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日本血吸虫复合表位DNA疫苗免疫保护作用的研究
目的 研究日本血吸虫复合表位DNA疫苗诱导BALB/c小鼠抗血吸虫感染的免疫保护作用. 方法 将40只雌性BALB/c小鼠随机分为4组:pcDNA3.1组(对照组),每鼠经两侧股四头肌注射100 μg pcDNA3.1质粒DNA,每侧50 μg;TPI组, 每鼠肌注100 μg pcDNA3.1-TPI质粒DNA;TP组, 每鼠肌注100 μg pcDNA3.1-T-linker-P质粒DNA;PT组, 每鼠肌注100 μg pcDNA3.1-P-linker-T质粒DNA.每隔2周加强免疫1次,剂量和方法相同,共免疫3次.末次免疫后4周每鼠经腹部皮肤攻击感染(45±1)条日本血吸虫尾蚴,45d 后剖杀,计数成虫及肝脏虫卵数.首次免疫前2 d及感染前2 d尾静脉采血,间接ELISA检测特异IgG及IgG1、IgG2a水平.末次免疫后3周,每组取2只小鼠制备脾细胞,双抗体夹心法检测脾细胞经ConA和rSjCTPI刺激后培养上清中的IL-2、IL-4和IFN-γ水平. 结果 TP组和PT组小鼠减虫率分别为34.76%和36.14%,显著高于TPI组(P＜0.05)和对照组(P＜0.01);减卵率分别为51.20%和50.79%,与TPI及对照组比较差异有显著性(P＜0.05).TP组和PT组小鼠血清特异性IgG水平均升高(P＜0.05),IgG2a/IgG1的比值分别为4.23和4.34.脾细胞经ConA和rSjCTPI刺激后,IL-2水平TP组和PT组较对照组均升高. 结论 复合表位DNA疫苗能诱导小鼠产生抗血吸虫感染的免疫保护力,效果优于rSjCTPI疫苗.
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日本血吸虫磷酸丙糖异构酶Th1型表位的免疫学鉴定
目的 筛选和鉴定日本血吸虫磷酸丙糖异构酶(SjTPI)的Th1型细胞表位,为构建短肽疫苗奠定基础. 方法 用BLAST比对并预测SjTPI的T细胞表位SjTPI-P18及其对照表位SjTPI-P9.设计并合成其编码DNA,重组入原核表达载体Pet-32c(+)后进行表达,获得纯化的重组融合蛋白rSjTPI-P18和rSjTPI-P9.用rSjTPI、rSjTPI-P18 及rSjTPI-P9刺激经照射致弱尾蚴免疫、rSjTPI加强免疫的C57BL/6和C3H/HeJ小鼠淋巴细胞,3H-TdR掺入法检测淋巴细胞的增殖效果及细胞培养上清中IL-2水平;分别用重组rSjTPI-P18和合成SjTPI-P18刺激rSjTPI-P18、SjTPI-P18或PBS加弗氏佐剂两次免疫的C57BL/6小鼠淋巴细胞,并检测其细胞培养上清中IFN-γ及IL-4水平. 结果 参照曼氏血吸虫TPI T细胞表位预测的SjTPI-P18及SjTPI-P9,获得了与Trx融合表达的重组肽rSjTPI-P18及rSjTPI-P9.与rSjTPI-P9相比,rSjTPI及rSjTPI-P18均可刺激辐照致弱尾蚴免疫、rSjTPI加强免疫的C57BL/6或C3H/HeJ小鼠的淋巴细胞增殖且IL-2分泌量增加(P均＜0.05);SjTPI-P18及rSjTPI-P18刺激经rSjTPI-P18或SjTPI-P18免疫两次的C57BL/6小鼠淋巴细胞分泌IFN-γ水平升高(P均＜0.05),而IL-4水平较低. 结论 筛选和鉴定出的SjTPI-P18是C57BL/6小鼠特异的Th1型表位.
