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不同串联重复序列位点组合用于中国结核分枝杆菌基因分型的能力比较分析
目的 初步评价不同串联重复序列(VNTR)位点在中国8省市结核分枝杆菌基因分型中的应用,寻找适合中国地区结核分枝杆菌基因分型的位点组合.方法 从中国8个省(市、自治区)2800余株结核分枝杆菌临床分离菌株中以简单数字表法随机抽取140株,采用多位点数目可变串联重复序列分析方法(MLVA)对27个数目可变VNTR位点进行基因多态性检测,采用BioNumerics数据库软件进行单位点和不同位点组合的分辨率(Hunter-Gaston指数,HGI)分析,并比较分析其对140株菌的基因分型鉴定能力.同时采用间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)将140株菌分为北京家族和非北京家族,评价上述不同VNTR位点组合在北京家族和非北京家族中的分型能力.结果 140株菌主要可分为2个基因群,即北京家族112株,占80%;非北京家族28株,占20%.Spoligotyping分型对140株结核分枝杆菌的HGI为0.4589.MLVA分析结果显示不同位点在不同菌株群存在明显的多态性,不同位点的HGI具有较大差异(0~0.809),对全部菌株、北京家族菌株、非北京家族菌株的HGI达到0.5以上的VNTR位点数分别为8、7和14个.27个VNTR位点进行不同的位点组合:优化筛选的8位点组合、国际推荐的12个、15个和24个位点组合.4个组合的HGl分别为0.9991、0.9882、0.9980和0.9986;在北京家族菌株中,上述组合的HGI依次为0.9987、0.9318、0.9969和0.9975;在非北京家族菌株中分别为1、0.9894、1和1.结论不同的VNTR位点和不同VNTR位点组合在中国8省市结核分枝杆菌中的HGI均存在明显差异;本研究优化的8个位点组合MLVA分型方法在中国结核分枝杆菌流行病学研究可能具有良好的应用前景.
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一种新的沙门氏菌成簇重复序列的预测方法
目的:建立一个新的、直观的鉴定和显示细菌基因组成簇重复序列的方法,了解沙门氏菌基因组成簇重复序列的组成特征。方法直接将细菌的基因组用滑动窗口法切割成重叠片段,每一个片段自体比对,利用PipMaker生成共线性图。通过共线性图特征识别成簇重复序列区。结果用所设计方案-成簇重复序列预测器( CRpred)对鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株基因组进行扫描,总共鉴定出151个成簇重复区。特征分析表明,这些成簇重复区包含低拷贝简单串联重复、高拷贝简单串联重复、间隔串联重复、反向回文重复和反向间隔重复等5种类型。此外,沙门氏菌基因组中有9个复杂重复区域无法使用上述模式进行归类。结论提出了一个新的、简便直观的基因组成簇重复序列的鉴定方法,为搜寻成簇的、规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、数目可变串联重复序列(VNTR)以及其他重复序列相关研究提供支持。
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副突变及其表观遗传机制的研究进展
经典遗传学的研究方法为许多遗传性疾病和遗传相关性疾病的预防、诊断和治疗提供了在分子水平上的直接线索,然而人类疾病的遗传表现始终存在着经典遗传学法则所不能解释的现象。副突变(paramutation)是上世纪50年代首次在玉米中发现的一种非孟氏遗传模式,其传递的等位基因不存在核苷酸序列的差异,提示了表观遗传机制可能参与了基因表达和表型的可遗传变化。近期的研究发现关于副突变现象的解释可能涉及一种新的表观遗传学调控机制,即由 RNA(特别是非编码 RNA)引发的基因组改变参与了副突变的发生和维持。其中 DNA 甲基转移酶 II 所介导的 RNA 甲基化发挥了极其重要的作用。对副突变及其机制的研究不仅能够深化人类对遗传和生命本质的认识,还有助于开拓在生物工程和疾病诊疗等应用领域的新思路。本文综述了副突变的分子机制和研究进展,并且探讨了副突变在疾病研究和基因治疗中的应用前景。
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CRISPR/Cas9基因编辑/修饰系统的应用研究进展
成簇、规律间隔短回文重复序列( clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关序列(CRISPR associated sequences,Cas)9基因编辑/修饰系统是源于细菌及古细菌中的一种后天免疫系统,其介导的基因编辑由向导RNA( guide RNA, gRNA)引导Cas9核酸酶对DNA进行切割[1]。
