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四物汤对Caco-2细胞P-糖蛋白功能和表达的影响
研究四物汤对Caco-2细胞P-糖蛋白(P-gp)功能和表达的影响.采用实时定量聚合酶链式反应(Q-PCR)分析Caco-2细胞上MDR1基因mRNA的表达量;采用流式细胞仪检测经四物汤水煎液处理后Caco-2细胞对罗丹明123摄取量的影响,以评价P-gp的外排功能;采用Western blotting法检测四物汤水煎液对Caco-2细胞P-gp蛋白表达量的影响.与空白对照组比较,四物汤水煎液3.3,5.0,10.0 g· L-1孵育Caco-2细胞24,48,72 h对MDR1基因mRNA的表达量具有上调作用,表明四物汤水煎液对MDR1具有诱导作用;四物汤水煎液作用于Caco-2细胞48 h后,细胞内罗丹明123的摄取量分别减弱了16.6％,22.1％ (P＜0.05),45.4％ (P ＜0.01),提示长期应用四物汤水煎液,可增强Caco-2细胞P-gp的外排功能;四物汤水煎液孵育Caco-2细胞48 h后,上调了Caco-2细胞膜上P-gp蛋白表达量,表明四物汤水煎液对P-gp的蛋白表达量具有诱导作用.
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丹酚酸A逆转肺癌多药耐药基因MDR1相关microRNA的筛选与鉴定
通过将人肺癌A549细胞分为正常对照组和给药组,采用实时定量PCR对MDR1的表达水平进行测定.运用microR-NA芯片对给药组和对照组进行microRNA表达谱分析;采用Targetscan预测上调microRNA中与多药耐药基因MDR1相关的miRNA以及实时定量PCR的方法对筛选出的miRNA进行验证,研究丹酚酸A逆转肺癌多药耐药基因MDR1相关microRNA.实验结果表明,与对照组相比,给药组MDR1的表达水平明显下调;microRNA芯片对人肺癌A549细胞的给药组和对照组进行了miRNA表达谱分析,共筛出426个差异表达的miRNA;然后对差异表达上调的miRNA进行靶基因预测,发现有4个明显上调的miRNA与多药耐药基因MDR1相关.对4个miRNA进行实时定量PCR验证,结果与芯片一致.因此认为丹酚酸A下调肺癌多药耐药基因MDR1可能是通过影响miRNA表达进而调控靶基因,对进一步阐明中药逆转多药耐药作用机制提供了实验依据.
关键词： 丹酚酸A 多药耐药 MDR1 microRNA芯片 肺癌A549细胞 -
长春新碱降低由转染A20 siRNA促进的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系增殖
目的 研究A20小分子干扰RNA片段(siRNA)对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞(OCI-LY1)增殖和多药耐药基因(MDR1)表达的影响.方法 分对照组、转染组、长春新碱干预组(VCR)组和转染+VCR组.用脂质体转染法将A20 siRNA转入OCI-LY1细胞,MTT法检测细胞对VCR的敏感性;流式细胞计量术检测细胞凋亡;用real-time PCR检测A20及MDR1 mRNA;用Western blot检测细胞内A20、Pgp蛋白及核蛋白NF-κB的表达.结果 1)A20 siRNA转染后,细胞增殖能力增强(P<0.05),VCR刺激后转染细胞的增殖曲线下降缓慢.2)转染细胞凋亡率明显低于对照组,VCR刺激24 h后OCI-LY1细胞凋亡率较加药前明显增加(P<0.05),VCR组凋亡率比转染+VCR组增高的幅度大(P<0.05).3)转染后,A20 mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.001),NF-κB蛋白(P<0.001)、MDR1 mRNA(P<0.001)和Pgp (P<0.001)表达都明显增高;但MDR1 mRNA 和Pgp在药物刺激后表达降低(P<0.05),且VCR组较转染+VCR组降低的幅度大(P<0.01).结论 A20 siRNA能有效的增强OCI-LY1细胞内NF-κB的表达,使得MDR1基因及编码蛋白Pgp蛋白增强,从而抑制细胞凋亡、促进细胞增殖;VCR刺激后细胞内MDR1 mRNA和Pgp的表达明显降低,A20 siRNA则减弱了VCR的这一作用.
