首页 > 文献资料
-
抗血小板GPⅢa单克隆抗体SZ-21单链抗体片断的表达和特性
将能与血小板膜糖蛋白IIIa特异结合的单克隆抗体SZ-21构建成单链抗体.应用RT-PCR技术,从分泌SZ-21单克隆抗体的杂交瘤细胞中克隆出VH和VL可变区基因,并构建成SZ-21单链抗体(SZ-21ScFv).将该单链抗体基因亚克隆到高效表达质粒pET20b, 得到pET20b-21ScFv.通过IPTG诱导在大肠杆菌E coli BL21(DE3)PlysS中表达了功能分子.表达产物主要以包涵体形式存在,表达量占菌体蛋白的21%.经过包涵体的溶解、Ni-NTA树脂亲和吸附纯化和蛋白质的体外重折叠等一系列的变性和复性过程,获得具有生物活性的高纯度单链抗体片段.ELISA 和Wester n blot证实该融合蛋白保留了与亲本抗体同样的血小板结合特性.SZ-21单链抗体体外能够抑制ADP诱导的血小板聚集,其抑制能力呈剂量依赖性,在浓度为20mg/L时达到大抑制率.流式细胞仪检测证实该单链抗体能与内皮细胞反应.该单链抗体有望用于血栓性疾病的治疗.
关键词： 血小板 膜糖蛋白IIIa 单链抗体(ScFv) 原核表达 -
抗肝癌单链抗体融合人突变型TNFα的构建与表达
目的鼠/人源化抗人肝癌单链抗体(m/hscFv25)融合人突变型TNFα(mTNFα)原核表达载体的构建及表达.方法用Oligo软件分析并设计人mTNFα的5及3端引物,化学合成并用PCR方法扩增mTNFα,经限制性内切酶酶切后,连接在原核表达载体pGEX4T-1中的m/hscFv25之后,构建成pGEX4T-1/m/hscFv25-mTNFα融合蛋白表达载体,转化大肠杆菌JM109后,通过IPTG诱导进行目的蛋白的初步表达.结果经DNA电泳分析表明,mTNFα基因全长约460 bp,并通过酶切鉴定证明成功构建了抗人肝癌单链抗体融合mTNFα的原核表达载体,融合蛋白产物经SDS-PAGE显示,相对分子质量(Mr)为68 000的蛋白谱带,与预期设计完全一致,光密度扫描结果表明,GST-mscFv25-mTNFα和GST-hscFv25-mTNFα融合蛋白分别占菌体总蛋白的15%和12%,表达产物主要以不溶性包涵体形式存在.结论成功构建并表达了鼠/人源化抗人肝癌单链抗体融合人mTNFα的双功能抗体基因,并在原核细胞中获得较高水平的表达,为进一步研究HCC的治疗奠定了基础.
-
大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建
目的:构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库.方法:从人外周血分离淋巴细胞,提取mRNA后用RT-PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段,两者分别与Linker连接后,采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体(scFv)基因(VH-Linker-VL片段),继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中,连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1,构建噬菌体scFv抗体库.结果:所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接,经电转化E. coli TG1和噬菌体的超感染,构建了总库容达到了6×108的单链抗体库.结论:成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体.
关键词： 单链抗体(ScFv) 噬菌体抗体库 重叠延伸拼接 -
抗血小板膜糖蛋白SZ-21单链抗体的制备和生物学特性研究
目的将能与血小板膜糖蛋白Ⅲa特异结合的单克隆抗体SZ-21构建成单链抗体(SZ-21ScFv),为其临床应用奠定基础.方法构建SZ-21ScFv基因的质粒pET20b-21ScFv,在大肠杆菌E coli BL21(DE3)PlysS中表达了功能分子.表达产物经过包涵体的溶解、Ni-NTA树脂亲和吸附纯化和蛋白质的体外复性过程,获得具有生物活性的高纯度单链抗体片段.结果体外实验证实表达量占菌体蛋白的21%.SZ-21单链抗体能够抑制ADP诱导的血小板聚集,其抑制能力呈剂量依赖性,在浓度为20 μg/ml时达到大抑制率.流式细胞术检测证实该单链抗体能与内皮细胞反应,同时也可以抑制纤维蛋白原与血小板的结合.结论表达的单链抗体具有抑制血小板聚集和抑制纤维蛋白原与血小板结合的能力,有望用于血栓性疾病的治疗.