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更正
发表于本刊2012年11月第32卷第11期的《2010—2012年北京地区儿童肺炎支原体流行基因型监测》,为根据2009年Dégrange等[1]新建立的多位点可变数目串联重复序列分析,即MLVA分型方法,对北京地区2010—2012年儿童肺炎支原体流行基因型监测的研究数据报道。2015年本文作者与英国科学家V. J. Chalker等6个国家的专家共同对肺炎支原体的MLVA分型方法进行了国际标准研究,提出了统一的MLVA分型[2]数据处理标准,即将部分实验室“四舍五入”的重复序列处理方法统一为“逢小数进一”的重复序列处理方法。例如,数据分析中Mpn13位点的重复序列数目为3.19,则重复序列数目记为4。
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Ⅱ型成簇恒间隔短回文序列及相关蛋白系统(CRISPR/Cas)研究近况
1987年在大肠杆菌K12的碱性磷酸酶( iap)基因的3′侧翼区首先发现了一类具有短回文特质的DNA重复序列[1]。2002年,这类结构被正式命名为成簇恒间隔短回文重复序列(CRISPR),CRISPR关联蛋白也同时得以命名[2]。2005年,3个研究课题组同时发现间隔序列可能源自于细菌染色体外的其他遗传物质,如噬菌体和接合质粒,并推论CRISPR/Cas系统可以抵制入侵的外源 DNA[3-5]。2007年,来源于侵染噬菌体的新的整合间隔序列得到实验验证;研究同时建立了新获得的间隔序列与细菌抵抗该噬菌体侵袭的直接关联关系,证明了CRISPR/Cas系统是抵抗噬菌体的获得性免疫系统[6]。 Marraffini和Sontheimer[7]证实CRISPR/Cas系统对于接合现象和质粒转化的干扰作用。近基于CRISPR/Cas作用机制的研究,发现了其在细菌毒力、致病性以及如何逃避宿主免疫系统等方面的相关作用[8]。
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脂联素相关研究进展
一、脂联素的结构及受体1.脂联素基因学和蛋白质结构:人类脂联素基因的编码基因为apM1,位于染色体3q27上,由3个外显子和2个内含子组成.人类脂联素的蛋白质结构含有244个氨基酸,包括N-端信号肽、C端芳香族氨基酸球状序列、N端特异的非胶原序列,其后紧接着一段类似胶原的G-X-Y3氨基酸重复序列[1].经过翻译加工修饰可以生成8种同源蛋白.其中C端芳香族氨基酸球状序列是脂联素蛋白活性的关键部位,这一结构域与胶原Ⅷ、X、补体c1q和TNF-α家族具有结构上的同源性[2].
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膜联蛋白A2异常表达与消化道肿瘤发生、发展的关系
联蛋白(annexin,ANX)是一类受Ca2+调节、能够结合带负电荷膜磷脂的蛋白超家族,家族有12个成员(A1-A11,A13),它们的基因定位及相互作用蛋白见表1[1],蛋白分子包含数个长重复序列的同源性区域,每个长重复序列由70个氨基酸组成,含有凸面和凹面.凸面面向胞膜,包含钙离子和磷脂结合位点,凹面包含氨基末端和羧基末端,广泛存在于细胞质膜下、储Ca2+细胞器附近、核内及细胞基质中并参与一系列细胞活动,如胞吐、胞吞、细胞增殖、分化和凋亡、细胞骨架活动、信号转导等.其中ANX A2具有RNA结合的特性,与DNA合成、复制有关,其表达异常与消化道肿瘤发生发展关系密切,如介导凋亡、诱导分化等.
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重复序列引物聚合酶链反应在医院感染流行病学调查中的应用
随着医学治疗手段日益增多和细菌耐药株逐年增加,医院感染的暴发流行时有发生.绿脓假单胞菌由于在外界生长繁殖分布广泛,耐药性强,已成为当今医院尤其是重症监护室(ICU)医院感染主要病原菌之一[1].重复序列聚合酶链反应(rep-PCR)是一种新型基因分型方法[2,3].本研究通过优化反应体系,建立自己实验室绿脓假单胞菌rep-PCR分型技术,并对上海市某医院同一时期ICU病人及相关呼吸机的螺旋管、储水池及湿化器采样分离得到的绿脓假单胞菌株进行分型,并与同一时期其他病区菌株相比较.
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甲基化特异性PCR检测脆性X综合征患者FMR1基因甲基化的应用价值
脆性X综合征95%以上患者的致病分子机制是由于脆性X智力低下基因1(Fragile X mental retardation 1 gene,FMRI)5'端非翻译区一段不稳定的三核苷酸重复序列(CGG)异常扩增;和该基因上游启动子区域CpG岛的异常甲基化,使FMR1基因失活,而产生智力低下等系列脆性X综合征临床症状的疾病.我们用甲基化特异性PCR检测先天性智力低下患儿FMR1基因CpG岛的甲基化状况,并分析其在诊断脆性X综合征中的价值.现报告如下.
