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负载PCA3启动子及CD-TK自杀基因腺病毒载体的构建及包装
目的 构建负载PCA3启动子联合CD-TK基因的腺病毒载体,并对其进行包装及滴度测定.方法 将PCA3启动子无缝克隆到pHBAd-U6-GFP上,取代原有U6启动子形成pHBAd-PCA3-GFP,AgeI单酶切该重组载体,将CD-TK基因片段无缝克隆至线性化pH-BAd-PCA3-GFP上,抽提质粒抗性筛选后经PCR及测序鉴定为pHBAd-PCA3-CD-TK载体.取上述重组载体质粒及骨架质粒pHBAd-BHG,用LipofiterTM转染试剂进行转染HEK293细胞包装成病毒,大量扩增并测定病毒感染性滴度.结果 经PCR及测序验证证实成功构建负载PCA3启动子及CD-TK自杀基因的重组腺病毒pHBAd-PCA3-CD-TK并包装扩增,病毒滴度为1×1010PFU/mL.结论 构建负载PCA3启动子及CD-TK自杀基因的重组腺病毒,为进一步体内外对前列腺癌细胞的杀伤效应研究奠定了基础.
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膀胱癌中CDH13基因启动子甲基化的临床意义
目的 探讨膀胱癌中CDH13基因启动子甲基化的临床意义.方法 应用甲基化特异性PCR检测在23例正常膀胱黏膜和71例原发性膀胱移行细胞癌组织中CDH13基因启动子甲基化状态,并结合膀胱癌临床病理资料进行统计学分析.结果 在23例正常膀胱黏膜组织中CDH13基因启动子均未出现甲基化,在71例膀胱癌组织中CDH13基因启动子甲基化率为60.6％,两组相比差异有统计学意义(P＜0.01)；在膀胱癌组织中CDH13基因启动子甲基化与患者年龄、性别、肿瘤数目和肿瘤形态无关(P＞0.05),但是与肿瘤的生长、分化不良以及侵袭密切相关(P＜0.05).结论 CDH13基因启动子甲基化与膀胱癌的发生发展密切相关,有可能成为膀胱癌早期诊断、监测和预后判断的分子标志物.
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U6/H1双启动子siRNA表达框架构建及其对肿瘤细胞端粒酶活性的干扰作用
目的:构建针对端粒酶hTERT基因的U6/H1双启动子siRNA表达框架(SEC),并观察其转录产物对HeLa细胞端粒酶活性的干扰作用.方法:利用融合PCR技术,针对人端粒酶hTERT基因开放阅读区构建3条U6/H1双启动子SEC以及针对其3'端非翻译区构建1条U6/H1双启动子SEC,对各SEC鉴定后,分别转染人宫颈癌HeLa细胞,用端粒重复序列扩增法(TRAP)检测HeLa细胞的端粒酶活性.结果:4种针对端粒酶hTERT基因的U6/H1双启动子SEC均成功构建,转染HeLa细胞后,对端粒酶活性的抑制率分别为36.8％、57.39％、80.47％、70.31％.结论:针对端粒酶hTERT基因的U6/H1双启动子SEC的成功构建,为开展肿瘤端粒酶基因干扰的实验研究提供了新的有效手段.
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肿瘤靶向性人可溶性TRAIL载体的构建及其在鼻咽癌细胞株CNE-2的表达
目的 克隆人可溶性TRAIL(sTRAIL)基因并构建肿瘤细胞特异性真核表达载体,为鼻咽癌基因治疗的靶向性奠定实验基础.方法 提取人外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR扩增含有IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区的融合基因,克隆人真核表达载体pGL3-181hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游,构建可分泌表达TRAIL基因的真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL.用Western blot鉴定鼻咽癌细胞株CNE-2中表达产物.结果 RT-PCR扩增得到了613 bp的cDNA片断.经酶切及测序鉴定,与GenBank中报道的IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区cDNA序列完全一致,成功构建了肿瘤特异性高效分泌表达可溶性人TRAIL的重组真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL.Western blot结果 显示,获得的瞬时转染TRAIL在鼻咽癌CNE-2肿瘤细胞中能有效表达.结论 重组真核表达载体pGL3/TRAIL的成功构建,为鼻咽癌基因治疗的靶向性提供了可能性.
