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2013-2014年青岛市柯萨奇病毒B5型手足口病病原学及重症病例临床特征
目的 分析青岛市感染萨奇病毒B5(CV-B5)手足口病病例的分子特征及其所致重症病例的临床特征.方法 以2013—2014年青岛市妇女儿童医院常规监测的手足口病病例为研究对象,共1 844例,收集其咽拭子标本和脑脊液标本;采用回顾性研究的方法,收集研究对象的临床资料.对标本进行病毒核酸提取和分型鉴定;采用RT-PCR对CV-B5病毒株进行VP1基因全长扩增,并进行序列测定.采用MEGA 7.0软件进行系统进化分析及分子特征分析;并与原型株Faulkner毒株进行比较,其VP1氨基酸序列来源于GenBank数据库.结果 共获得CV-B5阳性病例8例,其中男性4例,女性4例;住院重症病例6例,门诊病例2例.6例重症住院病例的年龄为3～48月龄,中位数为26月龄,临床症状以发热、抽搐、呕吐、腹泻、皮疹为主,均合并病毒性脑炎.在VP1区,8株CV-B5病毒株与原型株核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为77.3%～78.8%和95.5%～97.0%,氨基酸有13处变异,6株分离自重症病例毒株中有5株在VP1区发生N95S变异;在VP1进化树上,8株CV-B5病毒株全部属于D基因亚型,与同期国内其他地方毒株成一簇.结论 感染CV-B5所致重症手足口病可出现神经系统受累,主要的并发症为病毒性脑炎;CV-B5毒株在VP1区核苷酸和氨基酸变异较小,呈现一定的区域聚集性.
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上海市2002年病毒性脑炎病因病毒的分离和鉴定
采集上海市2002年69例病毒性脑炎散发病人的脑脊液(CSF)标本,用Hep-2、RD、Vero细胞分离出肠道病毒(EV)21株,经用标准血清鉴定为柯萨奇病毒B5(Coxsackie,Cox.B5)11株,Cox.B2 1株,Cox.A16 1株,埃可病毒(ECHO)3株,非脊髓灰质炎肠道病毒(NPEV)5株,Cox.B5病毒分离率为16%.本次调查结果表明,Cox.B5病毒是上海市2002年病毒性脑炎的主要病原.
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龙岩市手足口病病原体柯萨奇B5病毒基因特征分析
目的 了解龙岩市手足口病病原体柯萨奇B5病毒(Coxsackie virus B5,CVB5) VP1区基因特征及变异情况.方法 对2011年采自确诊手足口病患者的Real-time RT-PCR法检测肠道病毒通用引物阳性而肠道病毒71型(enterovirus 71,EV 71)和柯萨奇病毒A16型(Coxsackie virus A 16,CVA16)阴性未分型样品,经RD细胞分离肠道病毒.从培养上清中提取RNA核酸,经RT-PCR法初步鉴定病毒型别.应用187/222引物对扩增病毒株的VP1区,回收产物经克隆、筛选后测序.采用ClustalX、Mega5.0进行核苷酸及氨基酸序列同源性分析和进化树构建. 结果 104份未分型样品中分离到3株CVB5.3株CVB5分离株VP1区长度为330～357个核苷酸,编码110～119个氨基酸.3株间的核苷酸同源性为97％～99％,氨基酸同源性为84％～99％.比较推导的氨基酸序列,FJLY2011126h株VP1与另外2株龙岩分离株相比有18个位点差异,核苷酸序列287～288位发生插入突变,第290、291、338、339位发生颠换,与2010年长春株JN695051的同源性高(核苷酸同源性95％～98％,氨基酸同源性84％～99％). 结论 2011年福建省龙岩市手足口病患者中存在CVB5感染,病毒与2005年法国株和国内山东、长春、昆明、浙江病毒株属同一型别.
