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采用噬菌体展示技术筛选黄曲霉毒素B1模拟抗原表位
目的 从随机肽库中筛选黄曲霉毒素B1模拟抗原表位,以建立无需黄曲霉毒素B1偶联抗原的免疫学检测方法.方法 利用噬菌体展示技术,以抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体为靶分子,从随机七肽库中进行生物亲和淘选,ELISA鉴定阳性克隆,通过DNA测序对每个阳性克隆进行定性分析.结果 通过4轮结合/扩增循环,获得了能与抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体结合的肽,采用间接竞争ELISA,筛选到了4株能抑制黄曲霉毒素B1的职性克隆子,经DNA测序得到HXXDPXH共有序列,其中X为任意氨基酸.以其中P10噬菌体阳性克隆建立竞争ELISA方法,线性范围为500～2000 pg/ml,检测下限为50pg/ml.结论 利用噬菌体展示技术筛选到了黄曲霉毒素B1模拟抗原表位,并以其代替黄曲霉毒素B1偶联抗原建立了免疫学检测方法.
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噬菌体展示肽库筛选赭曲霉毒素A模拟表位的研究
目的从噬菌体随机肽库中筛选模拟赭曲霉毒素A表位的噬菌体粒子,并以其替代毒素建立免疫学检测方法.方法以抗赭曲霉毒素A的单克隆抗体为配基,免疫亲和筛选以融合蛋白形式表达在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ上的随机七肽库,以ELISA方法鉴定阳性克隆,同时进行DNA测序确定插入七肽的氨基酸序列.结果经过4轮淘选,共筛选到11株能与该抗体特异性结合的阳性克隆,且该结合能被赭曲霉毒素A阻断,模拟表位的共有序列为IRPMVXX,X为任意氨基酸.以其中的P2号克隆建立了竞争ELISA检测方法,线性范围为200～8000pg/ml,检测下限为150pg/ml.结论噬菌体展示技术可成功筛选到赭曲霉毒素A模拟表位,筛选到的噬菌体粒子可作为毒素的替代品建立免疫学分析方法.
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应用随机肽库筛选展示河豚毒素模拟表位噬菌体
目的 利用噬菌体随机肽库筛选展示河豚毒素(TTX)模拟抗原表位的噬菌体,并以其替代毒素建立免疫学检测方法.方法 以抗TTX单克隆抗体为靶分子,从以融合蛋白形式表达在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ表面的随机七肽库中进行生物亲和淘选,用ELISA法鉴定阳性克隆.结果 通过4轮淘选,获得了7株能与抗TTX单克隆抗体特异性结合的噬菌体,采用间接竞争ELISA,筛选到3株能抑制TTX的阳性克隆.其中以4号噬菌体建立的免疫检测方法,线性范围为1-20ng/ml(TTX毒素浓度),R2=0.9947,检测下限为1ng/ml.结论 从噬菌体七肽库筛选到了展示TTX模拟抗原表位的噬菌体,淘选出来的噬菌体粒子可作为毒素的替代品用于免疫学检测.
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高致病性禽流感病毒血凝素蛋白广谱中和表位模拟肽的筛选与鉴定
以H5N1型禽流感病毒HA蛋白广谱中和单抗8H5为基础,利用噬菌体展示肽库技术及类病毒颗粒融合表达技术研究HA模拟表位.ELISA检测结果显示:筛选获得模拟HA表位的模拟肽123,进行类病毒颗粒融合蛋白表达后,仍具有与8H5单抗特异结合的能力.免疫荧光检测结果说明,类病毒颗粒免疫小鼠后产生了能与HA交叉反应的抗体.禽流感病毒HA模拟表位的研究与性质的分析及类病毒颗粒融合蛋白的表达与活性分析、免疫原性分析,都为研制禽流感通用表位疫苗奠定了基础.
