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转基因大豆的PCR-免疫层析筛查方法研究初探
目的 建立转基因大豆的PCR-免疫层析(PCR-ICT)快速筛查新技术. 方法 利用转基因植物通常含有的CaMV35S启动子作为转基因成分的筛查标记,根据其序列设计特异性引物和探针,分别用生物素和地高辛标记,用胶体金免疫层析技术检测并鉴定PCR产物. 结果 用新建立的PCR-ICT方法可以检出含0.5%转基因大豆的标准品,对大豆样品的检测结果与琼脂糖凝胶电泳检测结果一致. 结论 PCR-ICT方法通过DNA杂交和金标显色来同时检测、鉴定PCR产物,可以简便、快速地筛查转基因产品.
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转基因大豆Roundup Ready调控元件在食品加工过程中降解变化的研究
35S启动子可能会通过基因的水平转移插入到某一致癌基因上游,活化并导致癌症的发生.为了解转基因植物中调控元件的安全性问题,以转基因大豆Roundup Ready为实验材料,针对Roundup ready转基因大豆中CaMV35S启动子及NOS终止子的序列,设计了不同长度片段的引物,通过对CaMV35S启动子和NOS终止子的PCR扩增,研究了豆腐、豆奶、豆粉3种大豆加工食品中磨浆、煮浆、调配、均质、杀菌、喷雾干燥等关键工艺对Roundup Ready大豆中调控元件的影响.结果表明调控原件在食品加工过程中的降解变化与其所处位置有较大关系.扩增长度相近的2个片段,包含大豆基因组DNA序列的片段受加工过程的影响较小,在3种豆制品的所有加工过程中均能检测到.而只包含CaMV35S启动子序列的片段仅能在原料中检测到,原料经过磨浆后,片段大小降至200bp以下.NOS终止子受食品加工工艺的破坏和影响较小,在被检测食品的每一个加工过程中都能够检测到NOS终止子片段.
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细胞荧光素酶报告基因试验受CpG岛甲基化状态影响
目的 研究细胞内源性上皮型钙黏素基因(E-cadherin,CDH1)启动子CpG岛甲基化状态是否影响报告基因试验的结果 .方法 甲基化特异性PCR法测定8种人肿瘤细胞系CDH1启动子CpG岛甲基化状态,免疫印迹法测定其蛋白表达;根据该基因启动子-73位A/C多态和单倍体型构建2组长短不同的CDH1启动子-荧光素酶报告基因[pGI3-A(-73)/-C(-73)和pGL3-H1/-H4],活性差异采用t检验进行统计分析.结果 (1)CDH1在MCF7、MKN74、PC-3和AGS细胞中COG岛末甲基化,除AGS外均存在CDH1表达;在HeLa、BGC823、A549和RKO细胞中CpG岛甲基化并且无表达;(2)在CDH1未甲基化细胞系MCF7、MKN74、PC-3和AGS中pGL3-C<,(-73)报告基因活性(分别为:0.78±0.10、0.17±0.01、0.11±0.01、1.19±0.18)均显著高于pGL3-A(-73)报告基因活性(分别为:0.30±0.08、0.07±0.01、0.07±0.01、0.39±0.04)(t值分别为:-6.298、-12.349、-8.128、-7.388,P值均<0.01),而在CDH1甲基化细胞中则相反[HeLa、BGC823、A549和RKO细胞中pGL3-C(-73)报告基因活性分别为:0.09±0.02、0.13±0.02、0.05±0.01、0.01±0.00,pGI3-A(-73)活性分别为:0.16±0.01、0.25±0.01、0.11±0.03、0.03±0.00,pGL3-C(-73)活性低于pGL3-A(-73),t值分别为:5.958、11.189、3.661、13.866,P值均<0.05];(3)在MKN74和RKO细胞中,pGL3-H1/-H4的启动子活性分别为1.57±0.23/0.94±0.06和0.38±0.02/0.50±0.04,差异亦存在统计学意义(t值为4.577和-4.915,P值为0.010和0.003),并且在两种细胞巾活性相反.结论 细胞内源性目的 基因CpG岛甲基化状态对报告基凶试验结果 可能有重要影响,高活性基因型的启动子也是容易受抑制的启动子.