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引起河南省一起病毒性脑炎暴发的柯萨奇病毒B5的鉴定及其序列分析
目的 鉴定2011年引起河南省漯河地区一起病毒性脑炎(VE)暴发的病原体,并对分离的柯萨奇病毒B5(CVB5)进行基因特征分析.方法 采集漯河地区病毒性脑炎暴发期间29例患者的5份咽拭子、21份粪便和14份脑脊液,采用实时荧光RT-PCR方法分别检测总肠道病毒(PE)、EV71及CA16病毒核酸.所有标本均进行病毒分离培养,对其中5例患者的2份粪便和3份脑脊液的阳性分离产物进行VP1和5′-UTR区核苷酸序列测定及亲缘进化分析.结果 实时荧光RT-PCR结果显示,所有临床标本EV71和CA16病毒核酸检测均为阴性,咽拭子、粪便和脑脊液的PE核酸检测阳性率分别为60.0％(3/5)、61.9％(13/21)和85.7％ (12/14).咽拭子、粪便和脑脊液病毒分离率分别为20.0％(1/5)、25.0％(5/21)和29.0％ (4/14).VP1和5′-UTR区核苷酸序列BLAST分析及分子分型结果显示为CVB5,对其中5株分离毒株进行VP1全长基因分析显示彼此之间核苷酸同源性为97.9％ ～ 99.5％.与其同源性近的毒株是2010年引起长春手足口病暴发的CVB5分离株CC10/10/Changchun,核苷酸同源性为97.1％～98.1％.与2010及2012年河南省平顶山地区的脑炎分离株COXB5/Henan/2010和03001N/HN/CHN/2011/CB5的同源性分别为89.0％～89.6％和91.8％～92.5％.VP1区遗传进化树显示此次分离株为基因型D,且与长春株成一簇.结论 导致此次病毒性脑炎暴发的病原体为肠道病毒CVB5,优势基因型的变迁可能与此次暴发相关.
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2011-2015年安阳地区手足口病相关人肠道病毒B种病原组成及柯萨奇病毒B2、B5 VP1基因特征分析
目的：调查2011—2015年安阳地区手足口病( hand,foot and mouth disease, HFMD)相关人肠道病毒B种(HEV-B)病原组成,对柯萨奇病毒B2(CVB2)和柯萨奇病毒B5(CVB5)VP1基因特征进行研究。方法使用实时荧光逆转录 PCR 和半巢式逆转录 PCR 法对柯萨奇病毒 A16(CVA16)、肠道病毒71(EV71)以及其他肠道病毒进行鉴定,以获得完整的手足口病病原组成,统计出HEV-B病原种类及阳性比例。针对HEV-B病原中阳性病例数较多的CVB2和CVB5病原,分别以其VP1基因为靶段设计引物 PCR扩增测序后获得 VP1基因核苷酸序列全长。使用 MEGA7.0和BioEdit7.2软件对本研究获得的CVB2、CVB5序列以及GenBank数据库已收录的全部相关VP1序列构建系统发育树并进行系统发育分析。使用DateMonkey在线分析程序对我国近年来流行的CVB2和CVB5毒株的VP1基因进行选择压力分析。结果2011—2015年安阳地区共鉴定出手足口病相关HEV-B病原14种,HEV-B阳性标本57份。 HEV-B病原占手足口病全部病原种类的比例为56%, HEV-B阳性标本占总肠道病毒阳性标本的比例为3.06%。绝大多数HEV-B病原引起的手足口病呈高度散发,个别病原如 CVB2、CVB5在特定时间内的病例较为聚集。经过测序获得安阳地区8条CVB2和9条CVB5 VP1序列。构建的系统发育树显示,CVB2毒株可分为A~D四个基因型,各基因型的组间平均进化距离介于0.191~0.208,核苷酸序列相似性介于79.7%~85.8%。 CVB5毒株可分为A~F六个基因型,各基因型的组间平均进化距离介于0.170~0.285,核苷酸序列相似性介于76.0%~86.8%。 CVB2 VP1基因氨基酸序列第157、263位,CVB5 VP1基因氨基酸序列第75、90、95位在不同基因型毒株中的残基有较大差异。安阳地区CVB2序列均属于D基因型,且集中于1个分支内；CVB5序列均属于F基因型,分布于其中2个分支内。中国大陆地区近年流行的CVB2( D基因型)和CVB5(F基因亚型)毒株的进化选择压力ω值分别为0.037、0.036,未发现CVB2 VP1基因的正选择氨基酸位点,但在CVB5 VP1基因中发现6处正选择氨基酸位点。结论 HEV-B是安阳地区2011—2015年手足口病病原谱的重要组成。 CVB2、CVB5在安阳地区手足口病HEV-B病原中占有一定优势,其中CVB5 VP1基因比CVB2 VP1基因具有更为复杂和活跃的进化特征。
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2009年云南省昆明地区柯萨奇病毒B5的遗传特性分析
目的 对2009年中国云南省昆明地区柯萨奇病毒B5(Coxsackievirus group B5,CVB5)的部分VP1基因序列进行分析,以了解CVB5的遗传特性.方法 收集2009年中国云南省昆明地区临床诊断为无菌性脑炎患儿的200份粪便标本,设计针对CVB的通用引物,利用半巢式RT-PCR扩增部分VP1基因.PCR产物直接测序后,采用Omiga 和Mega 5.05等生物学软件进行核苷酸、氨基酸序列及系统进化分析.结果 共分离出7株CVB5,其部分VP1基因之间的核苷酸和氨基酸序列同源性均较高,分别为92.7％～98.5％和93.6％～100.0％;与中国其他不同地区参考株的核苷酸序列同源性为80.1％～ 99.1％,其中与中国山东株98388-SD-CHN-1998同源性较低；与中国其他不同地区参考株的氨基酸序列同源性为84.4％～100.0％,其中与中国河南株CoxB5-Henan-2010和中国山东株98388-SD-CHN-1998之间同源性低；与其他不同国家参考株比较,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别在77.5％～ 89.1％和92.1％ ～ 96.3％之间；与原型株Faulkner的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.6％ ～ 80.9％和92.1％～ 95.4％.基因系统进化分析显示,分离的7株CVB5属于相对独立的1个分枝,中国流行株除98388-SD-CHN-1998外,构成1个分枝.结论 2009年中国云南省昆明地区CVB5流行株属于相同基因型.