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旋毛虫Ts87抗原单克隆抗体的制备及其识别肽段的研究
将原核系统成功表达的Ts87重组蛋白纯化后免疫动物,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗Ts87抗原的单克隆抗体.通过ElISA、免疫印迹、免疫组化等方法筛选出能分泌抗Ts87御抗原的抗体的阳性克隆,在1000个融合的杂交瘤细胞中,有3株融合细胞分泌的单克隆抗体(2A2,5A3,6G12)鉴定结果为阳性.这3株融合细胞分泌的抗体均能识别Ts87重组蛋白、旋毛虫成虫和幼虫的Ts87抗原以及旋毛虫幼虫组织切片.获得的抗Ts87抗原的单克隆抗体在将来的研究中可作为旋毛虫病的诊断试剂.为了进一步鉴定抗体识别的相应抗原表位和模拟抗原表位,选择了其中一株单克隆抗体5A3筛选噬菌体十二肽库.噬菌体M7展示的肽段是抗体识别Ts87抗原的线性表位,其他的噬菌体克隆展示的肽段是Ts87抗原的模拟表位.该技术为旋毛虫病多表位疫苗的构建奠定了基础.
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应用噬菌体随机十二肽库筛选旋毛虫Ts87蛋白抗原表位
以抗旋毛虫Ts87蛋白单克隆抗体2A2作为靶标,对噬菌体展示随机十二肽库进行筛选.通过ELISA鉴定筛选克隆的结合特性,并对阳性克隆提取DNA进行测序分析.结果显示,经3轮生物淘洗后,目标噬菌体得到433倍富集.随机挑选20个克隆进行ELISA鉴定,其中有18个噬菌体克隆可以与单抗2A2特异性结合.测序分析发现,这18个克隆带有4种氨基酸序列,分别为:TPHPHIFYREAS、DWKAWTQMLDSY、WQIEYFrLHSLW和VSPHEYWSEL.经比对未发现这4种序列与Ts87蛋白序列有明显同源性.将这4株噬菌体克隆扩增后,经Western-blot鉴定均可被单抗2A2识别.结果表明本次筛选鉴定得到的4个噬菌体展示肽可能是旋毛虫 Ts87蛋白的模拟抗原表位.
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噬菌体展示肽库技术及其应用研究现状
噬菌体展示技术是将随机多肽文库表达于丝状噬菌体的表面,筛选功能性多肽的一种生物技术.该技术在抗原表位定位、免疫学诊断、疫苗研制、药物筛选等方面具有重要用途.
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应用噬菌体展示肽库筛选生殖支原体黏附蛋白的模拟表位
目的 利用纯化的兔抗重组生殖支原体黏附素蛋白(rMgPa)的多克隆抗体(pAb)从噬菌体展示随机12肽库筛选MgPa的模拟表位.方法 用纯化的兔抗rMgPa的pAb对噬菌体随机12肽库进行生物淘洗,随机挑取噬菌体克隆进行DNA测序与分析,并用MIMOX对噬菌体克隆所展示的肽序列进行生物信息学分析.用ELISA、竞争性结合试验和Western blot检测噬菌体与pAb结合的特异性.结果 4轮生物淘洗后特异性噬菌体克隆得到了明显的富集.依据氨基酸组成的不同,74个噬菌体克隆所展示的肽序列可大致分为3组.经对肽序列进行比较分析以及用MIMOX进行生物信息学分析,结果表明这3组的核心序列分别为:P-S-A-A/V-X-R-F/W-E/S-L-S-P、A-K-I/L-T/Q-X-T-L-X-L和K-S-L-S-R-X-D-X-I.ELISA、竞争性结合试验和Western blot方法检测的结果表明噬菌体能与pAb发生特异性结合,说明其可能是MgPa的模拟表位.结论 成功筛选到MgPa的3个可能的模拟表位,为研制基于Mg抗原表位的诊断试剂与多肽疫苗奠定了一定的实验基础.