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利用合适的启动子提高外源基因在Jurkat 细胞中的表达
目的 通过选择合适的启动子来实现外源基因在 Jurkat 细胞中的高效表达.方法 以 pGL3-MCS 质粒为基础构建不同启动子(SV40、CMV、EF1α和 UbC)驱动萤火虫荧光素酶 Fluc 报告基因表达的重组质粒,并将其与作为内参的表达海肾荧光素酶Rluc 报告基因的质粒共转 Jurkat 细胞,检测 Jurkat 细胞中这两种荧光素酶与相应底物反应所产生的荧光强度,计算Fluc 与 Rluc 荧光强度的比值即 Fluc 的相对酶活,通过比较 Fluc 相对酶活的大小来选取在 Jurkat 细胞中具有高表达活性的启动子.结果 以 pGL3-MCS 质粒为基础成功构建了不同启动子驱动 Fluc 报告基因表达的重组质粒 pGL3-CMV 、pGL3-EF1α和 pGL3-UbC.在 Jurkat 细胞中,不同启动子驱动的 Fluc 报告基因的相对酶活的强弱关系为pGL3-UbC > pGL3-EF1α > pGL3-CMV > pGL3-MCS.结论 可以选择高活性的人源泛素 C 启动子实现外源基因在 Jurkat 细胞中的高效表达,以利于 Jurkat 细胞系在哺乳动物 T 淋巴细胞以及免疫相关功能研究中的应用.
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人肝细胞癌金属蛋白酶组织抑制因子-3的表达及与其基因启动子甲基化的关系
目的探讨肝细胞癌的发生和门脉浸润机制.方法 20例肝细胞癌患者,每例在手术后分别取原发瘤、门脉瘤栓及远离肝癌之肝组织.用Western印迹法检测金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)的蛋白表达,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TIMP-3 mRNA的表达,用甲基化特异性PCR检测TIMP-3基因启动子的甲基化.结果远离肝癌之肝组织中均可见TIMP-3蛋白和mRNA的表达,原发瘤和门脉瘤栓组织TIMP-3蛋白和mRNA表达明显降低,其中分别有5例和6例完全丢失.远离肝癌之肝组织均未发现TIMP-3启动子甲基化.原发瘤中有7例、门脉瘤栓组织中有9例出现甲基化.所有有甲基化的肝癌组织,包括原发瘤和门脉瘤栓,有13例TIMP-3 mRNA和蛋白表达完全丢失,6例表达降低.TIMP-3启动子甲基化和肝细胞癌组织学分级无关(P>0.05).结论肝细胞癌的发生和门脉浸润与TIMP-3基因和蛋白缺失或降低相关、而TIMP-3启动子甲基化是其基因和蛋白缺失或降低的原因.
关键词： 肝肿瘤 金属蛋白酶3组织抑制剂 启动区(遗传学) 甲基化 -
上皮型钙黏素基因启动子甲基化及其mRNA和蛋白表达在鼻咽癌组织中的意义
目的探讨鼻咽癌癌细胞上皮型钙黏素基因启动子甲基化的程度及其mRNA和蛋白表达水平在鼻咽癌早期浸润和转移中的作用.方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific PCR,MSP)、蛋白印迹、免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等方法检测21例鼻咽癌患者鼻咽原发癌和淋巴结转移癌配对组织中的上皮型钙黏素基因启动子甲基化程度和上皮型钙黏素、β-链接素在不同组织中mRNA和蛋白水平的表达.结果 (1) 在21例鼻咽原发癌组织中,11例(52.4%)可以检测到上皮型钙黏素基因启动子的甲基化,而在配对的21例淋巴结转移癌组织中17例(80.9%)则可检测到,二者差异具有显著性(P<0.05) .(2) 在鼻咽原发癌组织中,80%的癌细胞均表达上皮型钙黏素蛋白,在淋巴结转移癌组织中只有平均50%的癌细胞表达,两者亦差异有显著性(P=0.004);但β-链接素蛋白在原发癌和淋巴结转移癌组织中均有较高的表达量(均为85%).(3) 蛋白印迹检测表明,上皮型钙黏素在鼻咽原发癌组织中表达的平均相对强度为206.7±32.7,明显高于在转移癌组织中的蛋白平均相对强度65.0±15.9;而β-链接素在不同组织中的蛋白表达相对强度则差异无显著性(P=0.754).(4) 上皮型钙黏素 mRNA在原发癌组织中的表达水平明显高于转移癌组织,但β-链接素的mRNA表达水平则没有明显的差异.结论 (1) 在鼻咽癌组织中,导致癌细胞浸润转移的关键因素是上皮型钙黏素mRNA和蛋白表达水平的下调,而其基因启动子的甲基化则可能是导致鼻咽癌癌细胞分离移动的根本原因.(2)上皮型钙黏素的单独表达下调,即可破坏上皮型钙黏素-链接素复合体的功能,而导致癌细胞浸润和转移,但因基因突变而失活的β-链接素蛋白可能也是导致鼻咽癌细胞转移的一个协同因素.(3)上皮型钙黏素基因启动子的甲基化程度应可以作为临床预测鼻咽癌患者预后的指标之一.
