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靶向PV株核蛋白基因的小分子干扰RNA对不同狂犬病病毒毒株复制的交叉抑制作用
目的 研究小分子干扰RNA(siRNA)对狂犬病病毒(RV)不同毒株复制的交叉抑制效果.方法 采用体外转录和RNA酶Ⅲ消化长片段双链RNA的方法制备8条以RV的PV株核蛋白(N)基因为靶基因的21nt siRNA,用以转染已经感染了不同滴度PV、CTN或CVS株RV的BSR细胞,采用直接免疫荧光法观察转染的siRNA对已感染BSR细胞的不同毒株RV复制的抑制效果,并分析这种抑制效果与靶基因序列的相关性.结果 不同21nt siRNA均对PV株的复制产生了较强的抑制作用;对CTN株和CVS株的交叉抑制作用观察结果表明,21nt siRNA与靶基因在碱基错配高达5个的情况下仍对病毒复制保持抑制效应.然而,siRNA与靶基因碱基错配的位置与抑制作用的丧失高度相关.3'端第2个碱基的错配将使抑制作用表失,随后的碱基错配对抑制作用的影响依次降低;中部碱基错配影响较小;而5'端碱基错配对抑制作用几乎没有影响.结论 siRNA对靶基因的抑制作用的丧失与其同靶基因序列碱基错配的位置相关,3'端碱基错配可降低其抑制作用的特异性,产生偏靶效应的范围和概率可能增大,这为设计独特的siRNA序列提供了新的思路.
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DNA错配修复基因甲基化在肝细胞癌发生发展中的作用
目的探讨DNA错配修复基因(MMR)hMLH1,hMSH2和hMSH3甲基化在肝细胞癌(HCC)发生发展中的作用.方法采用甲基化特异性聚合酶链反应( MSP)法对38例新鲜HCC组织,相应非肿瘤肝组织,2例正常的捐肝组织及6种肝癌细胞系的hMLH1,hMSH2和hMSH3基因启动子CpG岛甲基化进行检测;培养6种肝癌细胞系,MSP法检测加入5-aza-2′-deoxycytidine前后hMSH2基因在HCC中的甲基化状态改变;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测加入5-aza-2′-deoxycytidine前后hMSH2在肝癌细胞株中的mRNA表达改变.结果 HCC标本中13.2%(5/38)发生了hMLH1启动子甲基化,68.4%(26/38)发生了hMSH2启动子甲基化;相应的非肿瘤肝组织中hMLH1,hMSH2启动子甲基化阳性率分别为2.6%(1/38),55.3%(21/38);2例正常肝组织中未发现甲基化;6株肝癌细胞系中有5株发生了hMSH2启动子甲基化,而未发现有MLH1启动子甲基化.所有标本中均未发现有hMSH3启动子甲基化.5-aza-2′-deoxycytidine处理细胞株后,可部分或完全逆转hMSH2启动子甲基化,各细胞株的mRNA均有不同程度的表达增加.结论 hMSH3基因启动子CpG岛甲基化与HCC的发生发展关系不大.hMSH2基因甲基化与mRNA表达密切相关,是基因表达调节的一种重要方式.hMLH1和hMSH2基因启动子CpG岛的高甲基化在HCC中是一个常见的基因改变,DNA错配修复基因尤其是hMSH2基因启动子甲基化在HCC的发生中起了重要作用,是早期事件,其可能为临床诊断HCC提供新的检测指标.