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急性淋巴细胞白血病耐药机制的研究进展
急性淋巴细胞性白血病是一种从淋巴细胞起源的恶性克隆性疾病.急性淋巴细胞白血病的治疗包括化疗,造血干细胞移植,免疫治疗,分子靶向治疗等,目前在临床上首先以化疗取得完全缓解后再选择其他治疗,但白血病细胞对化疗药物的耐药成为急性淋巴细胞白血病治疗过程中的主要障碍.目前关于急性淋巴细胞白血病耐药机制的研究非常活跃,本文将从经典耐药机制,如膜转运蛋白、基因改变,以及新的耐药机制,如骨髓微环境的改变、微小RNA(Micro RNA)等方面作一综述.
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急性淋巴细胞白血病耐药细胞株的建立及耐药机制的研究
目的:构建耐阿霉素的急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞株,并探讨其耐药机制.方法:采用阿霉素(ADR)小剂量浓度递增间歇诱导SUP-B15(Ph+)和RS4;11(Ph-)细胞,建立SUP-B15/ADR和RS4;11/ADR耐药细胞株;应用CCK-8法检测细胞的活力与增殖;Western blot检测P-糖蛋白(P-gp)的表达;RT-PCR检测MDR1基因的表达.结果:成功构建ALL耐药细胞株SUP-B15/ADR和RS4;11/ADR,耐药指数分别为14.088±0.763和10.473±1.024.冻存的SUP-B15/ADR和RS4;11/ADR细胞复苏后,细胞存活率分别为88.4±1.2％和89.3±1.6％,耐药指数分别为13.976±0.967和10.342±0.846,与冻存前相比差异无统计学意义(P＞0.05).撤药培养1个月,2株细胞的耐药指数明显降低,分别为12.893±1.255和9.327 ±0.321(P＜0.05).SUP-B15/ADR和RS4;11/ADR细胞对阿糖胞苷的耐药指数分别为3.459±0.451和3.992±0.795,对依托泊苷的耐药指数分别为3.564±0.365和3.654±0.251.MDR1和P-gp在耐药细胞中的表达较亲本细胞增高.结论:小剂量浓度递增间歇诱导法可成功诱导出ALL耐阿霉素细胞株,其耐药机制是上调MDR1与P-gp的表达.
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NF-кB活化及WT1、MDR1的表达在急性非淋巴细胞白血病中的临床意义
本研究通过观察初治与难治急性非淋巴细胞白血病中NF-κB活性及WT1、MDR1的表达水平,探讨三者在急性非淋巴细胞白血病疗效中的作用与相互关系,为寻找新的改善难治急性非淋巴细胞白血病疗效的方法提供理论依据.急性非淋巴性白血病患者45例,其中初治组20例(A组),难治组25例(分为B、C两组).以15例单纯缺铁性贫血患者作为对照组.采用凝胶电泳迁移分析(EMSA)法检测各组病人NF-κB的活化水平,用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)法检测各组病人WT1及MDR1的表达水平.结果发现,在对照组未检测到NF-κB活化及WT1和MDR1表达;在初治组中NF-κB的活化水平、WT1和MDR1表达水平均明显低于难治组,而在难治B、C两组中三者无明显区别;各组病人细胞中NF-κB活化水平与WT1及MDR1的表达水平呈正相关.结论:NF-κB的活化,WT1、MDR1的高表达可能是急性非淋巴细胞白血病难治的原因之一,急性非淋巴细胞白血病中NF-κB的活化水平与WT1、MDR1的表达呈正相关.