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乳腺癌发生模型MCF10各细胞系中WT1基因启动子区甲基化及mRNA表达研究
目的 通过观察乳腺癌发生模型MCF10中WT1基因启动子区甲基化状态和mRNA表达水平,探讨该基因在乳腺癌发生中的作用.方法 应用甲基化特异性PCR及双亚硫酸钠基因测序技术检测MCF10模型的乳腺增生细胞系MCF10A、癌前细胞系MCF10AT、导管内癌细胞系MCF10DCIS.com、浸润癌细胞系(MCF10CA1a、MCF10CA1d、MCF10CA1h)、经典乳腺癌细胞系MCF7及正常乳腺组织中WT1基因启动子区甲基化状态,然后用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和即时定量PCR技术检测上述样品的mRNA表达水平.结果 在MCF10模型的增生细胞系MCF10A、癌前细胞系MCF10AT、导管内癌细胞系MCF10DCIS.com、浸润癌细胞系(MCF10CA1a、MCF10CA1d、MCFI0CA1h)、经典乳腺癌细胞系MCF7中,WT1基因启动子均处于高度甲基化状态.与正常乳腺组织相比,WT1基因mRNA在MCF10模型的增生细胞系、癌前细胞系、导管内癌细胞系、浸润癌细胞系和经典乳腺癌细胞系MCF7中的表达均有不同程度的增加(MCF10A、MCF10AT、MCF10CA1a、MCF10CA1d、MCF10CA1h、MCF10DCIS、MCF7的WT1基因mRNA表达量分别是正常乳腺组织3.23、1.94、4.20、1.53、4.20、4.35、28.69倍).结论 乳腺癌发生过程中WT1 mRNA的表达不被启动子甲基化所抑制;WT1mRNA过表达出现于乳腺癌发生的早期阶段,提示该基因在乳腺癌发生中起作用.
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人乳头瘤病毒2(HPV2)E2蛋白不同功能区突变对转录抑制作用影响的研究
目的 研究HPV2变异株上E2蛋白不同功能区域的点突变对其转录作用的影响.方法 根据HPV2突变株E2上的突变点设计引物,采用延伸法构建不同的E2突变体,并插入到真核表达质粒pcDNA3.1中.表达不同突变体E2的pcDNA3.1-E2与带有HPV原毒株LCR的CAT报道基因载体进行共转染Hela细胞.通过检测CAT的表达量对不同E2突变体的转录抑制作用进行评估.结果 与全长的原毒株E2相比较,去除N端及C端功能区的E2蛋白均降低了E2蛋白对启动子活性的抑制作用.位于E2蛋白转录激活区(nt 3037),铰链区(nt 3387)及DNA结合区(nt 3697)的点突变明显影响了其转录抑制功能.结论 HPV2 E2蛋白的转录调节功能与其转录激活区以及DNA结合区密切相关.HPV2突变株上的不同的E2的单个突变点能够明显降低E2蛋白对启动子活性的抑制作用.
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介导RNAi的tRNAVal启动子质粒载体的建立
目的构建以tRNAVal启动子控制shRNA转录引发RNAi的质粒载体. 方法从人基因组中用PCR方法扩增出tRNAVal基因片段,人工突变去除3′末端数个碱基,连以Linker序列,用此经过改造的tRNAVal启动子,构建控制针对荧光素酶的shRNA转录载体pUC-tRNAVallucRi,与pMAMneoLuc共转染BHK-21细胞,观察对荧光素酶表达的影响.结果 pUC-tRNAVallucRi可以高效特异性抑制pMAMneoLuc中荧光素酶的表达,效率达97.1%～99.5%.结论 tRNAVal启动子载体可以高效转录shRNA,引发哺乳动物细胞RNAi现象.
