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腾冲县人旋毛虫血清流行病学调查
腾冲县位于云南省的西部,热带季风气候,具有四季不分明的特点,年平均气温15.1℃,是一个多民族的县,各民族饮食习惯不相同.
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朝鲜边民携带入境狗肉旋毛虫感染情况调查
[目的]调查了解集安口岸朝鲜边民携带入境狗肉旋毛虫感染情况,为预防控制旋毛虫病提供依据. [方法]采制入境狗肉样,按文献[4]方法检验,并对寄生部位进行统计.[结果]7只白条狗阳性2只,阳性率28.5%.隔肌部位感染率高,为71%.[结论]检验结果表明,入境人员携带感染旋毛虫的狗肉入境,无疑会增加旋毛虫病的国际间传播的机会.为防止人感染旋毛虫,须加强卫生宣传,加强口岸查验和肉品卫生检验.
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旋毛虫各分离株某些生物学特性的研究
通过对猪、犬旋毛虫和国际标准分离株:旋毛形线虫(Trichinel la spiralis)和本地毛形线虫(Trichinella nativa)的研究发现,猪旋毛虫和旋毛形线虫在小鼠膈肌中出现保姆细胞的时间比较早,分别于感染第16天和18天出现,第38天和36 天所有幼虫都已形成保姆细胞,而犬旋毛虫和本地毛形线虫出现保姆细胞的时间较晚,于感染第20天和22天出现,第32天完全形成.猪旋毛虫和旋毛形线虫雌虫体外培养24h平均产新生幼虫数分别为66.0和76.2,而犬旋毛虫和本地毛形线虫分别是28.8和22.0,前二者在雌虫体外产新生幼虫能力上明显高于后二者.研究结果表明,黑龙江猪旋毛虫为旋毛形线虫 ,犬旋毛虫为本地毛形线虫.
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旋毛虫Ts87重组蛋白诱导的小鼠黏膜免疫保护性研究
本实验探讨旋毛虫Ts87重组蛋白灌胃免疫小鼠诱导的黏膜免疫保护性作用.实验分对照组、佐剂组(霍乱毒素B亚单位组,CTB)和免疫组(CTB+Ts87重组蛋白),灌胃免疫,间隔1周共免疫3次.末次免疫后第7天用400条旋毛虫感染期幼虫攻击,比较3组小鼠肠道成虫数、雌虫生殖力和肌幼虫数.且于末次免疫后第7天刮取肠黏液、取血检测特异性sIgA、IgG抗体水平.结果显示免疫组小鼠成虫减虫率、新生蚴减虫率、肌幼虫减虫率分别是81.34%、67.02%、84.49%;小鼠肠黏液sIgA水平及血清IgG水平显著高于对照组和佐剂组.结果表明Ts87重组蛋白黏膜免疫能够诱导小鼠产生抗旋毛虫的保护性免疫.灌胃免疫能显著提高肠黏液特异性sIgA水平,对促进肠道成虫的排出有明显作用.
关键词： 旋毛虫 黏膜免疫 重组蛋白 霍乱毒素B亚单位(CTB) IgA -
旋毛虫感染不同时期对小鼠胶原诱导性关节炎影响的差异性观察?