关键词： 血小板 膜糖蛋白Ⅲa 单链抗体(ScFv) 内皮细胞 血栓形成 -
鼠源抗烟曲霉单链抗体库制备及鉴定
目的 构建鼠源抗曲霉菌单链抗体(scFv)噬菌体展示文库并进行初步鉴定,为制备用于侵袭性曲霉感染实验室诊断的特异性抗体提供新的方法.方法 利用噬菌体展示技术构建鼠源抗烟曲霉半乳甘露聚糖(GM)ScFv库,经过4轮“吸附-洗脱-扩增”淘选富集,随机挑选克隆进行可变区基因测序确定文库多样性,并用phage-ELISA筛选烟曲霉特异性结合的克隆.结果 构建的scFv噬菌体表达文库,库容量约为1.8×107;经4轮富集筛选,洗脱的表达scFv噬菌体滴度渐增;随机挑选出4轮筛选后的20个克隆,其可变区基因序列不同;随机挑选出4轮筛选后的90个克隆,其中6个克隆与烟曲霉GM特异性结合,而与对照的白假丝酵母菌无结合.结论 构建并初步鉴定了抗曲霉菌单链抗体库,库容量大,VH和VL区具备多样性;筛选的scFv与曲霉菌GM特异性结合,提供了快速制备、筛选GM高特异性抗体分子的新方法.
关键词： 单链抗体(ScFv) 噬菌体表达文库 烟曲霉 半乳甘露聚糖(GM) -
抗人CD44单链抗体基因的构建、表达及活性测定
目的:构建表达抗CD44单链抗体(ScFv),并进行体外活性的测定.方法:采用RT-PCR方法从分泌鼠抗人CD44mAb的杂交瘤细胞中克隆出VH和VL可变区基因,再通过重叠延伸拼接PCR方法在VH和VL.可变区基因之间引入连接肽(G4S)3,体外构建抗人CD44单链抗体基因.将其克隆至表达载体PET22b并在大肠杆菌中表达.SDS-PAGE和Flag-FITC分析结果表明,抗CD44-ScFv在BL21菌中获得表达,表达产物以可溶性蛋白形式存在,用镍柱亲和层析纯化和体外复性过程,获得了高纯度的单链抗体片段.结果:证实抗CD44-ScFv可与人类白细胞表面的分化抗原CD44结合,保留了鼠源性单抗与CD44结合活性.结论:抗人CD44-ScFv的构建与表达,为下一步针对髓系白血病的靶向治疗奠定了基础.
关键词： CD44 单链抗体(ScFv) 原核表达 -
抗肝癌细胞噬菌体单链抗体库的构建及筛选
构建抗人肝癌细胞单链抗体库,从中筛选与肝癌细胞特异结合的高亲和力单链抗体.从Hep G2细胞免疫的BALB/c小鼠脾脏提取总RNA,RT-PCR扩增小鼠抗体重、轻链可变区基因,用(Gly4Ser)3 连接肽基因,经重叠延伸反应,在体外将VH和VL连接成单链抗体(scFv)基因,并克隆入噬菌粒载体pCANTAB5E中,构建噬菌体单链抗体库.以Hep G2细胞为抗原对抗体库进行淘选,ELISA法鉴定各单克隆与肝癌细胞的结合活性,并对阳性克隆进行表达.成功构建了库容为1.1×106抗肝癌细胞的噬菌体单链抗体库,经筛选得到了与Hep G2细胞具有较强结合能力的单链抗体,实现了scFv在大肠杆菌中的可溶性表达.序列测定结果表明,VH和VL基因符合小鼠抗体可变区特征,scFv基因拼接正确.
关键词： 肝癌细胞 单链抗体(ScFv) 噬菌体抗体库 筛选 -
抗血管性血友病因子A1区单链抗体噬菌体展示文库的构建和筛选
为构建抗人vWF-A1的全套单链抗体噬菌体表面展示文库,从中筛选与vWF-A1高亲合力的单链抗体,为其临床应用奠定基础.从vWF-A1免疫小鼠的脾淋巴细胞中提取总RNA,纯化mRNA并反转录成cDNA后,用抗体可变区混合引物扩增全套轻、重链可变区基因,经重叠延伸反应,在体外装配成单链抗体(ScFv),将其克隆至噬菌体载体pHEN1中,构建单链抗体噬菌体抗体库.对抗体库进行亲合筛选后,ELISA法鉴定抗vWF-A1单链抗体.结果经过5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集过程,phage-ELISA筛选到与vWF-A1有高亲和力的克隆.序列测定符合抗体可变区结构特点.成功构建了全套抗vWF-A1单链抗体噬菌体展示文库,并筛选出具有结合vWF-A1功能的单链抗体.