关键词： NF-κB WT1 MDR1 急性非淋巴细胞白血病 -
某些中药对K562/A02细胞Mdr1基因及其表达产物的影响
本研究探讨中药复方当归注射液、马钱子碱、麻黄碱、士的宁对人红白血病多药耐药细胞株K562/A02Mdrl基因及其表达产物P-gp的影响.采用噻唑蓝(MTT)法、台盼蓝拒染法检测上述药物的细胞毒作用;采用半定量RT-PCR和Western blot分别检测上述4种中药在非细胞毒浓度(IC10)作用下对K562/A02细胞Mdr1基因及P-gp表达的影响.结果表明:复方当归注射液、马钱子碱、麻黄碱作用后,K562/A02细胞中Mdr1基因及P-gp表达降低(p＜0.01),其中马钱子碱组的作用为显著;而士的宁作用后K562/A02细胞Mdr1基因及P-gp表达无明显变化.结论:复方当归注射液、马钱子碱、麻黄碱能部分逆转K562/A02细胞的耐药性,其作用机制主要与下调K562/A02细胞Mdr1 mRNA的表达而导致细胞膜上P-gp的表达量减少有关.
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人骨髓间充质干细胞对K562细胞增殖和化疗敏感性的影响
本研究比较K562细胞与正常人骨髓间充质干细胞(MSC)黏附培养前后细胞增殖、化疗敏感性及MDR1变化,以寻找白血病耐药与造血微环境的关系.对悬浮培养和与MSC黏附培养的K562细胞绘制细胞生长曲线;用流式细胞术测定细胞周期并观察化学药物对细胞存活率和凋亡的影响;用RT-PCR技术检测MDR1基因表达.结果表明:与悬浮培养比较,黏附培养K562细胞增殖受抑,G0/G1期细胞比例增加(P＜0.05),S期细胞比例下降(P＜O.05),G2/M期细胞比例增加(P＜0.01).在柔红霉素(DNR)诱导的凋亡中,黏附培养组K562细胞凋亡受阻(P＜0.05).黏附培养未诱导k562细胞MDR1基因表达,也未使K562/ADM细胞的MDR1基因表达发生改变.结论:K562细胞与MSC黏附接触共培养,可导致K562细胞生长抑制,并产生化疗耐药,其机制可能与MDR1无关.
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白血病细胞中NF-κB调控MDR1基因、P糖蛋白及逆转耐药的研究
本研究探讨NF-κB调控的血液肿瘤细胞抗凋亡机制中是否有mdrl的参与,并通过对NF-κB的抑制希望获得血液肿瘤的耐药逆转,为难治性白血病的治疗探索一条新的道路.取不同终浓度的NF-κB抑制剂PDTC作用的,或者同一浓度作用不同时间后的K562/A02细胞,分别用免疫组织化学加计算机图像分析仪方法半定量检测每1份样本中NF-κB的活性和P-gp的表达,以及用反转录多聚酶链反应方法半定量检测每2份样本中mdrl的活性,通过统计学来分析mdr1、P-gP的表达是否与NF-κB的活化有关.结果表明:随着NF-κB抑制剂PDTC作用浓度的不断升高、作用时间的不断延长,K562/A02细胞NF-κB/p65的表达不断降低,P-gP和mdrl mRNA的表达也逐渐降低,而且三因子之间均有显著相关性.结论:通过对K562/A02细胞高表达的NF-κB的抑制可降低该细胞的mdrlmRNA和P-gP的表达,从而提高血液肿瘤细胞的放化疗敏感性.
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终末期肾脏病患者MDR1基因多态性和二氢吡啶类钙拮抗剂诱导牙龈增生的关系
目的 探讨终末期肾脏病(endstage renal disease,ESRD)患者MDR1基因多态性和二氢吡啶类钙拮抗剂(calcium channel blockers,CCB)诱导牙龈增生的关系. 方法 入选183例ESRD高血压患者,根据所使用的CCB分为3组,同时检测MDR1C3435T基因多态性. 结果 共有152例患者终纳入分析,84例发生牙龈增生,其中硝苯地平54例、非洛地平15例和氨氯地平15例,各组患者牙龈增生的发生率无显著性差异(X2=4.968,P=0.083);且MDR1C3435T基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡分布(CC=28.3％,CT=50.7％,TT=21.0％;X2=0.032,P=0.985);同时各基因型牙龈增生比例无显著差异(X2=3.690,P=0.158),3个基因型牙龈增生严重程度无显著差异(F=0.406,P=0.667). 结论 MDR1C3435T基因多态性可能与ESRD高血压患者使用CCB诱导牙龈增生无显著相关,尚需要在更大样本中进一步检验.
