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用噬菌体肽库筛选SARS病原体的模拟抗原表位
目的筛选SARS病原体的模拟抗原表位.方法以混合SARS患者恢复期血清Ig作为筛选分子,从噬菌体肽库中筛选出能与患者血清Ig结合的模拟抗原表位,并研究其抗原特性.结果得到2个能与SARS患者恢复期血清Ig特异性结合的阳性克隆;DNA测序结果显示这2个模拟抗原表位与SARS抗原无同源性.结论用噬菌体肽库成功筛选得到SARS的模拟表位,为开展用SARS模拟抗原表位探索SARS的防治研究创造了条件.
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HSV-2NP6与IL-18真核表达载体的构建与表达
目的 在前期筛选的HSV-2gD模拟抗原表位序列P6的基础上,在GenBank上选取与P6序列相对应且相似的HSV-2天然野生株gD的基因序列NP6,以pcDNA3.1(-)为载体、IL-18为佐剂,构建和表达NP6与IL-18串联的重组表达质粒,并观察免疫小鼠后的效果.方法 采用串联简并引物PCR法构建重组质粒pcDNA3.1-IL18-NP6和pcDNA3.1-IL18.将构建的真核表达质粒pcDNA3.1-IL-18和pcDNA3.1-IL-18-HSVNP6肌内注射免疫BALB/c小鼠3次,每次间隔1周.末次免疫后1周眼眶静脉采血,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体滴度、IFN-γ及IL-18含量.结果 构建的串联重组质粒pcDNA3.1-IL18-NP6和pcDNA3.1-IL18经酶切及测序显示基因序列完全正确,间接免疫荧光、Western blot检测证实模拟抗原表位序列NP6具有近似天然序列的生物学活性;用表达质粒免疫小鼠,可刺激产生高滴度的特异性抗体,并可产生较高水平的IL-18和IFN-γ.结论 成功构建和表达了重组质粒pcDNA3.1-IL18-NP6,表达产物具有免疫原性.
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MUC1模拟表位肽对表达人MUC1T739小鼠膀胱癌细胞的细胞毒作用的实验研究
目的 观察MUC1模拟表位肽对表达人MUC1 T739小鼠膀胱癌细胞的细胞毒作用.方法 培养、诱导T739小鼠骨髓成熟树突状细胞,流式细胞仪鉴定纯度,用负载模拟表位肽成熟树突状细胞免疫T739小鼠,酶联免疫斑点(ELISPOT)检测活化的模拟表位特异性T细胞,用非放射性乳酸脱氢酶法检测不同效:靶比例时活化的模拟表位特异性T细胞体外细胞毒效应.结果 培养出成熟树突状细胞.纯度为78.8%,肽免疫的T739小鼠特异性分泌IFNl的T细胞频数是106.5±12.8,而PBS和DC+PBS组频数均少于10,数量明显少于肽+DC组.当效靶比为100:1时肽免疫的T739小鼠产生的活化T淋巴细胞具有显著细胞毒功能,与PBS和DC+PBS免疫小鼠相比,差异有统计学意义(P<0.01).结论 负载MUC1模拟表位肽的树突状细胞免疫小鼠,可诱导产生特异性细胞毒性T细胞.
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华支睾吸虫童虫模拟抗原表位的筛选和序列分析
目的 利用噬菌体十二肽库筛选华支睾吸虫童虫模拟抗原表位,以达到早期诊断的目的.方法 用纯化的感染华支睾吸虫童虫的大鼠血清IgG作为靶分子,对噬菌体十二肽库进行3轮筛选,随机挑取19个阳性噬菌体克隆用ELISA法检测其特异性.对吸光度值较高的11个克隆进行DNA测序.结果 19个克隆中有17个能与大鼠华支睾吸虫童虫期感染血清发生免疫反应.11个A值较高的克隆中有9个插入序列,其中5个不同的独立序列.结论 用童虫期感染血清作为靶分子筛选肽库,得到的抗原模拟表位对华支睾吸虫病早期诊断有较高潜在价值.