关键词： vWF 单链抗体(ScFv) 噬菌体抗体库 -
人源性肺癌噬菌体展示单链抗体库的构建
目的:构建人源性肺癌噬菌体单链抗体库,为筛选肺癌相关抗原的抗体奠定基础.方法:提取肺癌转移淋巴结总RNA,用RT-PCR技术扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,在体外将VH和VL连接成单链抗体(ScFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E中,电转化至感受态的大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,形成噬菌体单链抗体库,采用限制性内切酶鉴定其多样性.结果:从肺癌转移淋巴结中成功提取RNA,逆转录PCR扩增出入可变区基因,连接形成单链抗体,终构建了库容为1.2×108的抗人肺癌单链抗体库.BstN Ⅰ酶切法证明构建的抗体库具有良好的多样性.结论:成功地构建了噬菌体展示的抗人肺癌单链抗体库,为进一步筛选肺癌相关蛋白的可溶性抗体奠定了基础.
-
全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定
目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性.方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库.以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性.结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0 × 107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv.经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的seFv抗体.经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg.结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础.
关键词： 狂犬病病毒G蛋白 噬菌体抗体库 单链抗体(ScFv) 中和活性 -
抗vWF-A3区特异性单抗SZ-123单链抗体的构建和表达
目的 以能与vWF-A3区特异结合的单克隆抗体SZ-123为模板,构建其单链抗体,为深入研究vWF-A3结构与功能的关系提供有力的工具.方法 通过逆转录及多聚酶链反应,扩增并克隆单抗SZ-123的可变区基因VH、VL,经测序后加入连接肽,构建成SZ-123单链抗体(SZ-123 ScFV),并在大肠杆菌中进行表达.采用酶联免疫吸附试验( ELISA)和Western blot方法验证SZ-123 ScFV的免疫原性.结果 VH、VL可变区基因符合小鼠抗体可变区特征,SZ-123 ScFV基因拼接正确.表达产物除少量为分泌型外,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体蛋白的20％.经过变性和复性后,获得具有生物活性的高纯度单链抗体片段.结论 成功表达了SZ-123单链抗体,该小分子抗体具有特异结合vWF-A3区的能力.
关键词： vWF-A3区 单链抗体(ScFv) 原核表达 -
抗日本血吸虫生殖功能分子SIEA26～28kDa单链抗体与EGFP的融合表达及靶向性研究
目的 体外观察抗日本血吸虫生殖功能分子SIEA26～28kDa单链抗体与日本血吸虫各阶段的靶向部位,探讨单链抗体在抗血吸虫病疫苗研究中的应用价值.方法 扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,克隆至PET32a/SIEA26～28kDa-scFv质粒,构建PET32a/EGFP-scFv质粒.转化至感受态E.coli BL21(DE3)中,并诱导表达单链抗体融合蛋白,分析单链抗体融合蛋白与SIEA26～28kDa的结合特异性.单链抗体融合蛋白与日本血吸虫成虫、虫卵切片孵育,荧光显微镜下观测GFP信号,确定特异性单链抗体的靶向性.结果 重组质粒PET32a/EGFP-scFv构建成功,Trx-EGFP-scFv融合蛋白高效表达,与SIEA26～28kDa特异性结合.GFP信号主要集中在未成熟卵卵胚,雌虫卵巢、卵黄腺及与生殖系统邻近的肠腔组织.结论 SIEA26～28kDa单链抗体与血吸虫未成熟卵胚胎及雌虫生殖系统具有较强的靶向性,具有潜在抗卵胚发育、抗雌虫生殖作用,为SIEA26～28kDa单链抗体在抗日本血吸虫病疫苗免疫靶向方面的研究奠定了基础.
-
噬菌体展示随机十肽库的构建及抗WSSV单链抗体A1的模拟抗原表位的淘选和鉴定
本实验以pCANTAB 5 E噬菌粒为载体,成功构建了较高容量的噬菌体展示随机十肽库,并将其应用于抗原模拟表位的淘选和鉴定.将一种特异识别对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus, WSSV)的单链抗体A1对十肽库和十五肽库分别进行淘选,结果得到一系列能与单链抗体A1特异性结合的阳性克隆.将这些阳性克隆所编码的多肽氨基酸序列与已知的单链抗体A1的抗原WSSV388片段氨基酸序列做比对,发现多数阳性多肽序列都与WSSV388片段序列的C端一处K····R··R·QS的氨基酸片段相似,由此推论单链抗体A1的模拟抗原表位可能是由该不连续氨基酸片段所构成的构象表位,而非线性表位.研究结果表明,噬菌体展示随机肽库技术是一种用于研究抗原表位结构的有效方法,有助于进一步探讨WSSV的结构蛋白的构象及功能,以及相应单链抗体与细胞受体相互作用的机理.
