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分子营养学(中)
(接上期)2.3几种营养素对基因表达的调控2.3.1碳水化合物对基因表达的调控碳水化合物对许多基因的表达有调控作用,主要表现在碳水化合物在胃肠道被消化成葡萄糖并吸收入血以后,葡萄糖能够刺激脂肪组织、肝脏和胰岛β细胞中脂肪合成酶系和糖酵解酶基因的转录.下面以葡萄糖对肝细胞中L-丙酮酸激酶(L-pyruvate kinase,L-PK)基因和S14基因的表达调控为例,介绍碳水化合物对基因表达的调控机制及意义.
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激活低氧诱导因子-1的转导通路
低氧诱导因子-1(HIF-1)与心血管缺血、肺高压和癌症等有密切关系,是在低氧的肝细胞癌细胞株hep3B细胞的核提取物中发现的,是一种结合于促红细胞生成素(EPO)基因增强子的寡核苷酸序列的特异蛋白.据报道,许多类型的细胞都可被低氧诱导而产生效应,其中HIF-1起主要作用,提示细胞中普遍存在一个低氧转导机制.一些转录因子,如活化蛋白-1(AP-1)、核因子-κB(NF-κB)、HIF-1[1]都与低氧应激反应有关.哺乳动物细胞对缺氧的适应性反应主要是表达HIF-1,这一过程与某些蛋白基因如醛缩酶A、烯醇化酶α、乳酸脱氢酶LDH、丙酮酸激酶和葡萄糖转移酶-1(GLUT-1)的表达有密切关系[2].
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维泰醇对小鼠黑色素瘤B16FO糖酵解的影响
目的:研究维泰醇对小鼠黑色素瘤B16F0细胞糖酵解水平的影响并初步探究其机制.方法:以小鼠黑色素瘤B16F0细胞为研究对象,不同浓度维泰醇处理小鼠黑色素瘤B16F0细胞,另设空白组,采用磺酰罗丹明(SRB)法检测维泰醇对细胞增殖的影响,反向高效液相色谱法检测维泰醇对B16F0细胞ATP含量影响,试剂盒检测B16F0细胞培养液中乳酸含量影响,放射同位素法测定维泰醇对B16F0细胞葡萄糖摄取影响,试剂盒检测维泰醇对B16F0细胞己糖激酶(HK),丙酮酸激酶(PK),乳酸脱氢酶(LDH)活性影响.结果:与空白组比较,维泰醇可浓度依赖性的抑制B16F0细胞ATP的产生和乳酸的释放,减少B16F0细胞对葡萄糖的摄取,浓度依赖性的降低PK和LDH的活性(P＜0.05,P＜0.01),但对HK的活性无显著性影响.结论:维泰醇可抑制B16F0细胞糖酵解水平,其机制可能与抑制葡萄糖摄取,下调糖酵解的关键酶PK和LDH的活性有关.
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急性重复低氧对小鼠脑组织中糖酵解和线粒体氧化磷酸化以及能量负荷的影响
目的 探讨小鼠在重复急性低氧暴露后脑组织中的糖酵解、线粒体氧化磷酸化及能量负荷的变化.方法 成年BALB/c小鼠重复低氧暴露5次,测定每次低氧暴露时的平均耐受时间、体温及第0、1、3、5次低氧暴露后脑组织中的磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)、线粒体复合体Ⅰ活性和磷酸腺苷水平.结果 重复低氧暴露使小鼠低氧耐受性增强,体温降低,脑组织中PFK和PK活性先增高后降低,复合体Ⅰ活性持续降低,能量负荷保持稳定.结论 重复急性低氧使小鼠脑组织的糖酵解活性出现规律性变化,线粒体的氧化磷酸化受抑制,但能量负荷保持稳定.