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RER+结直肠癌组织转化生长因子βⅡ型受体的突变
目的检测转化生长因子βⅡ型受体(TGF-βRⅡ)(A)10、TGF-βRⅡ(GT)3、TGF-βRⅡ 452/454、TGF-βRⅡ 533、hMSH3 (A)8、hMSH6(C)8、Bax (G)8 、胰岛素样生长因子Ⅱ型受体(IGFⅡR) (G)8、IGFⅡR (CT)3等微卫星突变热点及TGF-βRⅡ点突变在RER+结直肠癌中的突变率、突变发生在肿瘤进程的哪一阶段.方法采用聚合酶链反应-单链长度多态性分析(PCR-SSLP)、微切割-PCR-SSLP、PCR-单链构象多态性分析、克隆测序、免疫组织化学对76例结直肠癌标本进行分析.结果 RER+(replication error positive)肿瘤TGF-βRⅡ(A)10突变率约为3/9,突变可发生于重度不典型增生腺瘤.其余位点未见突变.RER+结直肠癌多见于男性,发病年龄较早(P<0.05);肿瘤多位于结肠(P<0.05).结论 RER+结直肠癌多见于较年轻男性,好发于结肠,仅约三分之一病例存在TGF-βRⅡ(A)10突变;TGF-βRⅡ(A)10突变发生于重度不典型增生腺瘤,可能对RER+腺瘤进展为癌起重要作用.RER+结直肠癌在临床病例特征上与西方发达国家的病例存在差异,可能有不同的发病机制.
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错配修复基因hMSH2与突变p53在散发性消化道肿瘤中的表达
人类 DNA错配修复系统(mismatch repair system, MMR )是由一系列特异性修复DNA碱基错配的酶分子组成,此系统的存在,能避免遗传物质产生突变,保证DNA复制的高保真度[1].hMSH2是目前研究较广泛的DNA错配修复基因,它的失活可导致DNA错配修复能力的降低,引起微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI),可使癌基因激活或抑癌基因失活,诱发细胞癌变[2].我们对30例散发性消化道肿瘤DNA上hMSH2基因与肿瘤组织中突变p53的表达进行研究,以探讨hMSH2基因突变在消化道肿瘤发生中的作用.一、资料与方法1.标本:30例散发性消化道肿瘤组织标本均为河北医科大学第二医院2000年1～5月手术切除标本,取肿瘤组织和切口边缘正常组织(距肿瘤组织至少5 cm)各100 mg,迅速置-70℃冰箱保存.2.DNA提取 :采用蛋白酶K消化,酚/氯仿抽提法提取基因组DNA,并于-20℃冰箱保存.
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铅染毒大鼠胎盘组织错配修复基因突变的研究
金属及其化合物过量地进入机体会产生各种毒性效应而造成损害,严重者可以致癌[1].错配修复(mismatchrepair,MMR)基因是生物进化过程中的保守基因,具有修复DNA碱基错配、增强DNA复制准确性、维持基因组稳定性及降低自发突变的功能.
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错配修复基因hMLH3在家族性食管癌中的意义
目的:探讨错配修复基因hMLH3在家族性食管癌发生与发展中的作用.方法:应用聚合酶链反应(PCR)、变性高效液相色谱分析(DHPLC)和直接测序法对10个有遗传背景的食管癌家族(66名成员),检测hMLH3基因所有外显子(共12个)的突变.对发现的基因改变,在家系内进行分离分析,并与在96例散发性食管癌患者和96例正常对照中发生的频率相比较.结果:在4个家系中共发现了4个错义突变和3个碱基多态性,而4个错叉突变在各自家系中的发生频率均高于散发性食管癌患者和正常对照中的频率.在家系9(A2173C)和10(C2825T)中,hMLH3的突变可能具有致病性,但外显率下降;而在家系1(T3826C)和7(T3826C)的结果不支持它是单一的高风险基因.结论:hMLH3基因在某些家族性食管癌中可能为高风险基因,但外显率下降,而在某些家系中可能仅为一低风险的基因,它诱导肿瘤的产生可能通过与其他基因相互叠加、共同起作用.
