胚胎发育早期神经上皮的显微移植技巧及应用

脊椎动物胚胎发育早期神经上皮的显微移植在运动神经元的轴突寻路、神经嵴细胞的迁移等研究中起非常重要的作用.本文以鸡胚、鸡胚-鹌鹑胚胎嵌合体为研究对象,摈弃了传统的神经上皮显微移植带来的移植失败、胚胎死亡及难以操作等缺点,总结近年来国外显微移植技术优缺点及作者的反复实验,从胚胎的预处理、显微操作针的制备,到神经上皮的显微移植等多方面详细探讨成功进行显微移植的方法和经验.为神经发育生物学,尤其是早期胚胎发育的神经干细胞迁移及轴突寻路的研究提供方法上的基础.

小鼠胚胎干细胞制备嵌合体的方法——聚合法初探

目的 利用胚胎干细胞株E14.1及新建立的C57BL/6J小鼠胚胎干细胞, 采用聚合法进行嵌合体的构建.方法 以E14.1及C57BL/6J干细胞为供体细胞,分为由5～10、 10～15、15～20、20～25个单细胞组成的干细胞团,分别与C57BL/6J及ICR的8～16细胞期胚胎细胞聚合共培养24 h再进行胚胎移植.结果 E14.1与C57BL/6J胚胎的聚合及 C57BL/6J与ICR胚胎的聚合均以10～15个单细胞组成的干细胞团产生的嵌合体效果好,分别得到嵌合体小鼠11只和5只,嵌合率分别为27.50%和16.13%.结论 使用聚合法成功构建嵌合体,为嵌合体的制备提供了一种简单易行的方法.

胚胎干细胞途径获得基因工程小鼠的原理与方法

胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell简称ES细胞)是从早期胚胎的内细胞团(Inner Cell Mass, MIS)分离出来的多潜能细胞系.它具有与胚胎细胞相似的形态特征及分化潜能.在饲养层上或含有白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)或分化抑因子(Differentiation inhibitory activity DIA)的培养基中培养时保持未分化状态,但在适当条件下被诱导分化.在这种细胞注入受体胚胎时,能参与各种组织器官发育,形成嵌合体[1～4].

巨噬细胞在混合嵌合体诱导异种免疫耐受中作用的实验研究

目的：研究巨噬细胞在建立非协调性异种混合嵌合体中的作用及混合嵌合体的形成对受体的免疫功能影响，探讨异种免疫耐受的机制。方法将非清髓性的预处理SD大鼠（受体）30只随机分成3组，A组（仅输注豚鼠BMC）；B组（豚鼠BMC移植组+空脂质体移植组）；C组（豚鼠BMC移植组+包裹clodronate脂质体移植组）。观察指标：大鼠肝脾CD68、嵌合体嵌合率、大鼠外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T检测、单向混合淋巴细胞反应。结果注射包裹clodronate脂质体后24h受体大鼠肝脾（红髓及边缘带）中巨噬细胞消失，21d后与正常对照相比无差异。BMC移植后24h内各时间点，C组大鼠外周血中豚鼠细胞比例均高于A、B组；24h时大鼠脾、骨髓中豚鼠细胞比例，C组亦明显高于A、B两组；比较21d及35d嵌合水平，C组明显高于A、B两组。21d时CD3+、CD4+和CD8+T细胞比例均下降，各组CD4/CD8比值与对照组相比无差异。MLR显示耐受大鼠的免疫应答反应性降低，C组较其他组比低。结论增加了供体BMC在受体体内的存活，从而提高嵌合水平，获得了更高水平的免疫抑制。