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热带假丝酵母菌外排泵基因与氟康唑耐药性的初步研究
目的 探讨热带假丝酵母菌外排泵基因CDR1和MDR1表达水平与氟康唑耐药的关系.方法 收集太原市中心医院检验科分离的41株热带假丝酵母菌;采用ATB FUNGU3试条进行药敏试验;RT-PCR的方法检测外排泵基因CDR1和MDR1在热带假丝酵母菌氟康唑耐药菌株和敏感菌株中的表达水平.结果 主动外排泵基因CDR1和MDR1在氟康唑耐药热带假丝酵母菌临床分离菌株中的表达均显著高于敏感菌株(0.905±0.026 vs.0.735.+0.101;0.749±0.028 vs.0.542±0.068,P均<0.05).结论 热带假丝酵母菌外排泵基因CDR1和MDR1高表达可能与氟康唑耐药相关.
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胰腺癌多药耐药细胞株BxPC-3/ADM的建立及耐药机制的初步探讨
目的 构建胰腺癌多药耐药细胞株BxPC-3/ADM,通过动态监测诱导耐药过程,探讨其耐药的可能机制.方法 逐步增加阿霉素浓度对BxPC-3细胞进行诱导,在不同的阿霉素诱导浓度,MTT法检测细胞对多种化疗药物的耐药指数,RT-PCR和Western印迹法检测细胞MDR1和MRP mRNA和蛋白的表达.结果 成功构建多药耐药细胞株BxPC-3/ADM;在0.05 μg/ml至8 μg/ml阿霉素诱导浓度,细胞对5-Fu、MMC和Gem的耐药指数无明显增加;在16 μg/ml浓度3种化疗药物的耐药指数有较明显上升,同时伴有MDR1 mRNA表达的明显增加;至32 μg/ml 5-Fu和Gem的耐药指数未再有继续上升,而MMC的耐药指数则继续上升,同时MDR1 mRNA表达未再增加,而MRP mRNA表达则明显增加.Western印迹实验显示MDR1和MRP蛋白表达变化与mRNA表达变化趋势一致.结论 MDR1基因在诱导早期的耐药中起主导作用,在后期则和MRP基因协同发挥作用.
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MDR1 RNAi表达克隆的质粒构建
目的:构建针对多药耐药基因(MDR1)的RNA干扰(RNAi)表达克隆质粒.方法:采用Invitrogen公司的Block-iTTM U6 RNAi Entry Vector Kit和BLOCK-iT Lentiviral RNAi Expression System生产表达克隆质粒.针对MDR1人工设计合成一段寡核苷酸,依照试剂盒说明书分别构建MDR1 entry clone质粒和表达克隆质粒.以MDR1 entry clone质粒瞬时转染MCF-7/ADM细胞株,MTT法测细胞对ADM的耐药性及流式细胞仪测试P-gp表达情况.抗生素筛选表达克隆、抽提质粒电泳鉴定.结果:测序证实MDR1 entry clone质粒构建正确,无任何突变.转对照质粒组和转MDR1 entry clone质粒组,P-gp表达水平分别为(31.97±1.2)%和(7.88±0.5)%,IC50分别为1.27和0.4 μg/mL.两组比较,P-gp表达和IC50差异均有统计学意义,P均＜0.05.抗生素筛选显示转化克隆对氯霉素敏感、对氨苄青霉素具抗性,抽提质粒琼脂糖凝胶电泳显示重组质粒大小符合设计要求.结论:MDR1 entry clone质粒和表达克隆质粒构建正确,为进一步阻断MDR1基因表达逆转肿瘤多药耐药奠定了基础.