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日本血吸虫中国大陆株TPI DNA疫苗诱导BALB/c小鼠保护性免疫力的研究
目的研究日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶(SjCTPI)DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的保护性免疫作用.方法将39只BALB/c小鼠随机分成3组:A组(对照组),肌注pcDNA3.1质粒DNA 100μg/鼠;B组(实验组),每鼠肌注pcDNA3.1-SjCTPI 100μg;C组(加强组),每鼠肌注pcDNA3.1-SjCTPI 100μg及pcDNA3.1-P35和pcDNA3.1-P40的混合物100μg.每两周免疫1次,共计3次.末次免疫4周后,每鼠用45条尾蚴进行攻击,45 d后剖杀小鼠,计数成虫以及每鼠肝组织内虫卵数;于攻击前每组各取两只小鼠采用51Cr释放法测定SjCTPI介导的特异性细胞毒作用;ELISA检测攻击前后的抗TPI的抗体水平.结果用ELISA检测抗TPI抗体的结果表明,攻击前A组的10份血清均为阴性,B组5/10份血清出现弱阳性,C组也有6/10份血清出现弱阳性反应.51Cr释放法测定细胞毒活性结果表明,A、B、C组细胞毒活性分别为9.1%、27.6%和54.4%.与对照组相比,实验组的减虫率、减卵率分别为30.2%、52.9%;加强组的减虫率、减卵率分别为32.7%、47.0%.结论进一步证实了SjCTPI DNA疫苗作为抗血吸虫病核酸疫苗的潜力.
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多发性硬化患者脑脊液磷酸丙糖异构酶抗体表达与 EDSS 评分的相关性研究
目的：探讨多发性硬化（ MS）患者脑脊液磷酸丙糖异构酶（ TPI）抗体表达水平与临床神经功能障碍程度的相关性及其诊断价值。方法采用酶联免疫吸附试验（ ELISA方法）分别对23例MS患者（ MS组）、17例其他中枢神经系统炎性疾病（ OIND组）患者、13例非炎性疾病（ ONIND组）患者的脑脊液TPI抗体表达水平进行检测及比较，并分析TPI抗体表达水平与临床扩展致残量表评分（ EDSS评分）的相关性。结果 MS组、OIND组、ONIND组脑脊液TPI抗体OD值表达均数分别为（0Ζ．187±0．043）、（0．195±0．042）、（0．164±0．050），3组间比较差异无统计学意义（ P ＞0．05）。脑脊液TPI抗体表达阳性率：MS组为3例（13．04％）、OIND组及ONIND组为0（ P ＞0．05）。相关性分析显示，MS患者临床神经功能障碍EDSS评分与脑脊液TPI抗体OD值呈正相关（ r ＝0．938， P ＝0．003）。结论脑脊液TPI抗体可以作为监测MS临床疗效及评估预后的实验室指标，但目前暂不能认为其可以作为MS的辅助诊断性指标。
关键词： 多发性硬化 磷酸丙糖异构酶 临床扩展致残量表评分 神经元及轴索变性 -
日本血吸虫硫氧还蛋白编码基因的克隆表达及其免疫原性研究
尽管近50年来我国在血吸虫病防治取得了令人瞩目的成就,日本血吸虫病仍然是我国一个重要的公共卫生问题.目前控制血吸虫病的措施仍以灭螺和吡喹酮化疗为主.治愈病人的再感染情况严重、血吸虫抗药虫株的出现及家畜和野生哺乳动物作为重要传染源是我国血吸虫病防治工作当前面临的主要问题.因此积极开展血吸虫病疫苗研究,寻找更加持续有效的防治手段十分重要.迄今,发现了一些疫苗候选抗原,如谷胱甘肽S转移酶(GST)、磷酸丙糖异构酶(TPI)、副肌琼蛋白、肌球蛋白、膜相关蛋白和脂肪酸结合蛋白(FABP)等,但根据动物免疫保护实验结果,这些候选抗原分子都只能诱导出部分保护力,继续寻找新的能诱导较好保护性的疫苗候选分子仍是目前血吸虫病疫苗研究的工作重点之一.
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用噬菌体肽库筛选SjC-TPI的模拟抗原表位
目的筛选日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶(SiC-TPI)分子的模拟抗原表位,研究其免疫学特性.方法用纯化的抗重组SiC-TPI抗体(IgG)筛选12肽库,获取SiC-TPI的模拟抗原表位,并研究其抗原特性.结果获得SiC-TPI分子的两个模拟抗原表位M1和M2,Western blotting分析结果表明由这两个模拟抗原表位免疫小鼠产生的免疫血清能识别SiC-TPI分子和含此两抗原表位的噬菌体外壳蛋白.DNA测序结果显示这两个模拟抗原表位的氨基酸序列与SiC-TPI无同源性.结论本研究获得的模拟抗原表位M1及M2为SiC-TPI的空间构型抗原的模拟表位,具有较好的抗原性.