皮肤移植耐受及其机制的研究

目的探讨静脉注射异基因脾细胞(SC)和抗T细胞受体(TCR)αβ单克隆抗体加腹腔注射环磷酰胺(CP)诱导的成年小鼠异基因皮肤移植耐受及其形成的机制. 方法对C57BL/6(H-2b, B6)小鼠经尾静脉注射BALB/c小鼠(H-2d)脾细胞,2 d后腹腔注射CP,之后第2、4天分别经尾静脉注射抗小鼠-TCRαβ的单克隆抗体,然后进行皮肤移植.分组:(1)未处理B6小鼠,皮肤供者为BALB/c小鼠;(2)未处理B6小鼠,皮肤供者为KM小鼠;(3)SC+CP+抗TCRαβ单抗处理的B6小鼠,皮肤供者为BALB/c小鼠;(4)SC+CP+抗TCRαβ单抗处理的B6小鼠,皮肤供者为KM小鼠.每组各5只B6小鼠通过嵌合体检查、过继转移实验及外源白细胞介素2(IL-2)对耐受小鼠供体特异性混合淋巴细胞反应(MLR)的影响,探讨耐受形成的机制.采用成组t检验进行统计学分析. 结果 BALB/c小鼠的皮肤移植物在耐受B6小鼠中存活66.3 d,与各对照组比较,差异有显著意义(P<0.001),流式细胞分析仪分析结果表明,耐受小鼠胸腺和脾脏内均形成了微量混合嵌合体,耐受诱导后第15天、35天和第70天胸腺内供体来源细胞嵌合水平依次为2.67%,1.61%,0.47%,脾脏中依次为7.66%,5.99%,3.87%;体、内外细胞转移实验均未显示耐受小鼠脾细胞中存在抑制细胞活性;耐受小鼠供体特异的MLR受到抑制,3H-TdR掺入值为4 725 cpm±406 cpm,但外源IL-2的加入使掺入值增加到18 175 cpm±3 642 cpm(P<0.01),说明耐受小鼠MLR的抑制可被部分逆转. 结论嵌合体的形成和克隆不应答(anergy)是耐受形成的主要机制.

肾骨髓联合移植与嵌合体发生及急性排斥反应的关系

目的研究肾骨髓联合移植与嵌合体发生及急性排斥反应的关系.方法采用供体骨髓与肾脏联合移植,进行24例造血干细胞微嵌合体诱导,采用聚合酶链反应(PCR)技术检测受者嵌合状态,与单纯肾脏移植组37例比较嵌合发生率及急性排斥反应发生率.结果随访1年,肾骨髓联合移植组术后嵌合体发生率(87.5%,21/24)明显高于单纯肾脏移植组(40.5%,15/37),差异有显著意义(P﹤0.001);嵌合阳性组急性排斥反应发性率(19.4%,7/36)与嵌合阴性组(44%,11/25)相比差异有显著意义(P<0.05).结论肾骨髓联合移植可诱导嵌合体发生并增加受者对供体器官的免疫耐受,降低急性排斥反应发生率,嵌合现象与免疫耐受具有相关性.

B7反义肽预处理脾细胞诱导异基因嵌合体形成及延长移植物存活

目的尝试以B7-CD28/CTLA4为靶点,用B7反义肽(B7AP)预处理供者的脾细胞,免疫受者后结合输注供者骨髓细胞,诱导受体形成异基因嵌合体.方法每只用5×106/100 μl B7AP预处理的供者小鼠(C57BL/6)脾细胞免疫受者小鼠(BALB/c),诱导特异性同种低免疫应答反应;在此基础上每只受者小鼠输注供者骨髓细胞2×107/100 μl,诱导受者形成异基因嵌合体,以流式细胞术(FACS)连续动态监测嵌合状态的维持情况并用小鼠心肌移植模型研究移植物存活的影响因素. 结果在受者体内成功诱导出了特异性同种低免疫应答反应,应答水平只有正常未免疫组的43%(n=6, P<0.001);嵌合状态可以维持到100 d以上(n=6), 150 d时嵌合率仍有3.45%;嵌合小鼠进行同种异体小鼠心肌移植存活超过100 d(n=6),而对照组阿霉素组只能延长至16 d(n=6).结论 B7AP预处理小鼠脾细胞可诱导形成异基因嵌合体,并显著延长同种小鼠心肌移植存活的时间,为移植免疫的研究提供了一个简单易行的嵌合体平台技术,也为用B7AP在移植免疫中的应用进行了有益的尝试.

45，X/46，XY嵌合体性发育异常诊治进展

45，X/46，XY嵌合体性发育异常是临床上比较少见的疾病，其发生机制可能与Y染色体微缺失、Y染色体性别决定基因（SRY）或其他性别决定基因发生突变或调节异常有关。患者的临床表型特点主要为外生殖器及性腺发育异常、身材矮小伴或不伴Turner综合征相关表型异常。细胞及分子遗传学检查可明确诊断，外生殖器男性化评分、激素水平测定、影像检查、腹腔镜探查及性腺活检等对指导后续治疗具有重要意义。在患者的性别分配、激素补充治疗、是否行性腺切除、手术干预的时机及方式等方面仍有很多争议。多学科综合诊断及个体化的治疗原则虽已逐渐成为共识，还应更好地实施。