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三氧化二砷诱导K562/ADM细胞凋亡中mdr1和Survivin基因的表达
目的:探讨三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)诱导白血病多药耐药K562/ADM细胞凋亡过程中mdr1和Survivin基因的表达变化.方法:应用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖活性,细胞形态学、DNA片段化和细胞周期改变观察K562/ADM细胞凋亡;流式细胞术(FCM)测定Caspase-3活性;RT-PCR检测Survivin和mdr1 mRNA的表达.结果:ATO可抑制K562/ADM细胞增殖,并出现典型凋亡形态改变,DNA电泳出现梯状条带(DNAladder);细胞周期分析显示,2～5μmol/L ATO作用24 h,细胞被阻滞在G2/M期,G1期细胞减少;72 h时Sub-G1期细胞分别为25.6%和52.9%.2～5μmol/LATO作用24～48 h,mdr1 mRNA和Survivin mRNA表达水平明显下降,48h时mdr1 mRNA的抑制率分别为83.4%和87.8%,Survivin mRNA为21.6%和68.6%.ATO作用后,Caspase-3活性明显增强,活化Caspase-3由17.9%增加到47.4%.结论:ATO降低K562/ADM细胞mdr1和Survivin基因表达,解除P-gp和Survivin对Caspases的抑制效应而促进耐药细胞凋亡.
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人肺癌组织MDR1基因多态性与P-gp表达相关性的探讨
目的:探讨人肺癌组织MDR1 C3435T和G2677T/A位点基因多态性与P-gp表达之间是否存在相关性.方法:免疫组化方法分析31例肺癌组织中P-gp的表达量,RFLP-PCR鉴定31例肺癌组织MDR1 C3435T和G2677T/A位点基因型.χ2检验分析基因型与P-gp表达量之间的关系.结果: 两位点基因型分布频率符合Hardy-weinberg平衡.免疫组化结果显示,P-gp表达量有较大差别.经χ2检验,C3435T位点基因型与P-gp表达有关,野生型与突变型和杂合型相比,差异有统计学意义,χ2=7.142,P=0.025.表达量趋势为C/C
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MDR1基因多态性与乳腺癌化疗疗效及血液毒性关系的研究
目的:探讨MDR1基因多态性与乳腺癌患者化疗疗效以及血液毒副反应的关系.方法:筛选70倒新辅助化疗的女性患者,利用PCR-RFLP技术检测其外周血MDR1 C3435T基因型,分析不同基因型患者化疗后的疗效及血液毒副反应.结果:70例新辅助化疗患者当中,3435TT基因型化疗有效率仅为23.1％,与3435CC和3435CT基因型相比差异有统计学意义(x2 =6.122,P=0.047,95％CI:0.043～0.051);血液毒性方面,3435CC型患者中性粒细胞Ⅲ～Ⅳ度减少的发生率为6.7％,较CT型(37.5％)和TT型(53.8％)发生率低(x2=7.512,P=0.023,95％CI:0.016～0.021).结论:携带MDR1 3435C等位基因的患者其化疗疗效可能较好;携带3435T等位基因的患者其中性粒细胞减少的风险可能较高.
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多药耐药基因、谷胱甘肽S-转移酶特异性siRNA逆转K562/A02细胞多药耐药
目的 研究多药耐药基因(mdr1)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)特异性siRNA逆转K562/A02细胞多药耐药性.方法 以mdr1 mRNA第79～99和GSTπmRNA第308～327核苷酸为作用靶点,合成针对靶区域序列的siRNA,克隆入pSilence2.1-U6 neo,克隆产物为pSilence-mdr1和pSilence-GSTπ,脂质体介导下转染K562/A02细胞.用实时荧光定量PCR检测K562/A02细胞mdr1和GSTπ mRNA的表达;流式细胞仪检测细胞凋亡;MTT法检测多柔比星的半数抑制浓度(IC50).结果 经酶切、测序分析表明,成功构建siRNA真核表达载体.经pSilence-mdr1转染后的K562/A02细胞株mdr1 mRNA表达量下降了71.5%,从(2.8±1.65)×108拷贝/μg RNA下降至(3.9±2.37)×107拷贝/μg RNA(P＜0.01);同时pSilence-GSTπ作用后,K562/A02细胞GSTπmRNA表达量较显示空载体pSilence2.1-U6转染组下降了39.8%,从(2.3±1.14)×105拷贝/μg RNA下降至(5.4±2.45)×104拷贝/μg RNA(P＜0.01);流式细胞仪显示空载体pSilence2.1-U6转染组细胞凋亡率为(11.65±4.06)%,pSilence-mdr1和pSilence-GSTπ共转染组细胞凋亡率为(44.98±11.27)%(P＜0.01);空载体转染组耐药指数为23,pSilence-mdr1和pSilence-GSTπ共转染组耐药指数降低为7,IC50值从转染前的(1.16±0.38)mmol/ml下降为(0.33±0.04)mmol/ml(P＜0.01).结论 siRNA真核表达载体pSilence-mdr1、pSilence-GSTπ对K562/A02细胞株多药耐药性具有明显的下调作用.