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肠杆菌基因间重复序列PCR指纹图谱技术分析结核分枝杆菌流行情况
目的 利用肠杆菌基因间重复序列为引物的聚合酶链反应(enterbacterial repetitive intergenic consensus-PCR,ERIC-PCR)分型技术分析我市结核分枝杆菌流行情况.方法 收集2003年9月至2006年5月门诊痰菌阳性标本,培养并提取DNA做ERIC-PCR指纹图,并利用RAPDPHYLIP及Treeview软件对其进行聚类分析.结果 122株临床分离株产生42种不同的指纹图,聚类分析结果显示可分为3簇,成簇率76.2%.指纹图谱与患者年龄、菌株的耐药性及耐药种类有关.结论 ERIC-PCR具有不需已知核酸序列,分辨效果好,简便快捷等优点,是进行分子流行病学调查的有效工具.我市结核病呈高水平传播,主要为耐药菌株并以中青年患者传播为主.
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CDKI p27Kip1及其在结(直)肠肿瘤中的研究
细胞周期进程受到一系列细胞周期素(cyclins),细胞周期素依赖性激酶(CDKs)复合物的正性调控,而细胞周期素依赖性激酶抑制因子(CDKI)是一类通过抑制cyclin-CDK复合物的蛋白激酶活性,阻断其对pRb的磷酸化作用,从而实现细胞周期完整精确调控的负性调控因子.已发现的CDKI依其构效性质可分为两大家族:INK4家族包括p16INK4a,p15INK4b,p18INK4c,p19INK4d.这些蛋白均有4个回钩状重复序列(ankyrin repeats),能特异地与cyclinD-CDK4/CDK6形成复合物,抑制其激酶活性.Cip/Kip家族包括p21/WAF1/Cip1,p27/Kip1以及p57/kip2,这些蛋白高度同源,其羧基端均含有一双枝核定位信号(bipartitie nuclear localization signal),可与多种cyclin及CDK相结合,广谱抑制G1期cyclinE-CDK2,cyclinD-CDK4/CDK6以及其他cyclin-CDK的激酶活性.
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乙型肝炎病毒对细胞信号转导的影响
0引言乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒的一种,HBVDNA长度为3.2kb,具有4个开放读码框架(ORF),分别编码HBV的表面抗原蛋白,核心/e抗原,X蛋白以及HBV DNA的聚合酶.此外,HBV DNA结构中还有4段启动子、2段增强子以及与HBV DNA复制过程密切相关的顺向重复序列1、2(DR1、DR2)等[1].
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幽门螺杆菌cagA基因及蛋白序列多态性分析
目的:结合本实验室研究结果,充分利用NCBI的核酸和蛋白数据库中检索到的CagA基因碱基和蛋白质氨基酸序列,分析其序列特征以及与地域和疾病的相关性.方法:利用Vector NTI Suite 9.0,ClastalX(version 1.8),Phylip(version 3.5)和Treeview(version 1.61)软件对检索到的幽门螺杆菌CagA基因碱基和蛋白质氨基酸序列进行多序列比较和系统发育分析.结果:检索到可以利用的全序列44条,部分序列560条.通过44条全序列比对,相似性分析和构建系统进化树,发现CagA基因碱基和蛋白质氨基酸序列可分为具有明显地域特征的东西方两类.通过44条CagA全序列和266条C端部分序列分析,发现C端相对多变区的重复序列可分为两类:第一类为菌株共有的不连续重复序列,第二类为个别菌株特有的连续重复序列,此类重复序列包含EPIYA模体的重复.序列特征与疾病的关系分析表明,非胃癌株中包含第二类重复序列的菌株占13%(9/71),胃癌株中包含第二类重复序列的菌株占3l%(12/39),X2检验P=0.021<0.05,故可以认为胃癌株中包含第二类重复序列出现率高于非胃癌株,可以认为包含第二类重复序列的菌株与胃癌有关.结论:幽门螺杆菌CagA基因及蛋白序列多态性明显,具有东西方两个地域聚类特征,重复序列可分为两类.第二类重复序列中包含EPIYA模体的重复可能导致菌株致病性增强.
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细胞壁缺陷结核分枝杆菌IS986序列的检测与分析
插入序列(insertion sequence,IS)是染色体的特殊组分,是导致染色体大片段基因突变的主要原因.许多细菌的IS在其进化及作为一种基因标志在流行病学中的作用已被证实[1],因此我们探讨细胞壁缺陷变异对结核分枝杆菌染色体DNA保守重复序列IS986的影响.