产前诊断中胎儿性染色体嵌合体的发生率及其妊娠结局

目的:分析妊娠中期产前诊断中胎儿性染色体嵌合体的发生率及其妊娠结局.方法:回顾性分析我院2016年1月-2017年12月10 341例羊水染色体核型分析的结果,进而分析35例性染色体嵌合体的临床结局.结果:妊娠中期通过羊水染色体核型分析的产前诊断病例中,性染色体嵌合体发生率为0.34％(35/10 341),主要涉及3种嵌合类型:45,X/46,XX嵌合(17例)、45,X/46,XY嵌合(8例)和45,X与其他异常核型嵌合(10例).在35例性染色体嵌合体中,产前诊断指征涉及无创提示性染色体数目异常、唐筛高风险、B型超声(B超)指标异常以及高龄,其终止妊娠率分别为86％(12/14)、83％(5/6)、75％(6/8)和29％(2/7).结论:当产前诊断检出胎儿性染色体嵌合体时,建议结合染色体微阵列技术、荧光原位杂交检测技术、胎儿脐血核型检测以及B超等结果进行综合分析,从而为产前的遗传学咨询提供更加科学准确的信息和依据.

产前诊断45,X和45,X嵌合体:细胞遗传学和临床评价的需求

胚胎植入前遗传学筛查的临床应用

随着辅助生殖技术和遗传学分析技术的发展，胚胎植入前遗传学筛查应用于胚胎染色体数目异常（非整倍体）检测，以期改善体外受精-胚胎移植的妊娠结局。新方法、新技术不断出现并应用于胚胎植入前遗传学筛查中，如囊胚期活检、比较基因组杂交技术、微阵列技术、第二代测序技术等，显著增加了诊断准确性，减少误诊风险。同时，胚胎植入前遗传学筛查的广泛应用也面临许多挑战。综述该领域的应用进展和面临的挑战。

嵌合体的动态定量检测在异基因造血干细胞移植中的应用

目的建立荧光标记的多重PCR扩增短串联重复序列(STR-PCR)结合毛细管电泳,定量检测供体细胞(DC)嵌合率的方法,并探讨该方法的连续定量检测对异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后转归的预警作用.方法采集31例接受骨髓移植(BMT)或非清髓外周血干细胞移植(NST)患者移植前、移植后不同时段的外周血或骨髓.DNA样本用ProfilerPlus商品化试剂盒扩增后,用ABI 310遗传分析仪进行毛细管电泳,确定基因位点及峰面积,根据供受体基因型的差异选择嵌合率计算公式.结果31例患者中15例(48.4%)为性别相合移植,只能通过STR-PCR进行嵌合体的定量分析;性别不合移植患者用STR-PCR和荧光原位杂交两种方法定量测得的DC嵌合率一致;31对供受体中能区别出供受差别的STR位点有6.7(2～10)个,所有患者均在移植后7天(+7天)出现供体来源的细胞,BMT组+7天、+14天和+1个月DC中位数均明显低于NST组,而在移植中后期无显著性差异.+21天时BMT和NST患者均达稳定嵌合,DC在92%以上;中位随访17(3.5～29.0)个月,26例患者DC≥90%,均获得持久植入,至今均为无白血病生存.另有5例患者出现不稳定混合嵌合(MC)状态(DC为27.3%～62.7%),其中4例复发,1例出现移植物被排斥.上述5例患者均在出现临床症状前发生DC下降;供体细胞完全嵌合(FDC)组移植物抗宿主病(GVHD)的发生率明显高于MC组.结论动态定量检测DC可用于移植动力学研究,对移植物早期植入或被排斥、本病复发以及GVHD均有预警作用,对实施临床干预治疗有指导价值.

母体内微量子代细胞嵌合体在HLA半相合造血干细胞移植中的意义

HLA不全相合的血缘关系移植解决了异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)的供者来源,但供受体间的HLA差异屏障限制了其广泛应用.近年来发现在妊娠结束后,部分母亲体内可以检测到长期存在的微量子代细胞(FMC).

染色体核型分析及短串联重复序列-聚合酶链反应检测非清髓异基因造血干细胞移植造血细胞嵌合体

非清髓异基因造血干细胞移植(NASCT)由于与传统的异基因造血干细胞移植(allo-SCT)植入方式不同,NASCT多通过建立稳定的嵌合体,逐渐过渡为供者植入[1].因此,NASCT后对植入状况的评估显得更为重要.为评估NASCT后植入状况,我们以传统的细胞遗传学分析结合我室新建立的短串联重复序列-聚合酶链反应(STR-PCR),对我院开展的15例NASCT患者进行了随访观察,现将结果报告如下.