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基孔肯雅病毒中和表位的筛选及表达
目的:寻找基孔肯雅病毒中和表位,并将其表达为重组融合蛋白.方法:对噬菌体展示12肽库进行了生物淘洗,随机挑取噬菌体克隆,使用 ELISA方法筛选并鉴定阳性克隆,分析阳性克隆的DNA序列,将其翻译成氨基酸序列进行同源性比较.将其中一个表位连同M13噬菌体PⅢ蛋白结构域Ⅰ～Ⅱ的编码序列用PCR技术扩增后插入原核表达载体pQE30,用IPTG诱导融合蛋白表达.结果与结论:从经过3轮淘洗的噬菌体中随机挑选123个克隆,从中筛选到20个阳性克隆,其中包含7种不同的氨基酸序列,这些序列缺乏同源性,表明该单抗表位应为构象型表位.在室温培养条件下成功地在大肠杆菌周质腔表达了一种可溶性的表位融合蛋白,经亲和层析得到了纯化的表位融合蛋白.
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从噬菌体随机七肽库中筛选hERG钾通道亲和肽的研究
目的 获得与hERG钾通道特异性结合的功能性亲和肽.方法 以hERG1a亚基第3个细胞外环(L3)为靶蛋白分子,对噬菌体随机七肽库进行亲和筛选,ELISA法检测噬菌体克隆与靶蛋白的亲和性,使用全自动膜片钳技术观察亲和肽的活性.结果 与结论经过3轮亲和筛选后,随机挑选15个噬菌体克隆对其亲和性做ELISA鉴定,均显示较强的阳性结果.将上述阳性克隆进行DNA测序得到3种不同小肽序列.电生理学研究表明,合成的3个小肽均能显著抑制hERG钾电流,为靶向hERG钾通道抗肿瘤研究提供了新的研究思路.
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脱氧雪腐镰刀菌烯醇七肽模拟表位淘选及应用
目的 从噬菌体随机七肽库中淘选脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的模似表位,并以之替代人工抗原建立ELISA检测方法.方法 利用抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体12D1,从噬菌体随机七肽库中淘选到脱氧雪腐镰刀菌烯醇七肽模似表位,七肽模拟表位氨基酸序列为CMRPWLQ.以含有DON七肽模拟表位的噬菌体替代DON人工抗原建立DON间接竞争ELISA检测方法,检测范围为20～400 ng/ml,并应用于小麦、玉米样品中DON含量的检测.结果 检测结果与德国r-Biopharm公司DON检测试剂盒差异无统计学意义.结论 DON噬菌体模拟表位替代DON人工抗原建立的ELISA检测方法可应用于小麦和玉米样品中DON的检测.
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模拟金黄色葡萄球菌脂磷壁酸表位的初步筛选与鉴定
目的：利用噬菌体展示肽库技术筛选并鉴定可模拟金黄色葡萄球菌细胞壁脂磷壁酸（LTA）的表位。方法：以抗LTA 单抗为靶分子，采用液相法对噬菌体12线性肽库进行3轮淘选，夹心ELISA 鉴定噬菌体克隆。对阳性噬菌体克隆进行DNA 测序并推导氨基酸序列，选择优势序列合成线性肽，ELISA 鉴定线性肽与抗体结合特异性。结果：经过三轮液相筛选，得到4个与抗LTA 单抗特异性结合的阳性噬菌体克隆，序列分析显示阳性克隆展示4种不同序列。选择与单抗结合好的序列GHxDFRQxxQPS 合成线性短肽L2，ELISA 结果显示L2能够与抗LTA 单抗特异性结合。结论：利用噬菌体展示肽库筛选技术获得可模拟LTA 表位的序列。
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桃拉综合征病毒CP2蛋白的克隆表达及其结合肽的噬菌体肽库筛选
