首页 > 文献资料
-
出入境人员丙型肝炎病毒核心蛋白基因巢式RT-PCR检测及分型研究
目的 建立一种检测丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因的巢式RT-PCR方法,以及HCV核心蛋白基因区测序分型方法.方法 从国际HCV数据库查找HCV核心蛋白基因序列,设计HCV RNA巢式RT-PCR引物及测序引物,并建立巢式RT-PCR反应体系.采用出入境人员抗-HCV阳性血清60份,及50份标本为HCV抗体检测阴性,且谷丙转氨酶(ALT)＞ 100 U/L的血清进行巢式RT-PCR检测,阳性结果使用本研究建立的测序引物进行基因测序以确定HCV基因型.结果 60份抗-HCV阳性血清中,42份(70.0％)核心蛋白基因RT-PCR扩增阳性,其中1b型27例、1a型12例、6a型1例、3a型1例、2a型1例.50份ALT＞ 100 U/L且抗-HCV阴性标本中,1份HCV核心蛋白基因RT-PCR扩增阳性,测序鉴定为3a型.结论 本研究建立了一种HCV RNA核心蛋白基因的巢式RT-PCR检测和分型方法,为出入境人员HCV的诊断和监测提供重要依据.
-
AFPmRNA和CD44V6mRNA在肝癌患者外周血中检测的临床意义
目的:建立检出原发性肝癌(PHC)患者外周血中微转移的方法,并探讨其临床意义.方法:采集PHC患者50例,40例肝良性疾病患者(10例肝血管瘤,10例肝囊肿,10例肝硬化,10例慢性肝炎),20例肝转移肿瘤患者(直肠癌肝转移10例,胃癌肝转移10例),30例健康志愿者的外周血.用RT-PCR方法检测外周血中AFPmRNA和CD44v6mRNA的表达.结果:50例PHC患者外周血中AFPmRNA和CD44v6mRNA检出率分别为50%(25/50)和58%(29/50).74%(37/50)的患者至少一种标志物阳性.AFPmRNA在肝炎肝硬化患者外周血中的检出率15%(3/20),转移性肝癌、肝血管瘤、肝囊肿患者及健康献血员中均未检出.CD44v6mRNA在转移性肝癌患者外周血中的检出率45%(9/20),肝炎肝硬化、肝血管瘤、肝囊肿患者及健康献血员中均未检出.PHC患者外周血中AFPmRNA检出率与血清AFP水平,肿瘤大小,门静脉癌栓,肝内转移无相关性(P＞0.05).与肝外转移密切相关(P＜0.05).CD44v6mRNA检出率与肿瘤大小,门静脉癌栓,肝内外转移密切相关(P＜0.05),而与血清AFP水平无相关性(P＞0.05).结论:在PHC患者外周血中联合检测AFPmRNA和CD44v6mRNA的表达,有助于提高微转移检测的灵敏度和特异性,CD44v6mRNA预测肝癌转移、复发的意义优于AFPmRNA.
关键词： 原发性肝癌 CD44v6Mrna AFPmRNA 巢式RT-PCR 微转移 -
新疆伊犁地区马群中博尔纳病病毒自然感染调查
目的 了解新疆伊犁地区马群中博尔纳病病毒(BDV)的流行状况,分析该病毒的种系来源.方法 采用改进的巢式反转录PCR(nRT-PCR)方法对新疆伊犁地区120匹马的外周血单个核细胞(PBMC)及脑组织中的BDV p24基因片段进行检测,对阳性产物进行基因序列测定和同源性分析.结果 有3匹马外周血和腩组织中同时检测到BDV,阳性率为2.5%(3/120).扩增产物序列与其他国外马源BDV分离株同源性>93%,与标准株He/80同源性达到98%以上.结论 新疆伊犁地区马群中存在BDV的自然感染.该地区BDV流行株与标准株He/80存在高度的同源性.