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HCV核心蛋白与HBV X蛋白协同反式激活作用的研究
目的探讨HCV核心蛋白与HBV X蛋白的协同反式激活作用.方法构建表达HCV核心蛋白的重组质粒pcDNA3.1(-)core和表达HBV X蛋白的重组质粒pcDNA3.1(-)X;转染HepG2细胞,从转录和翻译水平鉴定病毒基因的瞬时表达;与报告质粒pSV-lacZ共转染HepG2细胞,检测β-半乳糖苷酶表达活性,酶的活性反映了表达的肝炎病毒蛋白对SV40病毒早期启动子/增强子功能的影响.结果构建成HCV核心蛋白及HBV X蛋白的重组表达载体pcDNA3.1(-)core、pcDNA3.1(-)X;在HepG2细胞均能瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白;单独共转染试验中pcDNA3.1(-)core、pcDNA3.1(-)X组的β-半乳糖苷酶的表达分别是对照的4.9、3.5倍,两种质粒共同转染时酶的表达是对照的9倍;表达质粒对β-半乳糖苷酶表达的激活作用呈剂量依赖性.结论 HepG2细胞中表达的HCV核心蛋白和HBV X蛋白均具有反式激活SV40早期启动子/增强子的功能,并且两种蛋白的反式激活功能具有协同特性.本试验有助于解释HCV、HBV感染,尤其是共同感染的致病/癌机制.
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乙型肝炎病毒基因型C亚型和核心启动子、前C/核心区基因变异的关系
目的 研究慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者中HBV基因型C亚型(HBV/C)的核心启动子、前C/核心区基因变异情况,分析HBV/C亚型的病毒学特征.方法 用酶联免疫法(ELISA)筛选出79例HBV/C,再用聚合酶链反应-限制性酶长度多态性分析方法(PCR-RFLP)进行HBV/C亚型分析;同时针对HBV核心启动子、preC/核心区基因进行半巢式PCR及PCR产物直接测序.结果 ①79例HBV/C中,33例(41.8%)为HBV/C1亚型,46例(58.2%)为HBV/C2亚型.②HBV/C1亚型仅见于来自中国南方的患者(P＜0.0001).③A1898位点变异仅见于HBV/C1亚型(P=0.056),V1753位点变异在HBV/C1亚型中多见(P＜0.05);HBV/C2以T1858(90%)、A1896(40%)位点变异多见(P＜0.008).T1762/A1764位点变异在HBV/C两种亚型中均常见.④肝细胞癌(HCC)患者中,V1753和T1762/A1764变异常见(P＜0.05).结论 HBV/C1和HBV/C2在中国有明显的地区差异;V1753合并T1762/A1764双变异与发展为HCC相关,尤其在HBV/C1患者.
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重型肝炎时乙型肝炎病毒基因型与基本核心启动子及前C区突变关系的研究
目的 探讨重型肝炎(重肝)乙型肝炎病毒(HBV)基因型与基本核心启动子(BCP)及前C区突变的关系.方法 采用聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性分析技术(PCR-RFLP)对52例重肝和52例慢性乙肝(CHB)进行HBV基因分型.采用PCR产物直接测序技术,随机对15例B型和15例C型重肝患者的BCP区和前C区进行序列测定,分析HBV基因型与BCP T1762/A1764及前C区A1896突变的关系.结果 泉州地区重肝的基因型以B型为主(48.08%),其次为C型(30.77%)和B/C混合型(17.31%),无A、E、F型存在.与CHB组比较,重肝组B型检出率明显降低,而C型和B/C混合型检出率明显升高.C型重肝患者BCP T1762/A1764双突变率显著高于B型(P＜0.05),而前C区A1896突变率在B、C型感染者中差异无统计学意义(P＞0.05).结论 C型感染易引起较重肝损伤,而B/C型混合感染可能是导致重肝发生的重要原因之一.C型重肝患者BCP T1762/A1764双突变率显著高于B型.
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胃癌组织中RASSF2A基因启动子甲基化检测及其临床意义
目的:探讨胃癌中RASSF2A基因启动子甲基化特征.方法:采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测34例胃癌患者癌组织和癌旁组织RASSF2A基因启动子甲基化情况.结果:胃癌组织RASSF2A基因甲基化发生率为24%,明显高于癌旁组织.差异有统计学意义(p＜0.05).RASSF2A基因甲基化与分化程度,转移等无明显相关.结论:RASSF2A基因甲基化是胃癌发生的频发分子事件,可能在胃癌发生起重要作用.