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IL-18与HSV-2gD模拟抗原表位DNA疫苗的免疫效果观察
目的:研究串联重组核酸疫苗pcDNA3.1-IL-18-HSV P6和pcDNA3.1-IL-18-HSV NP6对机体的免疫效果.NP6为与HSV-2gD模拟抗原P6相似的天然抗原表位序列(Accession Number:E00394).方法:将构建的真核表达质粒pcDNA3.1-IL-18、pcDNA3.1-IL-18-HSV P6和pcDNA3.1-IL-18-HSV NP6肌内注射免疫接种BALB/c小鼠3次,每次间隔1周.末次免疫后1周眼眶静脉采血,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体滴度、IFN-γ及IL-18含量;末次免疫后一月,处死小鼠,无菌分离脾脏,MTT法测定脾淋巴细胞增殖率.结果:重组核酸疫苗pcDNA3.1-IL-18-HSV P6免疫小鼠后可刺激血清特异性抗体的产生,诱导分泌较高水平的IFN-γ和IL-18.可促进小鼠脾淋巴细胞的增殖.结论:重组核酸疫苗pcDNA3.1-IL-18-HSV P6能诱导较强的细胞免疫和体液免疫,从而为构建更加有效的HSV-2DNA疫苗奠定了良好的基础.
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用噬菌体肽库筛选SjC-TPI的模拟抗原表位
目的筛选日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶(SiC-TPI)分子的模拟抗原表位,研究其免疫学特性.方法用纯化的抗重组SiC-TPI抗体(IgG)筛选12肽库,获取SiC-TPI的模拟抗原表位,并研究其抗原特性.结果获得SiC-TPI分子的两个模拟抗原表位M1和M2,Western blotting分析结果表明由这两个模拟抗原表位免疫小鼠产生的免疫血清能识别SiC-TPI分子和含此两抗原表位的噬菌体外壳蛋白.DNA测序结果显示这两个模拟抗原表位的氨基酸序列与SiC-TPI无同源性.结论本研究获得的模拟抗原表位M1及M2为SiC-TPI的空间构型抗原的模拟表位,具有较好的抗原性.
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模拟抗原表位基因测定及合成多肽的血吸虫病诊断价值的研究
目的测定能用于血吸虫病诊断及疗效考核的噬菌体展示肽基因序列,研究合成多肽抗原的血吸虫病诊断价值.方法扩增目的噬菌体,制备和纯化噬菌体DNA,对目的噬菌体中外源性肽的基因序列进行测定和演绎氨基酸序列分析.根据血清反应强度和演绎氨基酸序列选择2个噬菌体的展示肽段进行人工多肽合成.以合成的多肽为抗原,建立血吸虫病诊断方法,检测急、慢性血吸虫病人血清,观察方法的敏感性及特异性;同时检测治疗前及治愈后的血吸虫病人血清,观察该合成抗原的血吸虫病疗效考核价值.结果测定了14个噬菌体展示外源肽的基因序列,序列分析表明,其中有6个噬茵体的外源肽基因序列完全相同,其余8个噬菌体展示肽的基因序列不相同.分析演绎氨基酸序列,发现1个噬菌体展示肽中的3个连续的氨基酸(GVK)残基与血吸虫23 kDa分子氨基酸残基相同.合成多肽抗原检测急、慢性血吸虫病人血清,敏感性分别为92.3%和91.1%,与华支睾吸虫病人血清的交叉反应率为7.5%,检测健康人血清,特异性为95.5%.检测治愈后0.5年的同一病人血清,阴转率为55.3%,治愈后1年的病人血清中IgG抗体的阴转率为63.2%.结论 9个具有血吸虫病诊断价值的噬菌体展示表位的基因序列被确定,并证明了合成多肽抗原有较好的血吸虫病诊断及疗效考核价值.
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利用噬菌体展示技术筛选日本血吸虫模拟抗原表位
目的从噬菌体肽库筛选日本血吸虫抗原模拟抗原表位.方法制备亲和纯化的日本血吸虫病人血清抗体IgG,用此IgG包被酶标板对12肽库进行反复淘选,对获得的目的噬菌体进行鉴定及免疫原性分析.结果获得一批阳性噬菌体克隆,其中一部分与血吸虫病人血清反应产生较高的吸光值,Western blotting分析表明这些噬菌体能被血吸虫病人血清所识别,具有类似于血吸虫抗原的免疫原性.结论获得一批具有模拟日本血吸虫抗原表位的噬菌体克隆,为今后进一步研究它们在血吸虫病诊断及疫苗研究中的作用奠定了基础.