-
混合系白血病基因重排的检测方法及其临床意义
为了研究混合系白血病(MLL)基因重排在急性白血病(AL)中的发生率、融合基因类型及其临床意义,用荧光原位杂交技术检测60例急性白血病(AL)患者MLL基因重排,对于MLL基因重排阳性的患者,用巢式RT-PCR方法检测MLL基因重排形成的6种常见融合基因类型.结果表明:7例AL患者有MLL基因重排,发生率为11.67%,其中2例为急性髓细胞白血病M5(AML-M5),融合基因均为MLL/AF9;另5例为B细胞系急性淋巴细胞白血病(B-ALL),其中2例融合基因为MLL/ENL,1例MLL/AF4,2例未扩增出融合基因产物.结论:荧光原位杂交技术是检测AL MLL基因易位重排的快速、特异、灵敏的方法,巢式RT-PCR是检测MLL基因重排产生的融合基因类型的简便可行的方法;MLL基因重排的检测对急性白血病预后判断和治疗方案的选择具有重要意义.
-
Ph+/bcr-abl+急性淋巴细胞白血病微小残留病变的细胞遗传学分析、巢式RT-PCR及流式细胞术检测
为了探索检测Ph+/bcr-abl+急性淋巴细胞白血病(ALL)患者的微小残留病变(MRD)的简便而灵敏的方法,对84例初治ALL患者和其中的缓解期患者的骨髓分别用细胞遗传学、流式细胞术和巢式RT-PCR检测.结果表明,缓解期患者骨髓中不存在Ph′染色体,巢式RT-PCR方法检测到11/14例缓解期患者存在MRD(bcr-abl融合基因)(阳性率78.57%),而流式细胞术检测到5/14的缓解期患者阳性(阳性率35.71%).巢式PCR的灵敏度达到10-6-10-7水平,流式细胞检测的灵敏度达到10-4-10-5水平.结论:Ph染色体核型分析技术检测MRD不够灵敏,而巢式RT-PCR检测MRD较流式细胞技术检测灵敏度更高,且更易于开展应用.
-
以肿瘤-睾丸抗原mRNA为特异性标记评价肝癌患者肝移植的预后
目的探讨肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者原位肝移植(orthotopic liver transplantation,OLT)手术前后外周血中MAGE-1、SSX1及CTp11基因mRNA表达与预后的关系.方法用巢式RT-PCR方法检测OLT手术前后外周血单个核细胞(PBMC)中上述3种基因的表达,并对26例患者进行随访.结果 HCC患者术前PBMC中MAGE-1、SSX1和CTp11基因mRNA的表达率分别为40.0%(14/35)、37.1%(13 /35)和31.4%(11/35),60.0%(21/35)患者的PBMC中至少可以检测到其中一种基因表达.16例术前PBMC中检测到上述基因表达者,术后肿瘤复发/转移率(75.0%)显著高于10例不表达这3种基因者(30.0%)(P＝0.043);在术前及术后这3种基因mRNA持续呈阳性或者由阴性转为阳性的20例患者中,15例(75.0%)术后发生肿瘤复发/转移,而3种基因mRNA持续阴性或者由阳性转为阴性的6例患者无1例复发/转移(P＝0.002).结论 MAGE-1、SSX1及CTp11基因mRNA可以联合作为肿瘤特异性标志物用于检测HCC患者血循环中的肿瘤细胞,并有助于选择OLT受体及判断预后.