观察旋毛虫感染的不同阶段对小鼠胶原诱导性关节炎（ Collagen?Ⅱ induced arthritis， CIA）的影响并初步探讨其机制。建立雄性DBA／1小鼠胶原（CⅡ）诱导性关节炎（CIA）模型，以旋毛虫肌幼虫（400条／只）分别于造模前14 d、造模当天感染小鼠。关节评分评价足爪关节病变的发生及严重程度。于胶原首次诱导后第50 d处死小鼠，取足爪关节切片观察组织病理学变化； ELISA检测血清抗CⅡ特异性IgG、IgG1、 IgG2a水平；分离脾淋巴细胞以ConA刺激培养， ELISA检测培养上清中IFN?γ、 IL?4、 IL?10、 IL?17和TNF?α细胞因子水平。结果显示，与单纯CIA造模组相比，预先14 d感染旋毛虫的CIA小鼠关节炎发病率、关节评分及组织学评分均显著降低，血清IgG1水平则显著升高，脾细胞培养上清Th2型细胞因子IL?4和调节性细胞因子IL?10水平显著增加。而造模当天感染旋毛虫的CIA小鼠关节评分和组织学评分显著升高，血清IgG2a水平显著升高，细胞培养上清Th1型细胞因子IFN?γ和促炎细胞因子IL?17、 TNF?α水平显著升高，且差异具有统计学意义。该结果表明，旋毛虫感染早期可加重胶原诱导性小鼠关节炎，而感染后期则对关节炎有一定抑制作用，提示旋毛虫对小鼠胶原诱导性关节炎的影响作用因感染时限的不同而存在差异，且该差异可能与不同感染时期诱导的Th反应类型的变化有关。
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旋毛虫副肌球蛋白在BaculoDirect昆虫杆状病 毒表达系统中的表达及鉴定
利用BaculoDirect昆虫杆状病毒表达系统表达重组旋毛虫副肌球蛋白(recombinant Trichinella spiralis paramyosin,rTsPmy),以获得生物学活性较好的重组蛋白.通过PCR和DNA重组方法构建含TsPmy基因的Gateway入门载体重组质粒pDONR221(pDONR221/TsPmy),经测序鉴定后,扩增重组质粒;利用重组质粒pDONR221/TsPmy和BaculoDirect线性杆状病毒进行Gateway DNA重组反应,构建重组病毒,用其直接感染昆虫细胞Sf9使得重组病毒具有感染活力;连续感染Sf9以扩增病毒,利用滴度较高的病毒感染Sf9进行rTsPmy表达;SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定表达的重组蛋白rTsPmy.结果显示,重组质粒经测序鉴定显示序列正确;SDS-PAGE及Western blotting显示rTsPmy分子量大小约110 kDa,未见不完全表达;可溶性分析显示rTsPmy部分可溶,大部分为不可溶沉淀;Western blotting结果显示rTsPmy可被旋毛虫感染的小鼠和猪抗血清识别,具有抗原特异性.本研究首次利用BaculoDirect昆虫杆状病毒表达系统成功表达了rTsPmy,获得翻译后修饰更加完善、 纯化效果更好的重组蛋白,对于进一步研究TsPmy的功能,为制备有效的旋毛虫病疫苗候选抗原分子提供了生物学基础.
关键词： 旋毛虫 副肌球蛋白 昆虫杆状病毒表达系统 表达和鉴定 抗原性 -
旋毛虫Ts87抗原单克隆抗体的制备及其识别肽段的研究
将原核系统成功表达的Ts87重组蛋白纯化后免疫动物,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗Ts87抗原的单克隆抗体.通过ElISA、免疫印迹、免疫组化等方法筛选出能分泌抗Ts87御抗原的抗体的阳性克隆,在1000个融合的杂交瘤细胞中,有3株融合细胞分泌的单克隆抗体(2A2,5A3,6G12)鉴定结果为阳性.这3株融合细胞分泌的抗体均能识别Ts87重组蛋白、旋毛虫成虫和幼虫的Ts87抗原以及旋毛虫幼虫组织切片.获得的抗Ts87抗原的单克隆抗体在将来的研究中可作为旋毛虫病的诊断试剂.为了进一步鉴定抗体识别的相应抗原表位和模拟抗原表位,选择了其中一株单克隆抗体5A3筛选噬菌体十二肽库.噬菌体M7展示的肽段是抗体识别Ts87抗原的线性表位,其他的噬菌体克隆展示的肽段是Ts87抗原的模拟表位.该技术为旋毛虫病多表位疫苗的构建奠定了基础.
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旋毛虫成虫可溶性虫体蛋白对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠急性结肠炎的影响
本文探讨旋毛虫成虫可溶性虫体蛋白(Soluble adult proteins,SAP)对葡聚糖硫酸钠(Dextran sulphate sodium,DSS)诱导的C57 BL/6小鼠结肠炎的影响.将36只小鼠随机均分为3组:对照组(PBS 组)、肠炎组(PBS+ DSS组)、虫体蛋白治疗组(SAP+ DSS组).小鼠连续饮用3％DSS溶液7d诱发急性肠炎,对照组给予双蒸水.诱发肠炎的同时,治疗组每天经腹腔注射25μg虫体蛋白,肠炎组注射PBS.每天观察对照组和实验组小鼠的临床表现,并进行临床疾病活动指数(DAI)评分.第7d将小鼠处死,观察结肠肉眼或大体病变及组织病理改变.同时提取小鼠脾淋巴细胞和肠系膜淋巴结细胞,用酶联斑点免疫试验检测细胞因子水平.结果显示,与肠炎组相比,虫体蛋白治疗组的小鼠肠炎症状明显缓解,结肠病理变化较轻,脾淋巴细胞和肠系膜淋巴结细胞的Th1型细胞因子IFN-γ分泌水平下降,Th2型细胞因子IL-4和调节性细胞因子IL-10分泌水平显著升高.表明旋毛虫可溶性成虫虫体蛋白对DSS诱导的C57BL/6小鼠结肠炎有缓解作用.