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噬菌体展示随机十肽库的构建及抗WSSV单链抗体A1的模拟抗原表位的淘选和鉴定
本实验以pCANTAB 5 E噬菌粒为载体,成功构建了较高容量的噬菌体展示随机十肽库,并将其应用于抗原模拟表位的淘选和鉴定.将一种特异识别对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus, WSSV)的单链抗体A1对十肽库和十五肽库分别进行淘选,结果得到一系列能与单链抗体A1特异性结合的阳性克隆.将这些阳性克隆所编码的多肽氨基酸序列与已知的单链抗体A1的抗原WSSV388片段氨基酸序列做比对,发现多数阳性多肽序列都与WSSV388片段序列的C端一处K····R··R·QS的氨基酸片段相似,由此推论单链抗体A1的模拟抗原表位可能是由该不连续氨基酸片段所构成的构象表位,而非线性表位.研究结果表明,噬菌体展示随机肽库技术是一种用于研究抗原表位结构的有效方法,有助于进一步探讨WSSV的结构蛋白的构象及功能,以及相应单链抗体与细胞受体相互作用的机理.
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MUC1模拟表位肽治疗表达人MUC1 T739荷瘤小鼠的实验研究
目的 观察MUC1的模拟表位肽对表达人MUC1T739荷瘤小鼠的治疗作用.方法 建立稳定表达人MUC1T739荷瘤小鼠,培养T739小鼠成熟树突状细胞,荷瘤小鼠随机分为4组,用负载模拟表位肽成熟DC免疫表达人MUC1T739荷瘤小鼠,第1组皮下注射等渗盐水,第2组注射空DC,第3组注射负载1号肽的DC,第4组注射负载2号肽的DC,测量肿瘤大小,计算肿瘤体积,称瘤重,并观察小鼠存活期.结果 两组DC+肽免疫的小鼠瘤体积减小明显,与 1、2组相比差异非常显著(P＜0.01).平均瘤重1、2组与3、4组相比差异非常显著(P＜0.01).第1～4组荷瘤鼠的生存期分别为(34.6±3.507)d,(35.2±3.564)d,(58.4±5.595)d,(59±6.819)d,3、4两组荷瘤小鼠生存期较1、2组明显延长,差异有显著性意义(P＜0.01).结论 MUC1模拟表位肽能明显抑制表达人MUC1T739荷瘤小鼠肿瘤生长,显著延长T739荷瘤小鼠生存时间.
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HSV-2gD核酸疫苗的构建及免疫效果观察
目的:在前期筛选的HSV-2gD模拟抗原表位序列P6的基础上,以pcDNA3.1(-)为载体、IL-18为佐剂,构建P6与IL-18串联的重组表达质粒,并在真核细胞中表达.将重组质粒免疫小鼠,观察免疫效果.方法:采用串联简并引物PCR法构建重组质粒pcDNA3.1-IL18-P6和pcDNA3.1-IL18,以酶切、测序鉴定.将重组质粒分别转染CHO细胞进行瞬时表达,通过间接免疫荧光和Western blot法检测P6的表达情况.将构建的真核表达质粒肌内注射免疫接种BALB/c小鼠3次,每次间隔1周.末次免疫后1周眼眶静脉采血,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体滴度、IFN-γ及IL-18含量；末次免疫后1个月,处死小鼠,无菌分离脾脏,MTT法测定脾淋巴细胞增殖率.结果:构建的串联重组质粒pcDNA3.1-IL18-P6和pcDNA3.1-IL18经酶切及测序显示基因序列完全正确,经间接免疫荧光、Western blot法检测可证实模拟抗原表位序列P6具有近似天然序列的生物学活性.重组核酸疫苗pcDNA3.1-IL-18-IISV P6免疫小鼠后可刺激血清特异性抗体的产生,诱导分泌较高水平的IFN-γ和IL-18.可促进小鼠脾淋巴细胞的增殖.结论:成功构建和表达了重组质粒pcD-NA3.1-IL18-P6,其能诱导较强的细胞免疫和体液免疫,从而为构建更加有效的HSV-2DNA疫苗奠定了良好的基础.