-
以MAGE基因mRNA为特异标记检测肝癌患者外周血肿瘤细胞
目的以黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)和MAGE-3基因mRNA为特异性标记物,检测肝细胞癌(HCC)患者外周血中的肿瘤细胞,并探讨其临床意义. 方法采集25例HCC患者及20例健康志愿者的外周血,用巢式RT-PCR方法检测外周血单核细胞(PBMC)中MAGE-1和MAGE-3基因 mRNA.同时用RT-PCR方法检测HCC患者肝癌组织中上述MAGE基因的表达. 结果 44%(11/25)和36%(9/25)HCC患者的PBMC中可分别检测到MAGE-1和MAGE-3基因mRNA,而相应肝癌组织中MAGE-1和MAGE-3的表达率分别为68%(17/25)和56%(14/25);在64%(16/25)的HCC患者PBMC中至少可检测到一种MAGE基因mRNA;肝癌组织中不表达MAGE基因的病例以及20例健康志愿者的PBMC中均未测出MAGE基因mRNA.HCC患者PBMC中两种MAGE基因mRNA的检出率与肿瘤TNM分期、直径密切相关,而与肿瘤分化程度、血清AFP水平无相关性.但9例血清AFP正常或轻度升高者(<50 ng/ml),6例的PBMC中MAGE-1和/或 MAGE-3 mRNA为阳性. 结论 MAGE-1和MAGE-3基因mRNA可作为特异性肿瘤标记物用于检测HCC患者PBMC中的肝癌细胞,巢式RT-PCR的敏感性及特异性较高,其检测结果可能有助于判断HCC患者的预后.
-
SARS患者SARS冠状病毒RNA的动态检出特点及其意义
目的观察SARS患者各种临床标本的带毒状况,分析SARS冠状病毒(SARS-CoV)在患者体内的动态变化及其临床意义.方法设计针对SARS-CoV P区和N区的2套引物,应用巢式RT-PCR对 84例SARS患者的血、尿、痰、粪便、咽拭子等494份不同发病时间收集的标本进行病毒定性检测,并将PCR产物直接进行DNA序列分析.结果两套引物均能较好地扩增出部分标本SARS-CoV基因的特异性片段.在所有标本中痰液阳性检出率高,联合检测多种标本或同时应用两套引物进行PCR扩增可明显提高标本阳性检出率.跟踪观察发现,ARS患者发病第2周时PCR阳性检出率高,第3～4周次之,但各种标本阳性检出率的动态变化不尽相同.结论应用巢式RT-PCR进行SARS早期诊断和检测是一种可行的方法,针对SARS-CoV基因组不同区域设计多对引物,联合检测多种临床标本可明显提高阳性检出率;研究SARS-CoV的检出变化特点将为SARS的临床治疗提供一定的依据.
关键词： 严重急性呼吸综合征(SARS) 巢式RT-PCR 冠状病毒属 -
巢式PCR检测慢性支气管炎患者外周血BPImRNA的表达水平
目的 慢性支气管炎患者在使用阿奇霉素氯化钠注射液前后,分析外周血中杀菌/通透性增加蛋白(Bactericidal/permeability Increasing protein,BPI)mRNA的表达水平,探讨BPI在炎症过程中的作用机制.方法 应用巢式RT-PCR技术,检测22例慢性支气管炎患者和18例健康志愿者外周血中BPImRNA的表达水平,以β-actin为内标计算其相对表达量,并运用SPSS10.0统计软件对半定量结果进行t检验.结果 18例健康受试者外周血中BPImRNA的平均相对表达水平为(0.74±0.40);22例慢支患者在使用阿奇霉素氯化钠注射液治疗前后,外周血中BPImRNA的平均相对表达水平分别为(0.46±0.23)和(0.24±0.19);经t检验,健康对照组与慢支患者,以及慢支患者用药前后,其外周血中BPImRNA的相对表达水平均有显著性差异(P＜0.05).结论 慢性支气管炎患者在使用阿奇霉素氯化钠注射液治疗后外周血BPImRNA的表达水平较低;BPI表达水平下降,体内自身清除细菌能力下降.
关键词： BPImRNA 巢式RT-PCR 慢性支气管炎 阿奇霉素氯化钠注射液 -
SARS病毒基因检测结果与患者病情关系的研究
1 材料和方法1.1 痰标本留取 20 例健康人,15 例发烧非 SARS 患者和 72 例不同病情 SARS 患者痰标本,用生理盐水稀释后,取 5 ml 放入无菌管中,保存于 -20 ℃.标本使用前置 95 ℃水浴中灭活 0.5 h,才可用于 RNA 提取.