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B淋巴瘤6号染色体微卫星不稳定性及杂合性缺失
目的:探讨6号染色体微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)及杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH),碱基错配修复系统GTBP和hMLH1基因蛋白在B细胞淋巴瘤(B cell non-hodgkin's lymphoma,B-NHL)发生学上的意义.方法:选取6号染色体上7对多态微卫星标记,结合PCR及银染技术,采用凝胶成像图象分析系统,分别检测58例B-NHL染色体微卫星MSI及LOH.对其中23例B-NHL细胞进行EnVinsion法检测MMR的功能基因GTBP、hMLH1的表达情况.结果:弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)与滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma,FL)中GTBP和hMLH1蛋白表达差异无统计学意义,P值分别为0.98和1.30.原发生于淋巴结内与淋巴结外的GTBP、hMLH1蛋白表达差异无统计学意义,P值分别为0.54和0.67.GTBP蛋白在高、低度恶性表达之间差异无统计学意义,P=1.00;而hMLH1蛋白表达在低度恶性较高度恶性高,P=0.99.在位点D6S275 MSI的发生率为7.5%(4/53),其中包括DLBCL 2例,FL和B-CLL/SLL各1例,LOH总的发生率达66.0%(35/53),其中包括DLBCL 19例(19/21,90.5%),FL 8例(8/13,61.5%),B-CLL/SLL 8例(8/19,42.1%),DLBCL的LOH率同B-CLL/SLL和FL相比,差异有统计学意义,P=10.60.结论:hMLH1和GTBP错配修复基因蛋白表达与B-NHL组织学类型、肿瘤的发生部位可能无关系.位点D6S275可能存在一个抑癌基因,该基因的缺失以及与错配修复基因hMLH1突变的关系对B细胞淋巴瘤的发生作用有待进一步研究.
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DNA错配修复基因与子宫内膜癌相关性研究进展
DNA错配修复(mismatch repair,MMR)基因是人体细胞中存在的一种能识别并修复DNA碱基错配的安全保障系统.近来研究发现,MMR基因缺陷可增加子宫内膜癌发病风险,与子宫内膜癌发生、发展及不良预后有关.本文综述MMR基因与子宫内膜癌相关性研究进展.
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碱基错配对短发夹RNA逆转白血病细胞耐药作用的影响
目的 探讨碱基错配对短发夹RNA(shRNA)逆转白血病细胞耐药作用的影响.方法 针对mdr1基因mRNA合成一条序列正确的shRNA及正义链少1个碱基的对应错配shRNA,构建一对抗mdr1 shRNA真核表达载体,脂质体介导转染白血病耐药细胞株K562/A02.采用实时荧光定量RT-PCR检测mdr1 mRNA表达;柔红霉素泵出实验检测P-gp外排泵功能;MTT法检测细胞对阿霉素的敏感性.结果 序列正确和对应错配shRNA真核表达载体均明显下调mdr1 mRNA的表达,降低细胞膜P-gp外泵功能,60 min柔红霉素泵出率分别为6%和10%,显著低于对照组的45%;细胞内柔红霉素平均荧光强度分别为9.51和7.09,明显高于对照组的2.80;对阿霉素药物敏感性的相对逆转率为90%和87%.结论 正义链碱基错配shRNA对RNA干扰功能无明显影响,与序列正确的shRNA一样可有效逆转mdr1所致的耐药.