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CD209基因启动子-336A/G多态性与结核易感性的meta分析
目的 探讨CD209基因启动子-336A/G多态性与肺结核易感性的关系.方法 2012年12月1日至10日检索EMBASE、PubMed、中国期刊全文数据库CNKI、中国生物医学文献数据库CBM收录的CD209基因启动子-336A/G多态性与肺结核易感性的研究.病例组及对照组CD209基因启动子-336A/G分布的优势比(odds ratio,OR)为效应指标,根据异质性检验结果选择随机效应模型或固定效应模型对OR进行合并分析.结果 终纳入符合要求的研究9篇,meta分析显示显性模式下(GG+ AG vs AA)携带GG/AG基因型个体感染TB的风险是携带AA基因型个体的1.06倍(OR =1.06,95％ CI:0.85～1.32),但差异无统计学意义(Z =0.52,P＞0.05)；隐性模式下(GGvsAG+AA)携带GG基因型个体感染TB的风险是携带AG/AA基因型个体的1.15倍(OR =1.15,95％ CI:0.84～1.56),差异亦无统计学意义(Z=0.32,P＞0.05).结论 CD209基因启动子-336A/G多态性与肺结核易感性间不存在明显相关性.
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人表面活性物质蛋白B基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒的构建及活性检测
目的 构建人表面活性物质蛋白-B (SP-B)基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒,并分析其在H441细胞中的转录活性.方法 (1)以人基因组DNA为模板,PCR扩增SP-B启动子(-218/+435 bp)序列片段,并通过TA克隆方法连接到pGM-T载体上,筛选阳性克隆将目的片段进行测序.测序鉴定正确后的目的片段被克隆到荧光素酶表达载体pGL3-Basic上构建pGL3-basic-SP-B-promoter重组质粒,酶切及测序鉴定重组质粒；(2)将构建的pGL3-basic-SP-B-promoter重组质粒酶切改造,SP-B启动子克隆进pGL4.17载体构建pGL4.17-SP-B-promoter重组质粒；经酶切及基因测序确认无误后,采用脂质体法将构建的两种重组质粒分别和内参质粒pRL-TK同时转染H441细胞,检测双荧光素酶活性.结果 构建的重组质粒经酶切及测序鉴定完全正确,转染H441细胞后,检测细胞裂解液萤火虫荧光素酶(firefly)及海肾荧光素酶(renilla)活性,两者比值间接反映启动子活性,pGL3-basic/pGL4.17-SP-B-promoter重组质粒的firefly/renilla比值(2.8±1.1、66.5±3.8)较空载体质粒pGL3-basic、pGL4.17(0.2±0.1,4.3±0.4)均明显升高(t=4.182,27.419,P=0.000).pGL4.17重组质粒firefly/renilla比值明显高于pGL3-basic重组质粒,其差异有统计学意义(t=27.712,P=0.000).结论 成功构建具有SP-B基因转录活性的pGL3-basic/pGL4.17-SP-B-promoter重组质粒,pGL4.17重组质粒荧光素酶活性高,为后续研究SP-B基因转录调控奠定了理论基础.
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脑胶质瘤中hMLH1、hMSH2基因启动子区的甲基化状态研究
目的探讨脑胶质瘤中hMLH1、hMSH2基因启动子区的甲基化状态,及其在肿瘤发生中的作用.方法采用甲基化特异性PCR(MSP)方法,检测42例脑胶质瘤hMLH1、hMSH2基因启动子区的甲基化状态.结果hMLH1启动子区甲基化2例(4.8%),hMSH2启动子区甲基化13例(31.0%),启动子区甲基化与性别、年龄、病理类型和病理分级无明显的相关性.结论hMSH2基因启动子的CpG岛在脑胶质瘤中有高甲基化现象,可能与胶质瘤的发生有关,而hMLH1基因启动子区甲基化少见.