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旋毛虫Ts87重组蛋白诱发小鼠保护性免疫的研究
为了进一步探讨旋毛虫Ts87基因原核表达重组蛋白的保护性免疫作用,本试验用此纯化重组蛋白组分加福氏完全佐剂(FCA)皮下注射免疫NIH小鼠3次,继以旋毛虫感染性幼虫250条攻击,攻击后每周取血清测抗体IgG滴度,第35天计数小鼠肌肉幼虫数.结果显示重组蛋白免疫鼠的肌肉幼虫减虫率为42.3%,血清抗Ts87重组蛋白体IgG的几何平均倒数滴度(GMRT)达到8 000以上,均显著高于佐剂组和对照组.Ts87基因表达的重组蛋白可产生明显的保护性免疫作用.
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抗旋毛虫病Ts87 DNA疫苗滴鼻初免—蛋白疫苗加强免疫策略增强免疫保护应答
为优化抗旋毛虫病核酸疫苗免疫策略,本文探讨了Ts87 DNA疫苗滴鼻初免与蛋白疫苗皮下注射加强免疫诱导产生的保护效果及免疫应答特征.分别在第0d以旋毛虫Ts87 DNA疫苗SL7207/pVAX1-Ts87滴鼻初免,第14/28 d以蛋白疫苗rTs87皮下注射加强免疫小鼠,在第35 d攻击感染旋毛虫肌幼虫,第84 d剖杀小鼠,计算减虫率观察免疫保护效果;进行小鼠血清中特异性IgG抗体效价、抗体亚型分析及肠道盥洗液sIgA水平分析,检测脾淋巴细胞增殖反应、脾及颈部淋巴结细胞分泌细胞因子水平.结果显示,DNA疫苗滴鼻初免—重组蛋白加强的联合免疫组的保护作用优于单独DNA疫苗滴鼻及单独重组蛋白免疫组,显著提高了减虫率(46.1％);DNA疫苗滴鼻初免和蛋白疫苗加强免疫方式不仅诱导小鼠产生了粘膜免疫应答,同时也诱导了有效的细胞和体液免疫应答,其免疫应答类型是以Th2型为主的混合型Th1/Th2免疫反应.该研究为新型抗旋毛虫病疫苗接种策略的优化提供了实验依据.
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阿苯哒唑对旋毛虫囊包幼虫作用的组织学与组织化学观察
应用组织学与组织化学方法观察阿苯哒唑对旋毛虫囊包幼虫的形态结构、某些酶活性及核酸含量的变化.实验结果表明,阿苯哒唑可导致囊包变形,其周围以嗜酸性粒细胞为主的炎细胞增生;囊内幼虫虫体皱缩、出现空泡;并使虫体三磷酸腺苷酶(ATPase)、非特异性酯酶(NSE)活性降低及脱氧核糖核酸(DNA)含量减少.细胞色素氧化酶(CCO)的活性无明显变化.进一步证实该药可损伤囊包幼虫虫体结构、干扰虫体有关酶类的活性减少DNA的含量,影响其营养代谢和能量代谢而影响其生存.
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应用噬菌体随机十二肽库筛选旋毛虫Ts87蛋白抗原表位
以抗旋毛虫Ts87蛋白单克隆抗体2A2作为靶标,对噬菌体展示随机十二肽库进行筛选.通过ELISA鉴定筛选克隆的结合特性,并对阳性克隆提取DNA进行测序分析.结果显示,经3轮生物淘洗后,目标噬菌体得到433倍富集.随机挑选20个克隆进行ELISA鉴定,其中有18个噬菌体克隆可以与单抗2A2特异性结合.测序分析发现,这18个克隆带有4种氨基酸序列,分别为:TPHPHIFYREAS、DWKAWTQMLDSY、WQIEYFrLHSLW和VSPHEYWSEL.经比对未发现这4种序列与Ts87蛋白序列有明显同源性.将这4株噬菌体克隆扩增后,经Western-blot鉴定均可被单抗2A2识别.结果表明本次筛选鉴定得到的4个噬菌体展示肽可能是旋毛虫 Ts87蛋白的模拟抗原表位.