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基于磷酸丙糖异构酶基因序列的蓝氏贾第鞭毛虫分子系统发育的研究
[目的]探讨蓝氏贾第鞭毛虫种内系统发育及遗传多样性.[方法]对不同来源虫株的磷酸丙糖异构酶(tim)基因进行PCR扩增、序列测定后,用简约法和NJ法构建分子系统树进行系统学分析.[结果]在所测序列中共有124个位点存在变异(23%),且大多数为发生在第三密码子的同义突变,两种构树方法所得两树的分枝结构相似,均将受试的16株蓝氏贾第鞭毛虫分为明显的两组.[结论]tim基因可作为研究蓝氏贾第鞭毛虫群体遗传结构一个有效的遗传标记.
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安徽省部分地区山羊蓝氏贾第鞭毛虫流行病学调查及基因型分析
为了解安徽省山羊蓝氏贾第鞭毛虫的流行及基因型,本研究对安徽省六安、阜阳、宿州、池州、芜湖、滁州和亳州的506份山羊粪样采用卢戈氏碘液染色镜检法进行鉴定,对鉴定出的蓝氏贾第鞭毛虫阳性粪样,进行基于磷酸丙糖异构酶(TPI)和谷氨酸脱氢酶(GDH)基因的巢式PCR扩增,并对阳性产物进行测序,序列用ClustalX 1.81和Mega 5.05软件进行比对分析.镜检结果显示,共检出32份蓝氏贾第鞭毛虫阳性粪样,总感染率为6.3％.巢式PCR扩增结果显示,32份阳性粪样中,TPI基因扩增阳性23份,GDH基因扩增阳性16份,产物大小分别为530bp和450bp.序列分析表明,分离的虫株均为反刍动物特有的聚集体E,但基因亚型存在地区性分布差异,未发现具有人兽共患潜力的A型或B型.
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微小牛蜱磷酸丙糖异构酶基因片段的克隆与原核表达
为克隆和表达微小牛蜱磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase,Tim)编码基因,提取微小牛蜱成虫总RNA,采用RT-PCR方法扩增目的基因,将其连入pMD-18T载体,经酶切和测序鉴定后,将正确的目的基因与pET-28a表达载体连接,并转入大肠埃希菌(E.coli) Rosetta (DE3)中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定分析.结果发现,克隆所得的微小牛蜱成虫tim基因片段长度为750bp(登录号为JX112888),其中开放阅读框为750 bp,编码249个氨基酸,与微小牛蜱胚胎中克隆出的tim基因序列的同源性为99％.SDS-PAGE结果显示,重组蛋白Tim相对分子质量(Mr)约为27000.
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类风湿关节炎新自身抗原:磷酸丙糖异构酶的初步研究
目的 寻找类风湿关节炎的疾病相关的新的自身抗原.方法 从已知的类风湿关节炎滑膜组织中高表达的蛋白分子中,通过淋巴细胞增殖试验及细胞因子检测,筛选出类风湿关节炎特异性自身抗原,并分析血清中抗原水平与疾病活动度的相关性.结果 磷酸丙糖异构酶能特异性刺激RA外周血淋巴细胞增殖并分泌INF-γ、TNF -α及IL-17等细胞因子；RA 血清中磷酸丙糖异构酶含量明显高于正常人,且血清磷酸丙糖异构酶水平与疾病活动度评分呈明显正相关.结论 磷酸丙糖异构酶是类风湿关节炎新的疾病相关性自身抗原.
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日本血吸虫复合表位DNA质粒构建及鉴定
目的用GeneSOEing技术构建含日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶及副肌球蛋白T、B细胞表位的复合表位DNA质粒.方法将一个柔性的氨基酸"接头"插入真核表达质粒载体 pcDNA3.1中,构建pcDNA3.1-linker.PCR法扩增磷酸丙糖异构酶表位基因片段(T).人工合成副肌球蛋白表位的基因片段,退火成双链(P).分别将T、P片段克隆入改建的载体pcDNA3.1中linker的上游和下游,构建T- P融合基因;同时还将T、P片段分别克隆入linker的下游和上游,构建P-T融合基因.重组质粒分别转化E.coli XL1-blue,抽提质粒,酶切鉴定.结果两个目的基因片段分别按顺序克隆入真核表达质粒载体pcDNA3.1中,构建成复合表位DNA质粒.结论成功地构建了复合表位DNA质粒,为制备多价表位DNA疫苗奠定了基础.