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急性髓系白血病患者SFRP2基因甲基化的检测及临床意义
目的 检测分泌型卷曲相关蛋白2(SFRP2)基因在急性髓系白血病(AML)患者中的甲基化状态,探讨SFRP2 基因启动子区甲基化状态与AML 发生的关系.方法 收集了99 例AML 患者的骨髓或外周血样本,匹配以70 例门诊普通患者的外周血作为对照.采用甲基化特异性PCR(MSP)方法对所有研究样本进行SFRP2 基因启动子区甲基化状况检测.结果 99 例AML 患者中有27 例检测到SFRP2 基因的甲基化,甲基化率为27.3%;而正常对照组中未检出SFRP2 基因的甲基化;两者比较差异有统计学意义(P ＜0.001).SFRP2 基因的甲基化状态与AML 的年龄、性别、临床分型及样本来源(骨髓/外周血)间均未见显著关系(P ＞0.05).结论 SFRP2 基因启动子区的甲基化与AML 的发生有相关性,可能是引起AML 的分子机制之一.外周血中的SFRP2 基因的甲基化可望作为一项新的分子标记物应用于AML 的临床早期检测.
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整合子中氨基糖苷-3″-腺苷酰基转移酶多克隆抗体的制备与初步应用
目的 制备氨基糖苷-3″-腺苷酰基转移酶[AAD(3″)]特异性抗血清,并探讨其在检测第1类整合子8种不同可变区启动子(PcS、PcH2、PcH1、PcW、PcS-P2、PcH2-P2、PcH1 -P2和PcW-P2)下游基因盒中aadA2基因表达水平的应用价值.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增aadA2基因,并克隆至表达载体pET19b中,诱导表达并纯化带组氨酸标签的重组AAD(3″)蛋白,免疫大耳白兔制备抗AAD(3″)特异性抗血清.以制备的抗AAD(3″)抗血清为一抗,用免疫印迹法(WB)检测不同可变区启动子下游基因盒中aadA2基因的翻译水平,用微量肉汤稀释法检测链霉素对含不同可变区启动子及其下游aadA2基因盒的大肠埃希菌JM109的低抑菌浓度(MIC).结果 成功构建重组的AAD(3″)蛋白表达质粒pET1 9b-aadA2,经测序确认转化大肠埃希菌BL21( DE3)获得1株高表达可溶性重组AAD(3″)蛋白的工程菌株,发酵后用镍柱纯化获得纯度＞90％的重组AAD(3″)蛋白,免疫大耳白兔获得效价＞ 1∶100 000的抗AAD(3″)特异性抗血清.WB检测8种不同可变区启动子下游aadA2基因翻译产物AAD(3″)蛋白的表达水平,设定启动子PcW下游AAD(3″)蛋白的相对表达水平为1,重复3次测得启动子PcS、PcH2、PcH1、PcS-P2、PcH2 -P2、PcH1-P2及PcW-P2下游AAD(3″)蛋白相对表达水平依次为12.9±2.3、9.1±1.0、2.0±0.4、16.0±1.3、14.1±1.3、10.5±0.7、8.9±1.7,且不同可变区启动子下游AAD(3″)蛋白的相对表达水平差异具有统计学意义(F=32.421,P＜0.01).微量肉汤稀释法重复3次测得链霉素对含启动子PcS、PeH2、PcH1、PcS-P2、PcH2-P2、PcH1 P2、PcW、PcW-P2及其下游aadA2基因重组质粒的大肠杆菌JM109的MIC平均值依次为256、256、64、128、32、128、4、64 mg/L,表明不同可变区启动子下游aadA2基因的表达水平不同可赋予宿主细菌对链霉素产生不同水平的耐药.结论 成功纯化出可溶性重组AAD(3″)蛋白,免疫大耳白兔获得高效价的抗AAD(3″)特异性抗血清,为进一步研究整合子中整合酶基因与可变区基因盒表达之间的相互关系奠定基础.不同可变区启动子下游耐药基因盒的表达水平明显不同,赋予宿主细菌对相应抗菌药物的耐药水平明显不同,因此在对临床菌株进行第1类整合子分子流行病学调查时,应重视可变区启动子分类方面的研究.