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旋毛虫Hsp70与Ts87融合蛋白的构建表达及鉴定
本文构建并表达了旋毛虫热休克蛋白70（Ts－Hsp70）与排泄分泌抗原Ts87的融合蛋白，并对融合蛋白进行纯化和免疫学鉴定。本研究采用限制性内切酶EcoRⅠ酶切位点将目的基因Ts－Hsp70与Ts87相连接，插入pET28－a （＋）质粒，转入大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达、纯化，获得的融合蛋白rTs－Hsp70－Ts87用Western blot的方法鉴定。经PCR、酶切鉴定、测序分析，结果显示，目的基因片段大小为2721 bp，构建的重组质粒与预期相符。经IPTG诱导表达，通过镍离子柱层析纯化复性后得到可溶的融合蛋白rTs－Hsp70－Ts87，其相对分子质量约为100 kDa； Western blot结果显示，该蛋白可被抗His标签单抗、 rTs－Hsp70免疫血清、 rTs87免疫血清识别。以上结果表明，本研究成功构建并表达了融合蛋白rTs－Hsp70－Ts87，为进一步研究rTs－Hsp70－Ts87的免疫保护性，开发新的有效抗旋毛虫病的疫苗奠定基础。
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应用RNA干扰技术对旋毛虫Ts87基因功能的初步研究
为研究旋毛虫Ts87基因的功能,通过RNA干扰途径抑制目的基因的表达.针对Ts87基因序列设计并合成特异性dsRNA、siRNA,通过浸泡方式分别将dsRNA、siRNA导入肌幼虫体内,利用实时荧光定量PCR分析Ts87基因及旋毛虫管家基因GAPDH的表达.此外,测定RNA干扰作用下的肌幼虫体外存活率的变化.根据实时荧光定量P(=R结果,dsRNA及siRNA均能有效抑制Ts87基因mRNA的表达.此外,两种RNA能够在一定程度上降低肌幼虫体外存活率.实验表明,RNA干扰技术能够有效抑制旋毛虫功能基因Ts87表达,从而为研究旋毛虫基因的功能提供一种新的有效途径.
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肺癌细胞A549抗原相关旋毛虫Tsp06172基因的克隆及原核表达
目的 克隆旋毛虫(Trichinella spiralis)与肺癌细胞A549相关抗原Tsp06172基因,并进行原核表达. 方法 采用RT-PCR方法扩增Tsp06172基因,连接原核表达载体pET-28a,转化入感受态细胞BL21,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物. 结果 重组表达质粒经双酶切及测序鉴定正确.表达分子质量单位约为16 ku的融合蛋白.Western blot检测融合蛋白能被抗A549细胞的多克隆抗体识别. 结论 构建的原核表达载体pET-28a Tsp06172表达具有A549细胞反应原性的蛋白,为旋毛虫Tsp06172重组蛋白功能的研究了奠定基础.
关键词： 旋毛虫 Tsp06172基因 原核表达 肺癌细胞A549 -
旋毛虫肌幼虫ESP与自身免疫性疾病相关蛋白组分分析
目的 分析旋毛虫(Trichinella spiralis)肌幼虫(muscle larvae)排泄分泌蛋白(excretory-secretory Protein,ESP)组分,寻找其与自身免疫性疾病相关蛋白. 方法 采用胃蛋白酶消化法收集旋毛虫脱囊肌幼虫,提取旋毛虫肌幼虫ESP,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后酶解,采用液质联用质谱法(LC-MS/MS)对其进行成分分析,利用(gene ontology,GO)法对所有蛋白从细胞组分、分子功能和生物过程进行分类. 结果 SDSPAGE电泳分析ESP蛋白组分分子质量单位(Mr) (10～142)×103.经LC-MS/MS鉴定,共获得162种蛋白质,包括63种已鉴定蛋白质,65种未鉴定蛋白质,34种假定蛋白质.有5种蛋白质(即脱氧核糖核酸酶Ⅱ、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、原肌球蛋白、真核起始因子4A)与自身免疫性疾病有关.GO富集分析显示,已鉴定的参与细胞组分、分子功能和生物过程. 结论 旋毛虫肌幼虫ESP蛋白成分复杂,从已知的蛋白质中初步筛选出5种与自身免疫性疾病相关的潜在蛋白.