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日本血吸虫多价DNA疫苗的构建及鉴定
目的构建含日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶(TPI)基因和日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30 H链CDR3区6倍重复表位基因(CDR3)6的多价DNA疫苗,并观察该融合基因在真核细胞中表达.方法设计合成连接肽(G1y4Ser)3基因的两条互补单链,退火成双链后克隆到真核表达载体pcDNA3.1,改建为pcDNA3.1-linker.分别将SjCTPI DNA片段及NP30的(CDR3)6DNA片段克隆到连接肽的上游或下游,构建pcDNA3.1-TPI-1inker-(CDR3)6和pcD-NA3.1-(CDR3)6-linker-TPI2种多价疫苗.设计引物分别扩增TPI-1inker-(CDR3)6和(CDR3)6-linker-TPI,再分别插入真核表达载体pEGFP-N1多克隆位点,绿色荧光蛋白基因的上游,重组质粒用脂质体导入真核细胞COS-7,观察插入基因在真核细胞的表达.结果经双酶切及测序鉴定证实多价疫苗pcDNA3.1-TPI-linker-(CDR3)6和pcDNA3.1-(CDR3)6-linker-TPI构建成功;构建的pEGFP-N1-TPI-linker-(CDR3)6和pEGFP-N1-(CDR3)6-linker-TPI在导入COS-7细胞后能成功表达.结论日本血吸虫TPI和NP30-(CDR3)6的多价DNA疫苗构建成功,且该融合基因能在真核细胞中表达.
关键词： 日本血吸虫 磷酸丙糖异构酶 NP30-(CDR3)e 多价DNA疫苗 -
CpG免疫刺激序列增强日本血吸虫TPIDNA疫苗免疫保护作用的研究
目的研究CpG免疫刺激序列对日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶DNA疫苗诱导BALB/c小鼠免疫保护的增强作用.方法设计合成一对含6个免疫刺激序列的寡脱氧核苷酸,克隆到真核表达载体pcDNA3.1第5314碱基Ssp I酶切位点,改建为pcDNA3.1-CpG.再将SjCTPIDNA片段克隆到pcDNA3.1-CpG的多克隆位点区,构建为pcDNA3.1-TPI/CpG.56只BALB/c雌性小鼠随机分为4组,各组小鼠分别肌肉注射pcDNA3.1、pcDNA3.1-TPI、pcDNA3.1-CpG、pcD-NA3.1-CpG/TPI质粒DNA,每鼠100 μg.每隔2周加强免疫1次,共3次.末次免疫后4周每鼠经腹部皮肤攻击感染(45士1)条日本血吸虫尾蚴,45 d后剖杀,计数成虫及肝脏虫卵数.首次免疫前2d及攻击感染前2 d经尾静脉采血检测抗体水平、抗体亚类IgG1、IgG2a.末次免疫后2周制备脾细胞,检测细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平.结果 pcDNA3.1-TPI组和pcDNA3.1-TPI/CpG组小鼠血清都检测到特异性IgG抗体,抗体亚类IgG2./IgG1的比值分别为1.76和2.67,而其他两组则未检测到特异性IgG抗体;pcDNA3.1-TPI组和pcDNA3.1-TPI/CpG组小鼠的IL-2、IFN-γ较对照组均有不同程度的升高,IL-4无明显差异;pcDNA3.1-TPI组和pcDNA3.1-TPI/CpG组分别获得了25.98%和34.54%的减虫率,后者高于前者,并分别获得了27.68%和29.50%的减卵率.结论 CpG免疫刺激序列似能增强DNA疫苗在小鼠体内诱导的Th1型免疫应答,并提高DNA疫苗的免疫保护作用.
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日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶DNA疫苗对猪保护性免疫作用研究
目的探讨日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶(SjCTPI)DNA疫苗诱导猪的保护性免疫作用.方法分别构建并制备pcDNA3.1-SjCTPI DNA疫苗及pcDNA3.1 P35和P40(IL-12的两个亚单位)的DNA疫苗.取上海松江本地猪(自幼阉割)30头,分为A、B、C3组,每组10头.A组(TPI组)每头猪于两侧臂部肌肉注射500μgSjCTPI DNA疫苗;B组(TPI+IL-1 2组)每头猪肌肉注射500μgSjCTPI DNA及500μgP35DNA疫苗、500μgP40DNA疫苗.C组(对照组)每头猪肌肉注射500μgpcDNA3.1质粒DNA.共免疫3次,每次间歇3周.末次免疫后30 d,每猪攻击600条日本血吸虫尾蚴(背部贴片法).攻击后45 d剖杀,经胸主动脉灌注,并从门静脉处收集成虫计数从肝脏上同一部位切下小块肝组织,置5%KOH内溶解,后计算每克虫卵数.比较各组间的减虫率、减雌率和减卵率.在免疫前、末次免疫后和攻击后从猪耳静脉采血,分离血清,用ELISA法测抗体.结果TPI组和TPI+IL-1 2组与质粒对照组相比,分别获得48.3%和46.2%的减虫率,53.6%和59.6%的减雌率,49.4%和65.8%的减卵率.TPI组的10头猪中有6头在免疫后可检出抗rSjCTPI 抗体,TPI+IL 1 2组10头猪中有5头在免疫后抗rSjCTPI抗体阳性.结论SjCTPI DNA疫苗可诱导猪产生较好的免疫保护作用,是一种具有较大潜力的抗血吸虫疫苗.