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原发性局灶节段性肾小球硬化ACTN4和SYNPO基因启动子的突变
目的 探讨散发性原发性局灶节段性肾小球硬化(FSGS)患者中ACTN4和SYNPO基因肩动子区突变的致病作用.方法 盐析法提取82例FSGS患者外周血基因组DNA,经引物设计及PCR扩增后测序.突变位点经转录因子结合模拟软件筛选,pGL3-Basic构建表达载体与pRL-SV40质粒瞬时共转染PC12细胞,双荧光素酶法检测基因表达.检测患者父母头发DNA.免疫荧光检测患者肾组织α-actinin-4和synaptopodin蛋白表达.结果 3例ACTN4基因突变分别为1-34C>T、1-590delA和(1-1044delT)+(1-797T>C)+(1-769A>G).2例SYNPO基因突变分别为1-24G>A和1-851C>T.1例患者分别接受父母1-1044delT和1-797T>C变异.除1-1044delT组外,变异组荧光素酶表达强度比正常组有不同程度下降,与突变患者肾组织α-actinin-4和synaptopodin免疫荧光强度下降基本相符.结论 ACTN4和SYNPO基因启动子区顺式作用元件区的变异影响基因的转录,可能在散发性FSGS发病中起作用.
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基因步移在分离蚊虫细胞色素P450启动子中的应用及意义
[目的]快速扩增出白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP 6N3基因(CYP6N3)上游启动子区序列.[方法]根据本室已获得的白纹伊蚊CYP6N亚家族新成员CYP6N3全长cDNA的5＇-末端核苷酸序列,设计2个反向特异引物(GSP1和GSP2),利用4种限制性内切酶DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和StuⅠ分别消化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株高分子量基因组DNA,消化产物与适配子连接产生4种消化的DNA库(DL1、DL2、DL3及DL4),并分别以此为模板,进行基因步移.用特异引物GSP1与适配子引物AP1进行第1步PCR扩增,然后再以第1步PCR产物为模板、用内部特异引物GSP2与内部适配子引物AP2进行第2次PCR扩增.[结果]第1步PCR结果显示:在上述4种消化文库中分别扩增出约806、2190、2 206和3 076bp的特异条带;第2步PCR结果与第1次PCR相类似,但各泳道主带扩增效率明显升高.[结论]本实验已成功地获得了白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6N3上游启动子区核苷酸序列及其4种限制性内切酶图谱.此外还对基因步移法在昆虫细胞色素P450多样性及其参与杀虫剂抗性分子机理研究中的意义进行了讨论.
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甲基化特异性聚合酶链反应技术用于肝细胞肝癌的诊断
甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术检测DNA异常甲基化是一种极好的新方法.
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RNA聚合酶Ⅱ启动子SMP8在活化肝星状细胞中的活性
我们已往的研究已经证实,RNA聚合酶Ⅲ启动子(pol Ⅲ)载体表达的针对TGF β1的核酶,在体外能有效逆转活化HSC的生物学活性[1].但TGF β1是广泛存在于各种细胞中,并发挥重要生物学效应的细胞因子,因此不具组织和细胞特异性的pol Ⅲ启动子核酶表达系统,在抑制HSC活化的同时会影响到正常肝细胞或其他细胞的功能,这使得基因治疗肝纤维化变得困难.
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核转录因子FoxH-1参与人α2(Ⅰ)型胶原基因的转录调控
核转录因子FoxH-1是DNA结合蛋白winged helix转录因子家族的新成员[1].在TGF β信号通路中,FoxH-1能结合到TGF β下游基因(如MIX.2)启动子区域,导致基因激活转录,表明FoxH-1在TGF β信号通路中起到转录调节的作用[2].TGF β能刺激HSC分泌Ⅰ型胶原,这是肝脏发生纤维化的主要环节[3],但是它在转录水平调控Ⅰ型胶原基因表达的具体机制尚不清楚.因此我们构建pC1neo-FoxH-1和pGL3-COL Ⅰ质粒,通过检测α2(Ⅰ)型胶原表达水平的变化和荧光素酶活性,探讨转录因子FoxH-1在调控Ⅰ型胶原基因转录中的分子机制.
关键词： 转录 胶原Ⅰ型 启动区(遗传学) 转录因子FoxH 1 -
血管紧张素原基因5'端核心启动子区(-6)A～G变异与肝硬化相关性
血管紧张素原(AGT)主要在肝脏合成,是肾素-血管紧张素系统的惟一初始底物.AGT基因核心启动子区域位于TATA框与转录起始位点之间,对AGT基因转录表达起重要调空作用.