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辛酸-硫酸铵法在纯化血清旋毛虫特异性IgG抗体中的应用
目的 从旋毛虫感染的大鼠和兔血清中纯化抗旋毛虫IgG抗体. 方法 分别用辛酸-硫酸铵法(CA-AS)、硫酸铵沉淀法(AS)纯化旋毛虫感染的大鼠和兔血清中抗旋毛虫IgG抗体. 结果 IgG抗体纯化率CA-AS法为80.05%～83.22%,AS法为67.00%～71.08%;得率CA-AS法为7.85～8.79 mg/ml,AS法为12.04～12.12 mg/ml;回收率CA-AS法为52.55%～55.03%,AS法为61.36%～64.87%.CA-AS法得率和回收率均低于AS法,但纯化率高于AS法.ELISA法测定CA-AS法和AS法纯化的抗体效价不变. 结论 CA-AS法是一种简便﹑快速﹑有效的纯化血清IgG抗体的方法,可用于大鼠和兔血清抗旋毛虫IgG抗体的纯化.
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旋毛虫幼虫侵入小鼠肠上皮细胞后细胞蛋白变化的研究
目的 观察旋毛虫幼虫侵入前后小鼠肠上皮细胞蛋白的变化,筛选幼虫侵入相关蛋白.方法 将旋毛虫感染性幼虫接种至小鼠小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs)单层,于37℃5％ CO2条件下培养2h,提取细胞蛋白,进行SDS-PAGE与Western blot分析,并与正常IECs细胞蛋白比较.结果 SDS-PAGE分析表明,IECs与感染性幼虫共孵育后的IECs蛋白带数为44条,与正常IECs对照组的相同;Western blot显示,正常IECs蛋白不能被旋毛虫感染鼠血清识别,与幼虫共孵育后的IECs蛋白有16个组分带能被旋毛虫感染鼠血清识别,分子质量单位分别为125、118、106、98、70、64、50、47、46、40、34、33、31、29、27、26 ku.结论 小鼠IECs与旋毛虫幼虫共培养可产生能被旋毛虫感染鼠血清识别的细胞蛋白,该组蛋白可能是旋毛虫侵入相关蛋白.
关键词： 旋毛虫 侵入相关蛋白 肠上皮细胞 Western blot -
旋毛虫在小鼠中繁殖力指数的比较和分析
目的 比较、分析旋毛虫8个种和4个基因型在小鼠中的繁殖力指数的差异,为旋毛虫虫种鉴定提供重要的实验数据. 方法 以BALB/c小鼠为动物模型,分别感染12个旋毛虫国际标准虫株,感染40 d后剖杀,采用镜检和消化法收集肌幼虫,镜下观察幼虫形态并计算各虫株的繁殖能力指数(RCI)和每克肌肉幼虫数(LPG);采用统计学方法比较和分析旋毛虫不同种及基因型在小鼠中RCI值的差异. 结果 镜下观察8个种及4个基因型虫体形态存在明显差异,有包囊的旋毛虫虫株很容易观察到包囊,而无包囊的旋毛虫虫株则观察不到明显的包囊;在膈肌中大多数呈卷曲式,少数呈伸展条状;消化后各种肌幼虫的形态也有所不同,包括卷曲程度、活动状况、虫体大小等;用消化液原液计数所得出的RCI值与文献报道值存有偏差;首次获得T8和T9的RCI值,分别是43.8±7.98和125.6±11.22. 结论 已知旋毛虫12个国际标准虫株在小鼠中的RCI数值不同,可供旋毛虫虫种鉴定参考.
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嗜中性粒细胞及单核细胞介导的细胞毒效应在旋毛虫病免疫机理中的作用
目的 探讨嗜中性粒细胞(Neutrophil,Neu)、单核细胞(Monocyte,Mon)介导的细胞毒效应在旋毛虫病免疫机理中的作用.方法 采用ELISA检测总IgE、特异性IgE、总IgG和特异性IgG,然后取IgE和IgG高检测值时相的血清为免疫血清,以CO2培养法观察免疫血清对Neu、Mon杀伤旋毛虫肌幼虫的影响.结果 大鼠感染旋毛虫后2周和3周,血清特异性IgE高,感染后5周,特异性IgG阳性率高.在免疫血清存在时,无论感染鼠还是正常鼠的Neu和Mon对旋毛虫幼虫均有很强的杀伤作用,但感染鼠Neu的作用更强.孵育48 h时,Neu和Mon对旋毛虫肌幼虫的杀伤率分别为42.1%和23.0%.结论 大鼠感染旋毛虫后,血清总IgE与特异性IgE、总IgG与特异性IgG同步增加;在免疫血清存在的情况下,Neu和Mon均有杀伤旋毛虫肌幼虫的作用,但感染鼠Neu的作用更强;Neu和Mon发挥杀伤旋毛虫肌幼虫作用时主要依赖的是IgG.