关键词： 日本血吸虫中国大陆株 磷酸丙糖异构酶 DNA疫苗 猪 保护作用 -
日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶特异性肽段的基因克隆表达及特性鉴定
目的应用基因工程方法制备SjC-TPI中特有抗原表位区域的肽段.方法用PCR法对SjC-TPI与人的TPI相应部分同源性较低的两个亲水区15～66aa和129-163aa的DNA的基因序列进行扩增.采用基因拼接法连接后,克隆入表达质粒载体pMAL-c2x,转化入大肠杆菌TB1,进行表达和鉴定.结果该目的基因片段被成功地克隆入表达质粒载体pMAL-c2x,并能融合表达.经进一步纯化获得特异的重组肽段具有良好的抗原性,能被日本血吸虫病人血清识别,而不被正常人血清识别.结论获得与人的TPI同源性较低的特异重组肽段,为日本血吸虫复合多肽抗原疫苗的制备提供了物质基础.
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弓形虫磷酸丙糖异构酶原核表达及免疫保护的初步研究
目的 克隆刚地弓形虫磷酸丙糖异构酶(Triosephosphate isomerase,TPI)基因,原核表达和纯化蛋白,研究其对弓形虫感染小鼠的免疫保护作用.方法 抽提弓形虫速殖子总RNA,利用PCR技术扩增刚地弓形虫TPI基因,构建重组原核表达载体TPI/pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导目的蛋白表达,镍亲和层析法纯化目的蛋白.将与佐剂乳化后的TPI蛋白对小鼠颈背部多点皮内免疫,间隔2周,连续免疫4次,后一次为加强免疫,同时设置佐剂对照组与正常对照组.尾静脉采血检测小鼠血清抗体效价.以400个弓形虫速殖子/只接种小鼠腹腔,观察记录各组小鼠的生存率.结果 成功扩增到弓形虫TPI基因,构建原核表达载体TPI/pET-28a(+),获得纯化的TPI蛋白,TPI免疫4次后的小鼠血清抗体效价可达1:100000以上,且生存期显著高于佐剂对照组与正常对照组.结论 弓形虫TPI蛋白对弓形虫感染小鼠具有一定的免疫保护作用,为研究弓形虫疫苗奠定了理论基础.
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血吸虫糖蛋白研究进展
有关血吸虫疫苗的研究迄今已有70余年的历史.90 年代中期WHO/TDR 选定了6 种曼氏血吸虫候选疫苗分子,它们是28kDaGST、97kDa 副肌球蛋白、62kDaIrv-5、28kDa磷酸丙糖异构酶(TPI)、23kDa表膜抗原和14kDa脂肪酸结合蛋白.但这些候选疫苗分子单独免疫尚不足诱导40%以上的免疫保护力.因而,对血吸虫疫苗保护性抗原及其效应机制的研究还需要进行大量的基础性工作.糖蛋白是血吸虫主要抗原物质,大量存在于童虫和虫卵阶段,在血吸虫免疫应答及免疫调节方面起着十分重要的作用.现已证明,血吸虫糖蛋白不仅可以诱导保护性抗体,亦可诱导封闭性抗体的产生[1].因此,研究血吸虫糖蛋白的结构、功能及免疫机制,可为血吸虫疫苗的发展提供新的策略.本文就血吸虫糖蛋白及其在疫苗研究中的进展概述如下.
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参与糖酵解的酶甘油醛3-磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶是KATP通道大分子复合物的组成成分
ATP敏感的钾离子通道的活性很复杂,受多个因子的调节,重要的是受糖酵解产生的ATP的调节.为了了解细胞内是否存在KATP通道复合物的新的亚基,我们用小鼠KATP通道形成亚基Kit6.2的C端做诱饵蛋白利用细菌双杂交技术对大鼠心脏cDNA文库进行了蛋白质相互作用的筛选.发现参与糖酵解的酶甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和磷酸丙糖异构酶(TPI)能够与Kir6.2相互作用,另外用免疫共沉淀的方法发现丙酮酸激酶(PK)也能够与Kit6.2相互作用,说明这三种酶是KATP通道大分子复合物的组成成分.
关键词： 甘油醛3-磷酸脱氢酶 磷酸丙糖异构酶 丙酮酸激酶 KATP通道