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2014年济南市一起聚集性病毒性脑炎的调查及快速病原学鉴定
目的 快速鉴定2014年济南市一起聚集性病毒性脑炎的病原体,分析其流行病学及病原学特征.方法 采用统一的个案调查表对住院患儿逐一进行个案调查.4例患儿均采集粪便和脑脊液标本.采用实时荧光定量(RT) PCR方法检测总肠道病毒(PE)、肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组(CVA) 16、10和6型病毒核酸;PE阳性标本采用巢式反转录PCR方法扩增5'-UTR区基因,测定核苷酸序列并进行同源性分析.结果 本起聚集性病毒性脑炎疫情首发病例出现于2014年4月8日,呈人传人的传播模式.RT-PCR结果显示,所有标本PE核酸检测为阳性,而EV71、CVA16、CVA10和CVA6核酸检测均为阴性.5'-UTR区核苷酸序列在美国生物技术信息中心网站经碱基局部对准检索工具分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)显示与肠道病毒柯萨奇病毒B5(CVB5)同源性高,彼此之间核苷酸同源性为99.2％ ～ 100.0％,与2010年河南株CVB5(HQ998851)的核苷酸同源性为96.7％～97.4％.4例患儿经积极的抗病毒、抗感染及相关对症支持治疗,均痊愈出院,无后遗症发生.结论 本起聚集性病毒性脑炎病原体为CVB5,与2010年河南株CVB5核苷酸同源性高.RT-PCR和巢式反转录PCR方法可快速、准确地鉴定肠道病毒引起的病毒性脑炎.
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柯萨奇病毒B5巢式RT-PCR检测方法的建立
目的:建立一种快速、灵敏、特异的柯萨奇病毒B5(CVB5)检测方法.方法:根据GenBank 发表的CVB5河南分离株全基因组序列,在其VP1 区设计并合成巢式RT-PCR引物,优化PCR反应条件,建立检测CVB5的巢式RT-PCR方法.将已测得TCID50的病毒标准株进行10倍梯度稀释后用上述方法检测,以评价该方法的灵敏性;将5株不同的CVB5毒株和EV71等4株其他肠道病毒毒株及阴性对照用该方法进行扩增,以检测其特异性.用建立的巢式RT-PCR方法对52份病毒性脑炎病例样本进行检测.结果:该方法对CVB5的两轮PCR扩增敏感性分别为10 TCID50和10-4 TCID50;所有CVB5毒株用该方法扩增结果均为阳性,所选其他肠道病毒扩增结果均为阴性.52份临床病例样本中检出10份CVB5阳性,阳性率为19.23%.结论:所建立的CVB5巢式RT-PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异度.
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柯萨奇病毒B5河南分离株全基因组序列测定及分析
目的:了解柯萨奇病毒B5( CoxB5)河南分离株全基因特征及与其他肠道病毒基因的关系.方法:采用RT-PCR扩增全基因,采用DNAStar中的SeqMan拼接所测序列,BioEdit进行同源性比较,Simplot进行相似度分析.结果:CoxB5/Henan/2010基因组全长7 401 bp.与原型株Faulkner相比,编码区氨基酸同源性为95.6％,核苷酸同源性为79.9％,其中VP4-VP2核苷酸差异为17.8％～20.4％,VP1核苷酸差异为19.5％,P2、P3核苷酸差异分别为19.5％、21.7％.不同型别肠道病毒间VP4-VP2核苷酸差异为14.4％ ～ 34.9％,VP1核苷酸差异为18.3％～42.3％,P2、P3核苷酸差异为17.1％～21.0％、15.5％ ～ 22.6％.结论:与原型株相比,CoxB5/Henan/2010株编码区发生沉默突变,其核苷酸变异并不影响氨基酸序列的变化；肠道病毒基因组各分区在进化中不同步.
