状态.根据红细胞Kidd血型等位基因的差异设计TaqMan MGB探针和特异性引物,进行实时荧光定量PCR检测个体嵌合状态,利用倍比稀释的方法模拟个体DNA嵌合状态并进行敏感性分析.结果表明,实时荧光定量PCR法可有效区分JK*A和JK*B等位基因.人工嵌合JK*A和JK*B的DNA标本实测值与理论值无显著差异(P＞0.05).在104个嵌合型细胞中存在156个供者型细胞时,该方法可有效检出供者型细胞.结论:建立的红细胞Kidd血型基因实时荧光定量PCR法检测嵌合体具有可行性,可以在一定范围内用于定量监测嵌合样本.
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MHC不相合的双份鼠胎血移植后受体鼠混合嵌合体形成
本室已经建立了MHC不相合单份鼠胎血同种移植的小鼠模型.基于脐血造血干细胞的免疫学特性及临床实践,我们认为脐血移植成功的关键除了选择尽可能相合的供者外,保证移植细胞的数量更为重要.因此,为了提高移植干细胞的数量,本研究在前期工作的基础上,探讨MHC不相合的双份鼠胎血混合移植的可能性.研究结果表明,混合移植组40只受鼠中有26只在60天的观察期内存活下来;应用PCR及流式细胞术均检测到受鼠体内有混合嵌合体的形成;此外,皮肤移植试验也发现受鼠已被诱导形成对供鼠的特异性免疫耐受;小肠组织的病理切片显示受鼠仅表现出轻度GVHD.结论:MHC不相合的双份鼠胎血能够同时植入,重建受鼠的免疫与造血系统,这为拓宽脐血的临床应用,使更多患者能够有机会接受脐血移植做了有益的尝试.