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多药耐药基因多态性与异维A酸人体药代动力学差异关联性研究
目的 研究多药耐药基因MDR1基因多态性时异维A酸人体药代动力学(药动学)的影响.方法 21例健康男性受试者单次口服40mg异维A酸胶丸,提取外周血基因组DNA采用等位基因特异扩增法(allele-specific amplification,ASA-PCR)对MDR1外显子(exon)12(C1236T)、exon21 (G2677T/A)、exon26(C3435T)位点进行基因分型检测；高效液相色谱-串联质谱法( HPLC/MS)分析受试者异维A酸血药浓度并计算相关药动学参数,比较不同基因型药动学参数差异.结果 MDR1exon12(C1236T)的不同基因型异维A酸的体内某些药动学参数有差异.与野生型组相比,变异型组Cmax、Tmax有所增加,但差异无统计学意义(P值分别为0.057、0.252)；AUC 0～60显著提高(P=0.049)、T1/2及MRT明显缩短(P值分别为0.011、0.035).MDR1 exon21 (G2677T/A)的不同基因型异维A酸的体内各项药动学参数差异无统计学意义.MDR1 exon26(C3435T)参数T1/2、MRT、AUC 0～60在杂合型组与变异型组之间差异无统计学意义,变异型组Cmax有所增加,差异无统计学意义；变异型组Tmax显著小于杂合型组(P=0.03).结论 MDR1 C1236T变异型组体内异维A酸吸收略有增多,T1/2、MRT缩短,异维A酸的体内代谢明显加快.虽然MDR1G2677T/A及MDR1 C3435T之间存在显著遗传连锁不平衡关系,且对P糖蛋白(P-gp)的功能影响较大,但本研究结果显示这两个位点基因突变对异维A酸的体内过程影响不显著.
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多重耐药基因多态性对肾移植患者他克莫司血药浓度／校正剂量比值的影响
目的：研究汉族人群多重耐药基因（ MDR1） C1236T、G2677T／A和C3435T基因多态性对肾移植患者他克莫司血药浓度／校正剂量比值的影响。方法用基因芯片法对101名健康志愿者和56例肾移植患者的 MDR1C1236T、G2677T／A和C3435T这3个位点进行基因多态性分型检测，随机选取50个位点进行DNA测序来验证基因芯片法。测定56例患者在术后7，14 d、1，3，6个月空腹服用他克莫司的血药浓度，比较不同基因型在该时段内的他克莫司血药浓度／校正剂量（ C／D）比值之间的差异。结果在健康志愿者样本人群中MDR1C1236T、G2677T／A、C3435T 的突变频率分别为43.05％，14.90％，40.10％，与本研究中的56例肾移植患者的突变频率基本一致，符合Hardy－Weinberg平衡。 MDR1C1236T、G2677T／A和C3435T的基因多态性在肾移植术后6个月内不同时间点他克莫司血药浓度／校正剂量比值比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 MDR1C1236T、G2677T／A和C3435T的基因多态性与肾移植患者服用他克莫司C／D比值无显著相关性。
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浅谈基因检测在乳腺癌中的应用
伴随着人类基因组的斐然成果,在循证医学的浪潮推动下,基因组学、RNA 组学和表达组学等各种生命科学组学与医学领域交融,转化,率先在肿瘤个体化治疗领域进入了NCCN 肿瘤临床治疗规范.在一系列转化应用中,基因检测用于肿瘤转化医学靶向治疗和个体化化疗,不仅是肿瘤医药学领域里程碑式的革命,也开辟了肿瘤药物基因组学个体化治疗的新时代.本文主要简单介绍基因检测在乳腺癌中的应用.