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恶性疟原虫FCC1/HN株丙酮酸激酶基因的扩增、克隆和序列分析
目的扩增恶性疟原虫海南株FCC1/HN的丙酮酸激酶(PK)的编码基因,构建其原核和真核表达重组质粒,测定其序列,并了解它及它推导的蛋白质与恶性疟原虫3D7和人PK基因之间的差异. 方法根据3D7的PK基因设计合成一对引物,用PCR从FCC1/HN株基因组中扩增PK基因;将它分别定向克隆到原核表达质粒PGEX-4T-1和真核表达质粒pcDNA3,分别转化大肠杆菌JM109感受态细菌;经酶切、PCR扩增鉴定筛选到阳性重组克隆,用双脱氧链末端终止法测定其序列,用生物信息学软件分析PK序列及进行同源性比较. 结果 PCR扩增得到特异的FCC1/HN株PK基因,大小为2 235 bp,编码744个氨基酸.其氨基酸序列与3D7的同源性高达99.9%,与约氏疟原虫的同源性为70.2%,但与弓形虫和人的PK的同源性分别只有20.9%和21.6%～25.4%. 结论从FCC1/HN株基因组中获取了PK基因,成功构建了其原核和真核表达质粒,并测定了其序列;它与3D7的PK高度同源,但与人的PK基因同源性很低,可能是一个药物靶标.
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目标序列捕获测序检出红细胞丙酮酸激酶缺乏症PKLR基因新的复合突变
目的:探讨红细胞丙酮酸激酶缺乏症(pyruvate kinase deficiency,PKD)的分子发病机制.方法:应用目标序列捕获和高通量二代测序技术(next-generation sequencing,NGS)对临床拟诊PKD患儿的PKLR基因12个外显子及其侧翼序列进行测序,采用SIFT及PolyPhen-2数据库预测突变对蛋白质功能的影响,在确定患者致病基因型后,应用Sanger测序技术对此基因型进行验证.结果:NGS结果显示,患儿PKLR基因存在罕见的双重杂合突变:第5外显子661G＞ A(Asp221Asn)和第10外显子1528C＞ T(Arg510Ter),导致该基因的第221位氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺,第510位氨基酸由精氨酸突变为终止密码子,使PKLR基因氨基酸链编码提前终止;Sanger测序技术进一步验证了该双重突变的存在.检索相关文献及数据库显示,这两种突变在人群中的发生率极低,蛋白质功能预测均显示为有害.结论:PKLR基因661 G＞A与1528 C＞T双重杂合突变是该PKD患儿的分子发病机制,PKD患者同时存在上述复合突变的报道在国内外尚属首次.
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肿瘤型丙酮酸激酶M2在胰腺癌中的表达特点及其临床病理联系
目的 探讨肿瘤型丙酮酸激酶M2(M2-PK)在胰腺癌组织中的表达特点及其临床病理联系.方法 35 例取自2004 年1 月至2007 年6 月在我院行手术治疗的经病理学证实为胰腺癌的患者的手术切除标本,切片用抗肿瘤型M2-PK 抗体进行免疫组化染色,肿瘤细胞细胞质内出现黄染都被判为阳性,采用半定量法将染色强度分为未染色、弱阳性和强阳性三个等级,阳性细胞所占比例分为0、<30%、30% ～60%、>60%和100%五个等级.结果 35 例标本中染色阳性细胞比例均为100%,肿瘤细胞呈弱强度染色者7 例,强染色者28 例.高中低分化标本中强阳性例数所占比例分别为72.7%、83.3%和83.3%,淋巴结阴性和阳性标本中强阳性例数所占比例均为80.0%,无远处转移和有远处转移标本中强阳性比例均为80.0%,临床分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期标本中强阳性比例分别为85.7%、76.5%、83.3%和80.0%,以上差异均没有统计学意义.结论 肿瘤型M2-PK 在胰腺癌组织中呈高表达,但其表达强度与临床病理无明显相关性.
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肿瘤型M2丙酮酸激酶在肺癌诊断中的应用
目的 探讨肿瘤型M2丙酮酸激酶(TuM2-PK)在肺癌患者血中的表达水平及其临床应用价值.方法 用ELISA法分别检测92例肺癌、77例良性肺部疾病患者和106名健康体检者血浆中的TuM2-PK表达水平,并进行比较分析.结果 TuM2-PK浓度和阳性率分别为肺癌组22.1 U/ml和71%,良性肺疾病组10.5 U/ml和4%,健康对照组8 U/ml和3%,肺癌组明显高于后两组(P＜0.01).Ⅲ、Ⅳ期肺癌患者TuM2-PK阳性率(分别为83%和88%)高于Ⅰ或Ⅱ期肺癌(分别为43%和56%,P均＜0.05);有淋巴结转移患者TuM2-PK阳性率(79%)高于未发现转移患者(35%,P＜0.05).TuM2-PK诊断肺癌的敏感度为71.0%,特异度为96.7%,阳性预测值91.5%,阴性预测值86.8%,准确性88.0%.结论 TuM2-PK对肺癌的辅助诊断有较高的临床价值,并对临床分期、判断淋巴结转移及临床治疗具有一定的指导意义.