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人肝癌组织胰岛素样生长因子Ⅱ基因启动子表达及其意义
人胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)是一种重要的胎儿生长因子,其基因含4个不同的启动子(P1～P4).在生长发育过程中,4个启动子不同的生物活性,具有组织特异性和发育阶段独立性表达特征,P2～P4为胚胎型启动子,P1为成人型启动子.在胎肝和新生儿肝中IGF-ⅡmRNA表达量高,其中P3活性大,其次分别为P4及P2,P1失活;在成人肝脏中IGF-ⅡmRNA表达量显著下调,约为新生儿峰值的1/10,其中P1活性大,依次为P4、P2及P3,约70%成人肝脏P3呈关闭状态,仅30%成人呈微量表达[1,2].近年研究发现,IGF-Ⅱ在模型动物肝脏[3]和人类肝脏[4]的癌前病变及肝癌组织中呈过量表达,但不同学者报道的IGF-Ⅱ异常表达量及阳性率差异较大,且多数为IGF-Ⅱ蛋白水平的定性研究.我们分析了乙型肝炎病毒(HBV)阳性肝癌的P1～P4调控的IGF-Ⅱ转录子表达水平的变化及其与临床病理特征的关系,旨在阐明IGF-Ⅱ基因启动子在肝癌癌变中的作用及其临床意义.
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乙型肝炎病毒前C区和核心启动子区突变与慢性乙型肝炎病情的关系
乙型肝炎病毒(HBV)感染能导致急、慢性肝病,其中全球慢性乙型肝炎感染者近4亿.每年由于HBV慢性感染引起的肝硬化,肝细胞癌死亡患者超过47万人[1].而由于HBV病毒复制过程缺乏校对机制,在慢性感染的过程中发生基因突变的概率很高,相关研究多的HBV突变株主要有:发生在翻译水平的前C区突变(G1896A);发生在核心启动子(BCP)区,即A1762T和G1764A的联合突变;发生在HBV DNA聚合酶区的变异包括P区528、552位点的突变.研究表明,HBV前C区1896位突变以及BCP区突变普遍存在于CHB患者中,且随临床病情加重突变病毒感染率逐渐增加,诱导肝脏炎症活动和肝损害,从而使肝纤维化程度呈加重趋势.本研究采用基因芯片技术对HBV前C区和BCP区突变与慢性乙型肝炎病情的关系进行了较为系统的探讨.
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丙型肝炎病毒5'非翻译区DNA序列在HepG2细胞中的启动子活性
目的研究丙型肝炎病毒(HCV)基因组5'非翻译区(5'UTR)DNA序列在HepG2细胞中的启动子活性,以了解HCV的复制调控机制.方法分别构建HCV基因组5'UTR DNA正反向序列驱动虫荧光素酶基因表达的质粒5'UTR- Luc(+)/(-)和5'UTR DNA序列驱动绿色荧光蛋白基因表达的质粒5'UTR -EGFP(+)/(-),分别转染HepG2细胞,用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶的表达水平,逆转录聚合酶链反应检测虫荧光素酶基因m R N A水平,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白基因的表达水平,并与相应对照作比较,来证实H CV基因组5'UTR DNA序列的启动子活性.结果 5'UTR- LUc(+)有明显的虫荧光素酶表达,但比pGL3 control表达水平低(Luc/R为0.690 ± 0.086,Luc/RL为4.210±0.340),而5'UTR-Luc(-)和pGL3 enhancer无明显虫荧光素酶表达(Luc/RL分别为0.095±0.008和0.044±0.00 5);逆转录聚合酶链反应结果与之相符,5'UTR- Luc(+)检测到虫荧光素酶基因mRNA,而5'UTRLuc(-)则未检测到.5'UTR- EGFP(+)观察到较强绿色荧光,而5'UTR -EGFP(-)无荧光表达.结论 HCV基因组5'UTR DNA序列具有明显的启动子活性,能启动下游基因的表达,在HCV基因组复制过程中有重要作用.