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供受者HLA高分辨基因分型不合对非血缘造血干细胞移植患者预后的影响
目的 研究供受者HLA高分辨基因分型错配对非亲缘造血干细胞移植(HSCT)患者预后的影响.方法 对来源于中华骨髓库随访登记的835对供受者资料进行回顾性分析,其中急性髓系白血病(AML)288例,急性淋巴细胞白血病(ALL)227例,慢性髓性白血病(CML)187例,骨髓增生异常综合征(MDS)52例,非霍奇金淋巴瘤(NHL)25例,再生障碍性贫血(AA)42例,地中海贫血14例.HLA.A、B、C、DRBI、DQBl高分辨基因分型采用DNA序列测定、序列特异性寡核苷酸探针和高分辨序列特异性引物分型方法.在835对供受者中HLA不相合473对,其中HLA 1个等位基冈错配159对,1个抗原错配125对,1个等位基因加1个抗原错配95对,2个等位基因错配29对,2个抗原错配20对,多个等位基因加抗原错配45对.随访截止到2011年3月.结果 供受者HLA全相合总体生存(OS)率高于HLA不相合者(分别为79.83%和73.15%),差异无统计学意义(P>0.05),但HLA的1个等位基因加1个抗原错配是影响HSCT患者OS、无病生存和移植相关死亡率的重要危险因素.不同疾病类型患者的0s率从高到低为地中海贫血、AA、CML、MDS、AML、NHL和ALL.HLA位点错配的受者OS率分别为DRBI 94.4%、DQBl 83.3%、B 75.0%、A 74.4%和C 71.4%.1个等位基因错配的受者OS率从高到低为DRBI、C、A、B和DQBI.A、B、C位点错配的受者OS率和Ⅱ~Ⅳ度急性移植物抗宿主病(aGVHD)发生率与全相合受者比较差异均有统计学意义(P值均<0.05).优先考虑供受者HLA错配类型为B*15:01/B*15:05、DRBI*12:01/DRBI*12:02、C*04:01/C*03:04和DQBI*03:02/DQBI*03:03.供受者为B*39:01/B*39:05、C*15:02/C*14:02、C*08:01/C*03:04和C*07:02/C*15:02错配是影响移植患者OS率和aGVHD发生的危险因素.结论 HLA-A、B、C、DRBl和DQBl高分辨基因分型对筛选供受者HLA不允许错配类型,进而选择合适无关供者进行HSCT有重要意义,并可改善移植患者的存活率.
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错配修复系统缺陷对肿瘤放化疗的影响
在肿瘤干细胞和增殖性肿瘤细胞中,广泛存在错配修复(MMR)系统的功能缺失.对于接受化疗的肿瘤,若MMR缺失,可导致细胞绕过细胞周期的G2/S期循环阻滞,产生对化疗药物的抗性.在临床上,即使是O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶阴性的胶质瘤细胞也会因MMR的缺失,对替莫唑胺产生抗性.对于接受放射治疗的肿瘤,MMR缺失的作用表现为相互矛盾的两个方面:首先,MMR缺失可导致肿瘤细胞对辐射抗性的提高,细胞不出现凋亡和自吞噬；另一方面,预先给予放射增敏剂5-碘-2'-脱氧尿苷(IUdR)等药物后,MMR的缺失会导致DNA中掺杂大量未被修复的IUdR等基团,从而提高肿瘤细胞的辐射敏感性.
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DNA错配修复基因与肿瘤
肿瘤是由基因突变引起,基因突变可由致癌剂引起,也可由DNA代谢过程中的碱基错配引起,为保证遗传物质的完整性和稳定性,细胞有许多防止基因突变的系统.这些系统包括①切除修复②损伤碱基的直接修复③错配修复④重组修复⑤跨损伤DNA合成.错配修复基因能纠正由于DNA重组和复制产生的碱基错配,在细菌中,MMR的缺陷将导致发生异常病变.人类MMR失活也可导致基因变异,从而引起遗传性非息肉性结直肠癌和其它癌症.近的研究发现MMR系统不仅通过纠正由于DNA重组和复制产生的碱基错配而保持基因组的稳定和真实,而且通过诱导DNA受到严重损伤细胞的凋亡而消除由突变细胞生长而形成的癌变.
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胃癌和癌旁组织中hMSH2和p27蛋白的表达及其意义
背景:错配修复(MMR)基因是保证DNA复制高保真度的重要基因,与消化道肿瘤的发生密切相关.抑癌基因p27可阻止细胞周期G1/S期转换,p27表达下调在肿瘤的进展、转移过程中起有一定作用.目的:探讨MMR基因hMSH2和p27在胃癌和癌旁组织中的表达及其意义.方法:以免疫组化方法检测93例胃癌患者癌组织和癌旁组织中hMSH2和p27蛋白的表达.结果:胃癌组织中hMSH2蛋白的阳性表达率为65.6%,显著高于癌旁组织的38.7%(P＜0.01);p27蛋白的阳性表达率为46.2%,显著低于癌旁组织的80.6%(P＜0.01).胃癌组织中hMSH2蛋白的表达与肿瘤临床病理特征无相关性;p27蛋白的表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期相关.hMSH2和p27蛋白在胃癌组织中的表达呈负相关.结论:MMR基因hMSH2表达异常和抑癌基因p27表达下调可能与胃癌的发生有关.