嵌合体形成及其对产前筛查及诊断结果的影响

随着细胞分子生物学时代的来临,产前筛查和诊断方法也随之发生改变,更多的数据需要正确解读,这对产前诊断医生无疑是一项挑战.其中,染色体嵌合是影响产前筛查与诊断准确性的重要因素之一,受母亲、父亲以及胎盘等多种因素影响,人类普遍存在染色体嵌合,嵌合形成的主要原因是有丝分裂期染色体错误分离.受多种因素的影响,嵌合的临床表现对每个个体都具有唯一性.嵌合对产前筛查和诊断的影响主要为2个方面:①母血中胎儿游离细胞DNA(cell-free fetal DNA,cfDNA)筛查(无创产前筛查).虽然大量文献报道无创产前筛查对于21,18,13三体有较高的检出率,但由于其检测的母血中cfDNA来源于胎盘,并非真正的胎儿自身DNA,因此当发生胎盘局限性嵌合时会严重影响无创产前筛查结果的准确性.②绒毛染色体核型分析提示存在嵌合时需要行羊膜腔穿刺进行验证.总之,正确认识染色体嵌合的起源、机制和临床结果,可以为病人提供更多有价值的遗传信息,是做好产前筛查与诊断工作并提供遗传咨询的重要前提.

嵌合与移植免疫耐受研究进展

特异性移植免疫耐受是指在不使用免疫抑制剂的情况下,受者对供者抗原产生特异性免疫无反应,而同时又保持对除移植物以外的非己抗原的正常免疫应答能力.毫无疑问,诱导受者产生针对移植物的免疫耐受是彻底解决器官移植排斥反应问题的理想措施.在诸多耐受诱导研究中,诱导受者建立嵌合体似乎是接近临床可能的方法.嵌合体是指来源于供者的异基因背景的细胞在受者体内长期存在的状态.尽管在天然嵌合体是移植耐受的"因"还是"果"的问题上还存在争议,但已有越来越多的动物实验和临床研究证实诱导受者建立嵌合体可以明显延长移植器官的存活时间.因此,人们试图从嵌合体的研究中获得免疫耐受诱导的突破,本文就这方面的有关进展综述如下.

重组蓖麻毒素与相思子毒素B链嵌合体蛋白的制备与分析

[目的]观察蓖麻毒素(ricin toxin,RT)、相思子毒素(abrin toxin,AT)B链的嵌合体蛋白原核表达并分析其抗原性和毒性.[方法]利用柔性linker-(G4S)3连接两个毒素B链基因(RTB和ATB),优化嵌合体基因RTB-ATB后构建表达质粒pQE80L-RTB/ATB,转化至E.coli M 15获得表达工程菌株,并对诱导表达条件和纯化条件进行优化;通过Western印迹检测RTB-ATB的抗原性;采用人正常肺上皮细胞Beas-2B和胃黏膜细胞GES-1进行嵌合体蛋白的细胞毒性实验.[结果]RTB-ATB全长1 647bp,编码549个氨基酸残基;E.coli M15在诱导条件为30℃、1 mmol/L IPTG,3h后获得包涵体形式表达的目的蛋白,相对分子量约为60×103 Da,经Ni柱纯化后纯度达98.9％;Western blotting印迹结果表明嵌合体蛋白保持RTB和ATB原有各自的抗原性;MTS实验结果表明目的蛋白无毒性.[结论]嵌合体蛋白RTB-ATB实现高表达,具有良好的抗原性,为研制针对RT和AT的双价疫苗奠定基础.

染色体病知识问答(五)

在前几期,我们已经介绍了染色体比较常见的结构异常,如染色体的断裂、易位、缺失、等臂以及环状染色体等,对其相对应的临床症状和体征也有了一定程度的了解.本期我们重点介绍一下嵌合体.

卡氏小鼠的研究动态

卡氏小鼠是一种典型的野栖小鼠,在国外主要分布于东南亚的日本琉球和冲绳群岛,在中国主要分布于台湾、海南、福建、贵州、云南及广西等地.国内对卡氏小鼠的专门研究较少,国外对卡氏小鼠的分类、地理分布、近缘杂交和嵌合体等方面曾有研究.本文结合所检索到的国内外文献,对卡氏小鼠的分类、形态鉴别特征、近缘杂交和嵌合体、地理分布和防治策略等进行综述.

非清髓性异基因造血干细胞移植后血细胞特异嵌合体检测

造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)作为许多血液系统疾病、免疫缺陷病及其他非恶性疾病治疗的重要措施,而传统的HSCT却未能推广实行,与其受到髓源缺乏,排斥反应(如graft-versus-host-disease,GVHD等)、供受体年龄、易复发等诸多因素影响有关.