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肿瘤M2型丙酮酸激酶在非小细胞肺癌诊断中的临床价值
非小细胞肺癌(NSCLC)的辅助诊断和监测常用的肿瘤标志为癌胚抗原(CEA)和细胞角蛋白片段19(CYFRA21-1).近几年研究发现,肿瘤M2型丙酮酸激酶(M2-PK)在肿瘤患者外周血中的浓度明显升高,可用于肿瘤的早期诊断、预后判断及疗效监测[1-3].本研究通过检测M2-PK在肺癌和肺良性疾病患者血浆中的水平变化,同时与NSCLC传统CEA和CYFRA21-1比较,以评价其在诊断NSCLC中的价值.一、对象与方法
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肿瘤型M2-丙酮酸激酶在乳腺癌诊断与疗效监测中的价值
目的 评估肿瘤型M2-丙酮酸激酶(Tu M2-PK)在乳腺癌诊断与疗效监测中的应用价值.方法 用ELISA检测63例乳腺癌患者、22例乳腺良性疾病患者及40名健康对照者血浆Tu M2-PK水平,并与糖类抗原15-3(CA15-3)、癌胚抗原(CEA)测定结果对比分析.结果 根据受试者工作特征(ROC)曲线分析,Tu M2-PK检测乳腺癌的临界值为14.1 U/ml,敏感度为46.0%,特异度为86.0%,提示其诊断价值高于CA15-3(敏感度为42.8%,特异度为85.4%)和CEA(敏感度为36.5%,特异度为90.0%).乳腺癌患者血浆中TU M2-PK水平(13.3 U/ml)明显高于健康对照(7.2 U/ml,U=408.5,P<0.05)以及乳腺良性疾病患者(11.1 U/ml,U=509.0,P<0.05).乳腺癌患者血浆TUM2-PK水平及敏感度随着肿瘤分期、分级的升高而升高;淋巴结转移患者TU M2-PK水平(23.3 U/ml)显著高于未转移者(10.9 U/ml,U=237.0,P<0.01).TU M2-PK水平与疗效密切相关,病情恶化或出现转移时TU M2-PK升高,在临床治疗有效时又有所下降;而患者病情稳定时,基本维持在同一水平.结论 TU M2-PK测定可提高对乳腺癌诊断的敏感度,是乳腺癌患者病情监测、疗效观察及预后判断的有效指标.
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低氧诱导因子1α和M2型丙酮酸激酶在幽门螺杆菌感染胃癌组织中的表达及其意义
目的 探讨低氧诱导因子(hypoxia-inducible factors-1α,HIF-1α)和M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase type M2,PKM2)在幽门螺杆菌(Hp)感染胃组织癌变发展过程中的作用.方法 应用实时荧光定量PCR和免疫组织化学方法检测85例胃癌组织中HIF-1 d和PKM2 mRNA表达,分析Hp(+)胃癌组织中CagA基因表达.结果 随着肿瘤分化程度的降低、浸润深度和肿瘤临床分期的增加,HIF-1 α和PKM2的阳性表达率均增高,并且二者表达水平呈正相关(r=0.783,P＜0.01).HIF-1α的阳性表达(73％)与淋巴结转移呈正相关(x2=4.204,P=0.041),PKM2的阳性表达(85％)与肿瘤直径呈正相关.HIF-1α和PKM2在Hp感染的胃癌组织中的表达水平(75％和85％)均高于对照组(x2=6.486,P=0.010;x2 =7.341,P=0.009),并且在CagA+者中,二者的表达阳性率(83％和92％)的升高更为显著.结论 HIF-1α和PKM2介导的通路可能在Hp感染胃组织癌变过程中发挥重要作用.