关键词： 胃肿瘤 碱基错配 hMSH2 周期素依赖激酶抑制剂p27 免疫组织化学 -
错配修复基因hMLH1表达与胰腺癌临床病理特征的相关性
环境中的有害因素会导致DNA突变和错配,机体正常的DNA复制过程也会发生碱基错配.正常细胞具有纠正DNA复制错误的错配修复系统.hMLH1是DNA错配修复的控制基因.已有研究发现,错配修复基因hMLH1的改变与一部分肿瘤尤其是消化道肿瘤有密切关系.hMLH1基因表达是否与胰腺癌的发生及临床病理特征存在相关性,值得讨论.本研究通过检测胰腺癌错配修复基因hMLH1蛋白表达及启动子甲基化,探讨其与胰腺癌临床及病理特征的关系.
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错配修复酶与消化道肿瘤研究进展
在DNA正常代谢中,碱基错配、插入、缺失或重排都可导致基因重组DNA复制错误.如果DNA复制前这些错误不能矫正,造成的突变就固定在基因组内,这些突变是导致人类许多疾病(包括肿瘤)的重要原因.目前认为对DNA损伤的修复,主要存在两种机制,一种是切割修复,主要对各种因素造成的DNA结构改变(如形成胸腺嘧啶二聚体、致癌物与DNA形成的加成物等)进行修复,该机制修复能力强大,能修复许多内外因素造成的DNA损伤;另一种是错配修复(mismatch repair),对DNA复制中重复序列的错配进行修复,它可修复DNA复制中产生的单个碱基的错配及重复序列常易产生的滑动错配(slipped mismatch).
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局部寡核苷酸诱导小鼠毛囊角蛋白17基因改变的基因治疗研究
目的研究体内角质形成细胞基因修改的可能性.方法通过RNA-DNA寡核苷酸(RDO)或单链DNA寡核苷酸(ssODN)局部皮肤注射的方法,诱导毛囊角蛋白17(K17)(R94P)显性突变.注射的K17A-RDO或K17A-ssODN含有一个单碱基错配(CGC到CCC),从而引起该氨基酸的替换.注射的混合物由上述寡核苷酸和阳离子脂质体组成.分别于小鼠出生后第2天和第5天进行皮内注射.第8天取皮肤活检.结果组织学检查发现注射K17A-RDO的7只小鼠中有5只和注射K17A-ssODN的5只小鼠全部有毛发生长明显异常.其主要表现为毛囊内毛干在皮脂腺水平扭曲盘绕或断裂,个别毛囊毛球部碎裂,黑素颗粒滴落到周围真皮中,有些切片中还可见表皮囊肿.注射部位生长期Ⅳ～Ⅵ期毛囊数减少50%.阴性对照组均未显示明显毛发生长异常.从组织切片上分离异常毛囊并提取DNA,PCR扩增后DNA测序和非限制性内切酶酶切证实,K17基因由正常的CGC变成了CCC.结论局部注射K17A-RDO或K17A-ssODN可以导致特异性靶基因K17的定点突变,引起可见的毛发生长异常.
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遗传性非息肉病性结直肠癌
遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)是一种由错配修复(MMR)基因突变造成的常染色体显性遗传病.作为大肠癌的一个重要临床亚型,HNPCC约占全部大肠癌的5%～15%.MMR基因的种系突变和微卫星不稳定(MSI)是其分子遗传学基础.由于HNPCC的遗传病因特殊、临床病理特点突出,是目前大肠癌和遗传性肿瘤的研究热点.