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PCA3基因启动子多态性快速分型的DHPLC法建立
目的 建立DHPLC技术分析PCa特异性PCA3基因启动子多态性的技术平台.方法 在PCA3基因启动子区域设计1对引物,以本室先前已经建立的11种(C_2T_6、C_2T_5、C_3T_5、C_2T_5/C_2T_6、 C_3T_3/C_3T_4、C_3T_5/C_4T_5、C_3T_5/C_2T_5、C_3T_5/C_2T_6、 C_3T_5/C_1T_8、C_2T_5/C_3T_4、C_2T_6/C_2T_7)已知多态性的PCA3基因启动子的克隆质粒为标准品,通过优化DHPLC检测体系,建立其多态性克隆质粒的标准图谱.采用完全随机设计,从200例病理确诊为PCa患者中选取147例,对其PCA3基因启动子的扩增产物进行DHPLC分析,比较各标本洗脱峰与标准克隆质粒的DHPLC图谱,以判断临床标本PCA3基因多态性类型,并对这些基因型再行克隆测序予以验证.结果 通过克隆质粒优化DHPLC检测体系,适检测体系为:含44.3%A洗脱液(0.1 mol/L TEAA、0.025%ACN)和55.7%B洗脱液(0.1 mol/L TEAA、25%ACN)的起始洗脱梯度,含35.3%A洗脱液和64.7%B洗脱液的终止洗脱梯度,柱温53℃,流速:0.9 ml/min,在该条件下DHPLC用8种杂合型克隆质粒(C_2T_5/C_2T_6、C_3T_5/C_3T_4、 C_3T_5/C_4T_5、C_3T_5/C_2T_5、C_3T_5/C_2T_6、C_3T_5/C_1T_8、 C_2T_5/C_3T_4、C_2T_6/C_2T_7)进行重复性验证,结果 显示,同一多态性色谱峰中2峰的出峰时间之差的批问CV值在0%～6.67%之间.11种克隆质粒多态性标本仪通过1～2次洗脱,就能根据峰型和各峰的出峰时间将其区分开.147例PCa患者中,144例DHPLC检测结果 和克隆测序结果 一致(Kappa=1,P=0.000),并出现3种新的峰型,经克隆测序验证为3种新的多态性(C_3T_5/C_1T_6、C_2T_5/C_1T_8、C_3T_5/C_2T_7).结论 成功建立的DHPLC分析PCA3基因启动子多态性的技术方法 ,可对PCA3基因启动子多态性进行基因型别鉴定.该方法 具快速、准确、经济、高通量、重复性好、自动化等特点,为进一步研究PCa基因多态性提供了技术平台.
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前列腺癌组织中DLC-1启动子甲基化定量检测的HRM方法建立及其应用意义
目的 建立HRM技术定量检测DLC-1启动子甲基化的方法 ,并分析探讨DLC-1甲基化程度与前列腺癌病理参数的相关性.方法 选取89份前列腺癌组织以及10份匹配癌旁组织标本,采用LCM收集肿瘤细胞群,抽提DNA后进行甲基化修饰.以CpGenome Universal Methylated DNA作为100%甲基化样本,以100%非甲基化的健康人外周血DNA作为稀释剂,分别制成100%、80%、50%、30%、10%、0%系列浓度的标准曲线,并进行重复性和灵敏性评价.同时用HRM技术定量检测前列腺癌细胞中DLC-1甲基化水平,探讨DLC-1甲基化程度与前列腺癌患者年龄、PSA水平与前列腺癌TNM的关系.结果 100%、80%、50%、30%、10%、0%甲基化标准品的HRM熔解曲线从右往左依次排列,10份癌旁组织标本、35份前列腺癌组织标本重叠在0%标准曲线上;5份前列腺癌组织标本位于0%～30%区域内,29份位于31%～80%区域内,20份位于81%～100%区域内.HRM技术低检测限可达10%的甲基化水平,优于MSP检测(30%甲基化水平).DLC-1甲基化水平与前列腺癌患者年龄无明显相关(X~2=3.29,P=0.19),与PSA水平也无相关性(X~2=2.04,P=0.36),但DLC-1甲基化水平与TNM分期显著相关(X~2=9.04,P=0.01),且随TNM分期增高而增高.结论 成功建立的HRM技术定量检测DLC-1甲基化水平的方法 稳定、灵敏、操作简单,DLC-1启动子甲基化有望成为评估前列腺癌TNM的分子指标.