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血清丙酮酸激酶在恶性肿瘤诊断中的应用
目的:探讨血清丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)与恶性肿瘤的关系.方法:应用速率法测定恶性肿瘤病人血清PK活性.结果:恶性肿瘤病人血清PK活性升离,与参考值比较有显著性差异(P<0.001).结论:血清PK与恶性肿瘤有密切关系,检测该酶活性对恶性肿瘤的诊断有一定作用.
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M2型丙酮酸激酶与口腔鳞癌关系的研究进展
M2型丙酮酸激酶(M2-PK)是近年来发现的一种器官非特异性肿瘤标志物,在多种恶性肿瘤中发挥着重要作用,本文主要综述了M2-PK的生物学特征、在口腔鳞癌中的表达情况、致癌机制以及应用前景等.
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手术创伤后红细胞丙酮酸激酶活性改变与外科性糖代谢障碍的关系
探讨手术创伤后围术期红细胞丙酮酸激酶活性改变与糖代谢障碍(或称"外科性糖尿病")的关系.随机选择中等度手术创伤如上腹部胆囊切除或胃大部切除手术病人17例,ASA Ⅰ～Ⅱ级,观察普鲁卡因静脉复合麻醉(IPBA)下上腹部手术对围麻醉手术期红细胞(RBC)丙酮酸激酶(PK)活性及其相关重要调理因子,如RBC内ATP、ADP、Pi、Mg2+,以及血浆葡萄糖、血清胰岛素的影响.结果显示,PK在手术结束后10min较麻醉前明显下降(P<0.01),术后24h仍无回升趋势.RBC-Pi的变化与PK无相关性(r=-0.041,P＞0.05),ATP/ADP比值的变化与PK呈正相关趋势(r=0.680,P<0.01),RBC-Mg2+的变化与PK呈明显负相关(r=-0.817,P<0.05),Glu/Ins的变化与PK呈负相关趋势(r=-0.697,P<0.1).研究表明,IPBA和上腹部手术创伤可直接或(和)间接引起细胞内PK活性下降和糖酵解通路的障碍,导致细胞对葡萄糖、Pi的利用和ATP的合成障碍;围术期糖酵解反应的抑制可能是应激性糖代谢障碍的重要机制之一,在手术后期和术后表现尤为明显.
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原钒酸钠对2型糖尿病大鼠丙酮酸激酶的影响
目的:研究原钒酸钠对2型糖尿病大鼠丙酮酸激酶活性的影响.方法:大鼠灌胃给予脂肪乳10d后,应用四氧嘧啶建立2型糖尿病模型.70只大鼠分为正常组、高脂组、糖尿病组、苯乙双胍组和原钒酸钠大、中、小剂量组(9、3、1mg·kg-1).连续灌胃7d后,测定各组空腹血糖值,用比色法测定肝组织和血清中丙酮酸激酶活性.结果:原钒酸钠降低2型糖尿病大鼠血糖值;与模型组相比,中、大剂量原钒酸钠升高2型糖尿病大鼠丙酮酸激酶活性(P<0.01)中剂量原钒酸钠使血清中酶活性完全恢复,大剂量原钒酸钠使肝组织和血清中酶活性完全恢复(与正常组相比P>0.05).结论:原钒酸钠增加2型糖尿病大鼠肝组织和血清中丙酮酸激酶活性,这可能是其发挥降血糖作用的一个环节.
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血浆及粪便中肿瘤M2型丙酮酸激酶检测在结肠癌诊断中的价值
目的 评估血浆及粪便中肿瘤M2型丙酮酸激酶(TU M2-PK)作为肿瘤标志物在结肠癌患者临床诊疗中的应用价值.方法 用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测34例结肠癌患者以及20名健康体检者的血浆及粪便中的TU M2-PK,进行比较分析.结果 结肠癌患者血浆以及粪便中TU M2-PK水平显著高于健康对照组(P<0.01),其总体敏感性分别为65.0%,82%,随着肿瘤病程进展,中晚期患者血浆以及粪便中TU M2-PK水平(77%,100%)明显高于早期患者(44%,84%,P<0.01).结论 血浆及粪便TU M2-PK测定可提高对结肠癌诊断的有效性,可作为一种常规的辅助诊断方法.