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DNA MMR及MSI在结直肠肿瘤中的作用
DNA错配修复(MMR)系统是一个严格的校对者,鉴别及纠正复制时错配的DNA碱基.DNA错配修复基因在维持基因组的稳定性方面起着重要的作用.微卫星是真核基因组中含1～6个碱基的高度多态的重复序列.微卫星不稳定性(MSI)的产生就是由于DNA复制错误(RER)引起的简单重复序列的增加或丢失,它与MMR相关基因的异常有关.DNA MMR缺损的肿瘤基因组中常出现大量的MSI,也称RER阳性或RER表型.现综述有关DNA错配修复基因及MSI与遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)和散发性结直肠癌之间在肿瘤的发生、发展及预后方面的研究进展.
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脑胶质瘤中hMLH1、hMSH2基因启动子区的甲基化状态研究
目的 检测脑胶质瘤中hMLH1、hMSH2基因启动子区的甲基化状态,探讨其在肿瘤发生中的作用.方法 采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)方法,检测51例脑胶质瘤标本及人脑胶质瘤U251细胞株的hMLH1、hMSH2基因启动子C_PG岛甲基化状态.结果 在7例正常脑组织中,用MSP法检测的hMLH1、hMSH2基因启动子区均未发现甲基化,51例脑胶质瘤组织中,hMLH1、hMSH2甲基化率分别为13.7%(7/51)、35.3%(18/51),且为甲基化和非甲基化共存,人脑胶质瘤U251细胞中未发生hMLH1启动子甲基化,而发生了hMSI-12启动子甲基化,hMLH1、hMSH2基因启动子区甲基化与性别、年龄、病理类型无明显相关.但hMLH1在低级别(Ⅰ～Ⅱ级)患者标本中甲基化率为0.0%(0/25),高级别(Ⅲ～Ⅳ级)患者标本中甲基化率为26.9%(7/26),差异有统计学意义(χ~2=5.69,P<0.05).结论 hMLH1、hMSH2基因启动子区甲基化状态与性别、年龄、病理类型无明显相关.hMSH2基因启动子区的CpG岛在脑胶质瘤中有中等频率的甲基化,是脑胶质瘤发生过程中的早期事件,可能与脑胶质瘤的发生相关;脑胶质瘤中hMLH1基因启动子区甲基化率较低,但hMLH1启动子区甲基化状态与病理分级有关;人脑胶质瘤U251细胞株中hMSH2基因启动子C_PG岛高甲基化.
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脑胶质瘤中hMLH 1基因表达及启动子区的甲基化状态研究
目的 检测脑胶质瘤中hMLH1基因表达及其启动子区的甲基化状态,探讨其在肿瘤发生中的作用.方法 采用免疫组化及甲基化特异性聚合酶链反应方法 ,检测51例脑胶质瘤hMLH1基因表达和启动子区甲基化状态.结果 hMLH1阳性表达率为78.4%(40/51),甲基化率为13.7%(7/51),均与性别、年龄、病理类型无相关性.hMLH1在低级别 (Ⅰ～Ⅱ级)胶质瘤和高级别 (Ⅲ～Ⅳ级)胶质瘤中的阳性表达率分别为92.0%(23/25)和65.4%(17/26),两者差异显著(P<0.05).hMLH1在低级别 (Ⅰ～Ⅱ级)和高级别胶质瘤中hMLH1启动子区甲基化率分别为0.0%(0/25)和26.9%(7/26),两者差异显著(P<0.05).hMLH1表达阳性的胶质瘤和表达阴性的胶质瘤中启动子区甲基化率分别为7.5%(3/40)和 36.4 %(4/11),两者差异显著(P<0.05).结论 hMLH1基因在胶质瘤中表达及启动子区甲基化状态与胶质瘤病理分级有关,hMLH1可能在胶质瘤的发展中起作用,其启动子区甲基化可能负调控hMLH1基因表达.