目的:克隆表达出桃拉综合征病毒(TSV)主要衣壳蛋白CP2蛋白,并通过对噬菌体随机肽库的淘选,得到与CP2蛋白结合的相关多肽,以探讨CP2蛋白与配体作用的特异位点.方法:根据重组质粒pMD-CP2的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,扩增TSV CP2基因高变区376～1 371 bp,扩增片段插入pET-32构建成原核表达载体pET-CP2.该重组载体在IPTG诱导下进行可溶性表达,SDS-PAGE电泳检测表达的CP2蛋白.以纯化的CP2蛋白作为筛选分子,对噬菌体展示12肽库进行亲和淘选.结果:原核表达出56 kD大小的CP2蛋白,对噬菌体12肽库4轮"吸附-洗脱-扩增"淘洗后,所得的噬菌体回收率逐步提高,由6.4×10-5上升到2.8×10-2,显示淘选过程对随机肽库有很好的富集效果.随机挑选第4轮淘筛后的36个单克隆噬菌体,ELISA鉴定有24个单克隆(66.6%)为强阳性.将这24个阳性克隆扩增、测序,推导随机多肽的氨基酸序列.分析发现,有7个克隆(克隆号2、6、7、9、18、20、33)完全一致,序列为HTSFCSTHLCLI,其它的几个克隆如克隆3及28序列为HCSNLFCSLDLP;克隆5为HCSHTLCALHVM;克隆26为HCNSWLCPLITD也与该7个克隆有相似的序列,经比对核心序列为HCS及LCL.结论:首次用重组的TSV CP2蛋白从噬菌体随机12肽库中筛选到特异结合的肽序列,其共有结构特征为明确CP2与结合蛋白的相互作用位点提供支持.
关键词： 桃拉综合征病毒(TSV) CP2蛋白 克隆表达 噬菌体展示肽库 配体 -
从七肽噬菌体展示库中筛选内毒素结合蛋白质配基
目的:研究从噬茵体展示库中筛选内毒素结合蛋白质配基,为其在内毒素致病作用机理及在内毒素血症防治研究中的应用奠定基础.方法:以内毒素为靶分子从随机七肽噬菌体展示库中筛选内毒素的高亲和力噬菌体配体,通过ELISA鉴定,DNA测序及相关软件分析.结果:所筛选的亲和力高的噬菌体的ELISA检测值A405nm可达1.965通过比较亲和性噬菌体外源插入肽的DNA序列,认为FHENWPS肽段中包含有与内毒素分子发生亲和结合的一个共有序列.该序列展示肽的等电点为5.36,具有双嗜性,这有利于肽与LPS分子表面的位点相互作用从而产生亲和吸附.结论:运用亲和筛选方法从肽库中筛选内毒素结合蛋白质配基是可行的.
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从噬菌体随机环七肽库筛选可模拟C1qR的C1q结合肽
为获得能结合C1q并模拟C1q受体(C1qR)配体结合位点的短肽,以C1q为钓饵蛋白筛选噬菌体环七肽库,采用C1q结合ELISA、U937细胞配体结合抑制试验、多聚IgG(AIgG)竞争抑制试验鉴定阳性克隆,再进行单链DNA测序和分析.结果经3轮筛选后,随机挑选23个噬菌体克隆进行ELISA鉴定,10个克隆与C1q有较强的结合;利用U937细胞配体结合抑制试验,得到了7个阳性克隆;从其展示肽DNA测序结果推导氨基酸序列,获得7个短肽序列:QTPFQLW、NPFNWTS、SPFXLTS、FLTWLDP、FSTFLYP、GPMWWSY和NPFXLIL.
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从噬菌体展示肽库中筛选 PreS1抗原的结合肽
目的:从噬菌体随机七肽库中筛选能与PreS1抗原特异性结合的多肽.方法:利用噬菌体展示技术,以PreS1抗原为靶分子,从随机七肽库中进行生物亲和筛选,ELISA鉴定阳性克隆.结果:对肽库进行3 轮筛选后,通过ELISA和竞争抑制ELISA,获得了特异性的结合肽,测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列.结论:利用噬菌体展示技术成功筛选到了PreS1抗原的结合肽,为乙肝的治疗和诊断探索新的途径.