-
抗人大肠癌单链抗体基因的克隆与表达
背景与目的 : 单链抗体相对于完整抗体具有免疫源性低、对肿瘤组织穿透力强的特 点,日益成为肿瘤诊断和治疗的良好导向载体. 本研究的目的是将抗人大肠癌单克隆抗体 ND-1的重链可变区 VH和轻链可变区 VL基因借助一短肽序列 (Gly4Ser)3进行重组,构建单链抗 体基因 ND-1scFv, 并使其在大肠杆菌中表达. 方法 : 采用 RT-PCR技术从能够分泌 ND-1单抗 的鼠杂交瘤细胞中扩增 VH和 VL基因,通过重叠延伸拼接 PCR在 VH和 VL基因间引入连接短肽,体 外构建 ND-1scFv基因,经过常规转化和筛选,将其克隆至 PET-28a( + ) 表达载体,由 IPTG诱导在大肠杆菌 BL21中表达为 ND-1scFv与 His-Tag的融合蛋白. 表达产物用 Ni-NTA resin亲和层析方法纯化,并采用 ELISA方法检测其免疫活性. 结果 : 序列分析表明,ND-1scFv基因全长 732bp, VH354bp位于上游 ; VL 330bp位于下游. SDS-PAGE显示,重组蛋白 相对分子量 30kDa, 与预期结果一致. scFv表达产物以不溶性包涵体形式存在,经亲和层析纯 化后蛋白纯度达 94%. ELISA结果显示 scFv保留了与亲本抗体 ND-1相似的免疫活性,结论 : 成功地构建了抗人大肠癌单链抗体 ND-1scFv, 并在大肠杆菌中获得了较高水平的功能性表达.
关键词： 单链抗体(ScFv) 大肠肿瘤 基因表达 -
抗P选择素免疫小鼠单链抗体噬菌体展示文库的构建和筛选
目的构建抗P-选择素的全套单链抗体噬菌体表面展示文库,从中筛选与P-选择素高亲合力的单链抗体,为其临床应用奠定基础.方法从P-选择素免疫的小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA,反转录成cDNA后,用抗体可变区混合引物扩增全套轻、重链可变区基因,经重叠延伸反应,装配成单链抗体(ScFv) 基因,将其克隆到噬菌体载体pHEN1中,构建单链抗体噬菌体抗体库.对抗体库进行亲合筛选后, ELISA法鉴定抗活化血小板单链抗体.结果经过5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集过程,phage-ELISA得到一个ELISA活性较高的与P-选择素结合的克隆.序列测定符合抗体可变区结构特点. 结论成功构建了全套抗P-选择素单链抗体噬菌体展示文库,并筛选得到具有P-选择素结合能力的单链抗体基因 .
关键词： 活化血小板 单链抗体(ScFv) 噬菌体抗体库 -
抗SARS抗体独特型单链抗体的筛选及鉴定
目的从人源噬菌体抗体库中筛选抗SARS独特型抗体为SARS的诊断及疫苗的研究奠定基础.方法以混合SARS病人恢复期血清免疫球蛋白(Ig)作为筛选分子,从噬菌体抗体库中筛选出能与病人血清IgG(IgM)结合的抗体,并通过与混合正常人血清Ig作负性筛选,从而获得抗SARS病毒的独特型抗体(Ald).通过4轮"吸附-洗涤-扩增",从后一轮所得单克隆菌株中分别通过ELISA筛选出能和SARS病人恢复期血清Ig结合的菌株,提取质粒DNA,并对PCR扩增产物进行DNA序列测定,后用所筛选的克隆通过与不同人群血清反应,证实其特异性.结果随机挑选经第4轮筛选后的200个单克隆菌落,其中有10个与SARS病人恢复期血清Ig结合的OD值明显高于其与正常人Ig结合的OD值;以上10个克隆经PCR扩增,其中有6个克隆于1 000bp处有电泳条带;其DNA序列经与BLASF数据库和IMGT/QUEST软件比对有5个均与人的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)高度同源,且与其同源性高的人Ig的VH属VHI亚群,VL属k链,属VKⅡ亚群;后确认有3个克隆其噬菌体抗体和SARS病人血清Ig结合的OD值均明显高于与正常人血清Ig结合的OD值.结论利用抗体库技术可不经免疫制备特异性抗SARS抗体独特型抗体,为SARS诊断及疫苗的研制奠定基础.