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焦磷酸测序法检测HBV前C区/基本核心启动子突变的临床应用
目的 建立一种新的基于焦磷酸测序技术的HBV前C区/基本核心启动子(pre-C/BCP)突变的检测方法,并验证该方法的准确性、重复性、可靠性及进行初步临床检测.方法 通过对基因库中100个HBV基因序列的比对分析,设计出专用的pre-C/BCP焦磷酸测序的PCR扩增引物及测序引物,并以标准质粒作为标准品建立其相应的检测方法.通过对标准质粒及PCR扩增产物、经Sanger测序的HBV血清及基因芯片检测结果分析,以验证本检测方法检测的标本的特异度及本方法的检测可靠性.后对60例HBV临床血清标本进行了初步的检测.结果 本研究成功地建立了pre-C/BCP突变热点的焦磷酸测序方法.其检测结果与pre-C/BCP质粒,Sanger测序法的检测结果符合率达100%(Kappa=1.0),基因芯片检测结果的诊断符合率为91.7%.同一批血清标本的重复率达97.8%,阳性PCR产物测序的重复率100%.充分证明了本方法的准确性、重复性、可靠性.初步批量化检测60份临床标本结果表明,本方法能一次批量检出包括pre-C/BCP的单一、多位点的突变,并发现了一例少见的BCP T1758C突变.结论 本实验所建立的pre-C/BCP突变热点的焦磷酸测序方法是一种可一次性检测HBV pre-C/BCP多位点突变的高通量的检测方法.
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儿童急性淋巴细胞白血病患者肝癌缺失基因1启动子的异常甲基化
目的 分别采用甲基化特异性PCR(MSP)检测儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)患者肝癌缺失基因1(deleted in liver cancer-1,DLC-1)启动子的甲基化水平,探讨DLC-1启动子甲基化用于判断儿童ALL预后的临床价值.方法 选择34例ALL患者骨髓,5例正常骨髓和T淋巴细胞白血病细胞系6T-CEM,分别采用MSP和焦磷酸测序法检测DLC-1启动子甲基化,并采用荧光定量PCR检测5-aza-2'-deoxycytidine处理6T-CEM细胞前后DLC-1的表达.结果 经MSP检测,21例ALL患者骨髓中存在DLC-1甲基化,而在正常骨髓中未发现该基因甲基化.采用焦磷酸测序法检测的结果与MSP法完全一致,而焦磷酸测序法能对DLC-1启动子上的CG位点甲基化进行定量,DLC-1基因的甲基化与年龄、性别、WBC计数、FAB分类、免疫学分型、临床分型等临床病理学参数无显著相关性(P＞0.05).DLC-1基因甲基化阳性的18例获得完全缓解的ALL患者中有14例在12个月内复发,而甲基化阴性的12例获得完全缓解的ALL患者仅4例复发.采用5-aza-2'-deoxycytidine在体外处理DLC-1甲基化细胞6T-CET后,可使DLC-1恢复表达,且呈剂量依赖性.结论 从儿童ALL患者中检测到DLC-1启动子存在高频率的异常甲基化,DLC-1甲基化对预测儿童ALL复发具有一定意义.同时证明焦磷酸测序法是一种敏感、简单,并能对DLC-1启动子甲基化进行定量检测的新方法.
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乙型肝炎病毒核心基因启动子序列突变及准种
目的通过对乙型肝炎病毒(HBV)基本核心基因启动子(BCP)变异的研究,阐明HBv准种在慢性感染者中存在的意义 .方法以中国株HBV基因序列为依据,设计特异性多聚酶链反应(PCR)引物,自43例慢性HBV感染患者血清中扩增HBV的BCP基因,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGF)技术展示缺失突变,DNA测序确定病毒的变异程度.结果聚丙烯酰胺凝胶电泳结果发现,57.8%患者血清中可见2-3条扩增条带;测序结果发现BCP区存在多种突变形式,点突变中以140nt(T→C)为常见,缺失突变多见于TA1,TA2及TA3,多表现为8bp、20bp的缺失.结论HBV BCP区内有一缺失高变区,并在患者个体体内存有多种变异形式;TAl,TA2及TA3的变异可能影响e抗原的表达.结果提示HBv慢性携带者体内有HBv准种共存