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噬菌体展示技术筛选干扰素α启动子DNA结合蛋白
目的筛选干扰素α(IFNα)启动子DNA结合蛋白,探讨IFN α基因表达调节的分子生物学机制.方法应用噬菌体展示技术,以IFN α启动子的聚合酶链反应产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索.结果噬菌体经富集后,随机挑选40个克隆,成功构建了克隆载体,序列测定后经过同源性搜索,确定了和IFNα启动子结合的肝细胞蛋白,筛选到17种与IFN α启动子具有结合作用的蛋白.结论多种具有不同生理、生化功能的蛋白与IFN α启动子具有结合作用.
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肿瘤特异性Survivin启动子与甲胎蛋白启动子的活性评价与比较
目的研究并比较肿瘤特异性Survivin和甲胎蛋白(AFP)基因启动子在不同肝细胞癌细胞系中的转录活性,为肝癌靶向性基因治疗提供依据.方法采用聚合酶链反应法扩增获得Survivin和AFP基因的启动子片段,并克隆入表达虫荧光素酶基因的报告质粒中,通过测定荧光素酶报告基因的表达情况,测定Survivin与AFP基因启动子的转录活性,同时采用巨细胞病毒启动子为对照,评价其转录活性水平.结果 Survivin启动子在肝癌细胞中具有相当强的活性,其活性水平在高表达AFP的肝癌细胞中为AFP启动子的54～100倍,达到巨细胞病毒启动子活性的16%～21%.结论Survivin启动子在肝癌细胞系中具有较强的启动活性,可望开发成为新的肝癌靶向性基因治疗工具.
关键词： 癌 肝细胞 启动区(遗传学) 基因疗法 Survivin基因 -
肿瘤特异性hTERT启动子与Survivin启动子在肺癌A549细胞中的转录活性研究
目的:比较不同长度的hTERT启动子以及Survivin启动子在肺癌A549细胞中的启动活性,为肺癌靶向性基因治疗提供依据.方法:用PCR法扩增1084 bp hTERT启动子、980 bp Survivin启动子和红色荧光蛋白基凶;在真核表达质粒pGL3-hTERT基础上分别构建3种启动子调控的、以红色荧光蛋白CDS为目的基因的真核表达质粒pGL-H-RED、pGL-LH-RED和pGL-S-RED.将重组质粒用脂质体分别转染A549和MRC-5细胞,72h后用Imagepro-Plus6.0分析3种启动子在相同时间内启动红色荧光蛋白的表达水平.结果:重组质粒在A549细胞中观察到了红色荧光,在MRC-5细胞中无红色荧光.pGL-S-RED质粒在A549细胞巾表达强,pGL-LH-RED次之,pGL-H-RED弱,3种质粒在A549细胞中的荧光强度(IOD)分别为201.17、171.70和136.34.结论:所克隆的hTERT启动子和Survivin启动子均表现出肿瘤特异性,其中Survivin启动子在肺癌A549细胞中具有好的启动效应,可望开发成为肺癌靶向性基因治疗工具.
关键词： 人端粒酶逆转录酶 Survivin基因 启动区(遗传学) 肺癌 基因疗法 -
HBV对肝癌细胞中AKR1C1基因表达的影响
目的 研究HBV对肝癌细胞中AKR1C1基因表达的影响,并对其作用机制进行初步的探讨.方法 RT-PCR和Real-time PCR检测HepG2.2.15和HepG2细胞中AKR1C1基因的差异表达情况;构建AKR1C1基因启动子虫荧光素酶报告质粒,并分别与HBV、HBx、HBs、HBp、HBc的表达质粒共转染HepG2细胞,双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶活性.结果 AKR1C1基因在HepG2.2.15细胞中的表达高于HepG2细胞1.5倍;在HBV表达质粒与AKR1C1基因启动子虫荧光素酶报告质粒共转染的HepG2细胞中,虫荧光素酶的活性明显增强,为对照组3.37倍;相对HBs、HBp、HBc,HBx升高虫荧光素酶的活性的作用强.结论 HBV可以增强AKR1C1基因启动子的转录活性,促进AKR1C1在肝癌细胞中的表达,HBx在这一转录激活当中发挥重要作用.