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结核分支杆菌基因组DNA指纹技术在结核病流行病学中的应用
结核分支杆菌基因组DNA指纹技术,可以在种、株水平对结核分支杆菌进行鉴定,因此在结核病学的多个领域,尤其是流行病学中有很大的应用价值。 一、结核分支杆菌基因组DNA指纹技术及标准方法的确立 将结核分支杆菌的基因组DNA采用特殊的技术切割成大小不同的片段,电泳分离,就可以清楚地看到像人的皮肤指纹一样具有特征性的条带。这就是结核分支杆菌的DNA指纹。建立结核分支杆菌DNA指纹的主要技术有:限制性片段长度多态性(RFLP)方法和聚合酶链反应(PCR)方法。RFLP方法为:针对结核分支杆菌基因组DNA上的特征片段,如插入序列IS6110[1]、IS1081[2],多态性富含GC重复序列[3],(GTG)5寡聚脱氧核苷酸[4]等,利用限制性内切酶酶切特征性片段上的某一位点,电泳分离、Southern blot而形成结核分支杆菌DNA指纹图谱。该方法具有良好的特异性和稳定性,已成为结核分支杆菌株水平鉴定的主要方法[5,6]。PCR方法为:针对结核分支杆菌基因组DNA上的特征片段,如IS6110、DR[7]、16S rDNA[8],设计特异的引物进行多种方式的聚合酶链反应,电泳分离,而形成结核分支杆菌DNA指纹图谱。该方法简单快速,但特异性和稳定性不及RFLP方法,目前作为RFLP方法的补充。
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γ-干扰素基因多态性与肺结核易感性的研究
γ-干扰素是参与结核病发病的一个细胞因子,在结核病的发病机制中起着重要作用.在γ-干扰素第1个内含子CA重复序列的5'末端有个T/A单核苷酸多态性(+874 T/A多态性),与微卫星等位基因2的出现和缺乏相关[1].我们利用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)技术对肺结核病患者及对照人群γ-干扰素+874 T/A多态性进行检测,以探讨该基因多态性与肺结核易感性的关系.
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Toll样受体4基因Asp299Gly多态性与溃疡性结肠炎及大肠腺癌
溃疡性结肠炎(UC)是一种主要累及直肠及结肠黏膜的慢性非特异性疾病,有癌变的可能,病因涉及遗传、免疫、环境等因素.大肠癌的发生也与基因和环境因素有关,而环境因素致癌终取决于个人对肿瘤的易感性.Toll样受体(TLR)4通过其亮氨酸重复序列区域识别并结合细菌脂多糖(LPS),活化NF-κB及炎症因子转录,产生炎症[1].TLR4基因突变使肠黏膜先天性免疫细胞和肠上皮TLR4分子结构发生改变,引起免疫系统失常,导致机体处理肠腔内大量细菌和LPS等病原分子的能力下降,进而使肠黏膜在长期刺激下产生感染、炎症、过敏、易激乃至癌变[2].我们运用PCR-限制性片段长度多态性分析(RFLP)技术探讨TLR4基因Asp299Gly多态性与UC及大肠腺癌的关系,以阐明疾病的遗传易感性.
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补体C1q肿瘤坏死因子相关蛋白1与动脉粥样硬化风险因素
脂肪组织是机体能量的储存器官.近年研究表明脂肪细胞是重要的内分泌器官,可以分泌一系列细胞因子,参与体内的物质代谢及免疫炎症反应.补体C1q肿瘤坏死因子相关蛋白1(CTRP1)是新近发现的脂肪细胞因子,与高血压、糖脂代谢紊乱及肥胖有关.本文对近年有关CTRP1分子生物学特性及其与动脉粥样硬化风险因素的研究现状综述如下.一、CTRP1的分子结构CTRP是与肿瘤坏死因子α(TNF-α)具有相似空间结构的蛋白,均含C末端球形结构域和N末端信号肽.CTRP1是CTRP超家族成员之一,Wong等[1]发现它与脂联素也有高度相似的空间结构,都包括1个N末端信号肽、1个短的可变结构域、1个包含不同长度Gly-X-Y(X、Y可代表任意氨基酸)重复序列的胶原结构域和1个与补体蛋白C1q同源的C末端的球形结构域.尽管与脂联素的空间结构相似,但两者没有高度同源的核酸及氨基酸序列,仅有4个同源高度保守的氨基酸残基(Tyr-161、Gly-159、Phe-237和Leu-242)形成疏水核.
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肝细胞癌端粒酶表达和DNA含量定量分析
端粒酶通过合成端粒重复序列使肿瘤细胞具有无限增殖的特性.在人类多数肿瘤中已检测到了端粒酶活性.本文采用细胞免疫荧光染色技术及流式细胞术对肝细胞癌组织端粒酶和DNA含量进行定量检测,现将结果报道如下.