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人胰岛素基因逆转录病毒旋转感染Phoenix细胞的表达
目的:观察新构建人胰岛素基因逆转录病毒表达载体(pM54)在Phoenix和HepG2等细胞的表达情况.方法:1)脂质体法转染pM54质粒进入pT67、Phoenix和3T3细胞系;2)用新构建质粒的父本质粒p54和pCMVβGal质粒做转染基因对照;3)制备转染后细胞培养拟逆转录病毒上清液;4)旋转感染Phoenix及HepG2细胞;5)ELISA法检测转染、感染后上清液INS含量.结果:ELISA法检测证实感染细胞培养上清液中含较高水平目的蛋白INS的表达.对照结果均为阴性.结论:人胰岛素基因逆转录病毒介导旋转感染Phoenix等细胞,目的蛋白INS获得了预期的表达.实验为基因治疗或基因结合干细胞治疗糖尿病的进一步相关研究提供了重要数据.
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手术应激后红细胞糖代谢限速酶活性的改变
糖酵解速率受到3个限速酶,即己糖激酶(HK),磷酸果糖激酶(PFK)和丙酮酸激酶(PK)的控制,其中PFK是主要的因素.20世纪90年代初我们分别动态观察了在硬膜外麻醉和普鲁卡因复合全麻下行上腹部手术患者围麻醉手术期红细胞PK活性和血糖的变化.
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第3例 重度贫血—血小板减少—发热—癫痫（Ⅱ）
分析与讨论 本例患者因为发热、贫血和有出血倾向（皮肤、粘膜出血点，痰中带血，鼻衄，血尿）而由急诊收入血液科病房。出血的主要原因是2周内患者的血小板由60×109/L下降到8×109/L。人体血小板低于20×109/L就会有自发出血倾向，低于10×109/L就有颅内出血的可能。另外，患者血红蛋白为37 g/L，有高胆红素血症（以间接胆红素升高为主）,网织红细胞升高,血红蛋白尿,骨髓涂片红系增生显著,可以诊断为重度贫血、溶血性贫血。因为患者发病年龄大，红细胞酶（如丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）缺陷或珠蛋白异常（如镰形红细胞贫血、海洋性贫血）引起的溶血性贫血可以不考虑,而需考虑自身免疫性溶血性贫血（AIHA）。为此，患者入院后作了Coombs试验，3次结果均为阳性，抗体为IgG型。血涂片可见到球型红细胞，故可诊断温抗体型AIHA。入院时病人有发热、贫血和血小板减少，我们还把微血管病性溶血性贫血（TTP）作为鉴别诊断考虑，但有几项化验检查结果不支持TTP：（1）本例贫血是溶血性贫血，（2）血涂片未见到红细胞碎片，（3）Coombs试验阳性。自身免疫性溶血性贫血加上血小板进行性下降，血小板抗体显著升高(达1 659 ng/107)，因此可以诊断Evans综合征［1］。
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雷公藤红素对SGC-7901细胞和ECV304细胞增殖及能量代谢的影响
目的 研究雷公藤红素对人胃癌细胞SGC-7901和人脐静脉内皮细胞ECV304增殖抑制活性及能量代谢干预的作用机制.方法 选取SGC-7901和ECV304细胞,采用MTT法、生长曲线测定雷公藤红素对2种细胞增殖抑制活性;HE染色法观察细胞形态变化;分光光度法测定糖酵解途径酶[己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)]、三羧酸循环酶[琥珀酸脱氢酶(SDH)]的活力及能量代谢产物ATP的量;Western blotting法测定低氧诱导因子(HIF-1α)和单羧基转运体(MCF-4)蛋白表达水平.结果 雷公藤红素对SGC-7901和ECV304细胞增殖抑制作用具有时间和剂量依赖性,引起2种细胞形态变化,降低2种细胞HK、LDH和SDH活力,使细胞内ATP的量明显减少,SGC-7901细胞中HIF-1α和MCT-4表达明显降低,而ECV304细胞内2种蛋白表达下降不明显.结论 雷公藤红素通过降低SGC-7901细胞和ECV304细胞中HIF-1α和MCT-4蛋白表达水平,抑制2种细胞能量代谢相关酶活力,导致能量不足,细胞增殖受到抑制,从而达到抑制胃癌细胞生长和肿瘤血管生成的双重抗肿瘤作用.