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肺癌噬菌体展示肽库的构建及肺癌早期检测分子标志的筛选
目的:构建肺癌噬菌体展示肽库,筛选出肺癌早期检测的分子标志群.方珐:取30例第二军医大学长海医院手术后立即冻存的肺癌组织标本构建肺癌噬菌体展示肽库;用结合protein-A/G的琼脂糖珠分别富集肺癌组及非肿瘤对照组血浆中的抗体进行5轮亲和筛选,富集肺癌特异性的相关肽;随机挑取5轮筛选后的500个噬菌体克隆.用ELISA法进一步筛选肺癌/4照D比值大于2.0的肺癌特异标志物克隆.进行基因序列测定和蛋白功能预测.结果:(1)该噬菌体展示肽库的滴度为3.0×106pfu,库容9.0×106pfu,随机挑选20个噬菌斑经PCR鉴定其重组率为60%.(2)共筛选出19个有意义的噬菌体,测序后,预测其蛋白质功能.9个与癌症相关,8个功能未知,2个与癌症不相关.结论:筛选出的噬菌体克隆所表达的抗原很可能是早期诊断肺癌的标志物.
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人源性抗核抗体Fab片段的筛选及鉴定
目的:制备人源性抗核抗体Fab片段.方法:通过4轮淘筛,富集已构建的人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库,间接ELISA法鉴定4轮淘筛后抗核抗体Fab片段噬菌体抗体;提取阳性克隆的噬菌粒DNA,切除gⅢ基因片段,自连接后转化大肠杆菌XL1-Blue,以IPTG诱导表达可溶性人源性抗核抗体Fab片段;应用间接ELISA法及荧光免疫法对表达上清进行鉴定.结果:第4轮洗脱的噬菌体滴度较第1轮增加200条倍,从抗核抗体Fab片段噬菌体库中筛选出2株阳性克隆,切除gⅢ基因后自连的噬菌粒DNA经XhoⅠ单酶切证实连接成功.间接ELISA法检测结果显示:制备的可溶性人源性抗核抗体Fab片段均呈现抗dsDNA阳性,具有抗原特异性;免疫荧光法结果显示:Hep2细胞和猴肝脏组织细胞核显示均质型荧光,绿蝇短膜虫的动基体显示均质型荧光.结论:成功制备具有抗原特异性的可溶性、人源性抗核抗体Fab片段,为高亲和力抗核抗体Fab片段的制备奠定了基础.
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利用噬菌体展示技术筛选日本血吸虫模拟抗原表位
目的从噬菌体肽库筛选日本血吸虫抗原模拟抗原表位.方法制备亲和纯化的日本血吸虫病人血清抗体IgG,用此IgG包被酶标板对12肽库进行反复淘选,对获得的目的噬菌体进行鉴定及免疫原性分析.结果获得一批阳性噬菌体克隆,其中一部分与血吸虫病人血清反应产生较高的吸光值,Western blotting分析表明这些噬菌体能被血吸虫病人血清所识别,具有类似于血吸虫抗原的免疫原性.结论获得一批具有模拟日本血吸虫抗原表位的噬菌体克隆,为今后进一步研究它们在血吸虫病诊断及疫苗研究中的作用奠定了基础.
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从噬茵体7肽库中筛选畦巴因特异性结合的短肽
以哇巴因为靶分子,从噬菌体7肽库中筛选与哇巴因特异性结合的短肽.经过3轮淘筛并通过ELISA法鉴定,获得14个阳性克隆,通过对噬菌体ssDNA电泳鉴定和序列分析筛选得到3种短肽:肽A、B和C的筛选一致率分别为64.3%(9/14),28.6%(4/14)和7.14%(1/14).Genbank中蛋白质同源性分析显示,肽A、B、C均不与钠泵蛋白同源.放射性配基受体结合法检测结果表明,合成的肽A能够与哇巴因结合.哇巴因特异性结合短肽的获得将为阻遏内源性哇巴因与钠泵的结合、防治高血压奠定基础.