关键词： SARS 噬菌体抗体库技术 独特型抗体(AId) 单链抗体(ScFv) -
单链抗体及其在生物医学中的应用
单链抗体是一种小分子基因工程抗体,以其独有的优势在显像定位诊断、靶向治疗和基因治疗等方面展示了乐观的应用前景.本文对单链抗体的构建、表达及在生物医学中的应用作一综述.
关键词： 单链抗体(ScFv) 噬菌体抗体库 靶向治疗 -
靶向人c-Met蛋白单链抗体的制备及其对肺腺癌A549细胞的杀伤作用
目的 制备并纯化出靶向细胞间质上皮转化因子(c-Met)蛋白的人源单链抗体(scFv),鉴定其靶向c-Met蛋白的特性及其对肺腺癌细胞的作用.方法 将scFv基因插入至pFuse载体构建真核表达载体,表达融合鼠源Fc段的融合蛋白Met-scFv,经AKTA蛋白纯化系统纯化;将纯化的Met-scFv进行功能性检测:ELISA检测Met-scFv亲和力;流式细胞术和免疫荧光细胞化学染色检测Met-scFv识别并结合肺腺癌细胞的特性;CCK-8法检测Met-scFv对细胞增殖的影响;通过补体依赖的细胞毒性(CDC)、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC),用乳酸脱氢酶(LDH)释放试剂盒检测Met-scFv对靶细胞A549细胞的毒性影响.结果 ELISA结果提示,Met-scFv与c-Met呈量效关系;流式细胞术和免疫荧光细胞化学染色实验结果提示,与对照组相比,Met-scFv组信号呈阳性,提示Met-scFv与A549细胞特异性结合;Met-scFv抑制A549细胞增殖并产生细胞毒性,且毒性大小与Met-scFv剂量呈正相关.结论 制备出靶向c-Met蛋白的Met-scFv,并可在体外识别并介导杀伤A549细胞.
-
严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)人源性单链抗体文库的构建
目的 构建人源性严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)单链抗体(scFv)文库,并用SFTSV颗粒对文库进行初步筛选.方法 提取8例SFTS恢复期患者外周血淋巴细胞的总RNA,逆转录为cDNA;并以此为模板PCR扩增人源抗体轻链库(Vκ和Vλ)和重链库(VH),再经过重叠PCR随机拼接成scFv基因文库,后克隆入噬菌粒载体pComb3XSS中,将重组噬菌粒电转化感受态XL1-Blue细胞,得到SFTSV抗体文库,检测文库库容及多样性,并用SFTSV颗粒作抗原对抗体文库进行初步筛选.结果 构建的人源SFTSV抗体文库的库容为2.8×10 7,测序结果表明文库多样性好,经过初步筛选获得21个克隆的人源化scFv,具有与SFTSV颗粒结合的活性.结论 成功构建了人源抗SFTSV的scFv文库.
-
全人源抗乳腺癌噬菌体单链抗体库的构建
目的:利用噬菌体展示技术构建全人源性抗乳腺癌单链抗体库.方法:从临床获取未化疗乳腺癌病人外周血样30份,分离出单个核细胞(PBMC),提取总RNA,用RT-PCR技术逆转录获得cDNA,并扩增出全套人抗体重链(VH)和轻链(VL)基因,经重叠延伸PCR(SOE-PCR),在体外将两者连接成单链抗体(scFv)基因片段,将该片段用Sfi I和Not I酶切后克隆至pCantab5E噬菌体载体,电转化TG1感受态菌,收集培养后平板上的菌落,即构建初级噬菌体单链抗体库.结果:得到长度约为360bp和340bp的VH和VL,拼接后得到的scFv长度约为750bp;经PCR初步鉴定插入率约为80%,BstN 1多样性酶切检验,酶切图谱呈多样性.经测序验证,终获得库容约为2.4×106pfu/ml初级单链抗体库.结论:本研究获得了全人源抗乳腺癌噬菌体单链抗体库,为下一步筛选抗人乳腺癌细胞特异性单链抗体奠定了基础.
关键词： 全人源抗体库 乳腺癌 单链抗体(ScFv) 噬菌体抗体库