关键词： 冠状病毒属 严重急性呼吸综合征(SARS) 巢式RT-PCR 病情 -
结直肠癌向肝微转移的观察
目的:探讨结直肠癌患者在手术时癌细胞向肝发生微转移的情况.方法:以癌胚抗原(CEA)表达及角化蛋白19(K19)表达癌细胞为标记物,应用巢式反转录聚合酶链反应(Nest edRt-pcr)对55例术中患者,并以术后患者及正常人各12例为对照进行了检测.结果:两项标记物皆阳性者在临床(Duke's)早期已经出现,随分期之进展而逐步增高.并随癌细胞恶性程度升高而上升.结论:用门静脉血检测结直肠癌患者在手术时癌细胞向肝发生微转移的情况比其它方法阳性率更高,更准确.
-
巢式逆转录-聚合酶链反应扩增人骨形成蛋白2全长cDNA及其真核表达载体的构建
目的:利用巢式逆转录-聚合酶链反应扩增的方法,从肌肉组织中扩增人骨形成蛋白2全长cDNA并构建真核表达载体系统.方法:实验于2003-10/2005-10在苏州大学基因工程教研室和北京大学第三医院骨科实验室完成.提取成人肌肉组织内的总RNA,设计内外两对引物以巢式逆转录-聚合酶链反应扩增方法分两次扩增出人骨形成蛋白2全长1 188 bp基因,经T-A克隆装入pUCM-T质粒载体内,测序验证后,将克隆质粒以HindⅢ和XbaⅠ双酶切后与pcDNA3.0载体相连接,构建真核表达载体系统.结果:利用巢式逆转录-聚合酶链反应扩增方法能从成人肌肉组织内扩增出1 188 bp的人骨形成蛋白2全长cDNA基因,其测序结果显示与Genebank报道序列完全相符.将扩增序列双酶切后与pcDNA3.0载体相连接,经电泳验证,能构建人骨形成蛋白2全长基因的真核表达系统.结论:巢式逆转录-聚合酶链反应扩增方法能从成人肌肉组织内扩增出人骨形成蛋白2全长cDNA基因,并克隆构建真核表达载体系统,为下一步基因组织工程人工骨实验奠定基础.
-
细胞角蛋白-20mRNA在子宫内膜癌淋巴结中的表达及意义
目的探讨巢式RT-PCR法检测子宫内膜癌区域淋巴结中细胞角蛋白-20信使RNA(CK20 mRNA)的表达,以了解肿瘤细胞的微转移.方法取2003年3月至2004年2月间在北京大学人民医院手术治疗的18例子宫内膜癌患者的100枚盆腔淋巴结,巢式RT-PCR法检测其CK20mRNA的表达,同时取5例子宫肌瘤患者的子宫组织及淋巴结20枚作为阴性对照.取子宫内膜癌细胞系Ishikawa及子宫内膜癌组织作为阳性对照.结果CK20 mRNA在Ishikawa细胞及全部18例子宫内膜癌组织中均呈阳性表达,阳性率100%(敏感性100%).而在对照的5例正常子宫组织及20枚正常淋巴结中均未表达(特异性100%).18例子宫内膜癌中有16例经手术病理分期为Ⅰ、Ⅱ期,临床病理检查淋巴结均为阴性;而用巢式RT-PCR方法检测,有5例CK20 mRNA呈阳性表达,证实有肿瘤细胞的微转移,阳性率为31%.结论CK20可以作为检测子宫内膜癌细胞微转移的标志物.Ⅰ、Ⅱ期子宫内膜癌中有约31%的病例存在有区域淋巴结的肿瘤细胞微转移,其术后复发可能与此有关.
-
丹参酮ⅡA作用NB4细胞时PML-RARαmRNA与细胞分化和凋亡的关系
目的研究丹参酮ⅡA(TanⅡA)诱导NB4细胞分化和凋亡时PML-RAR α mRNA与细胞分化、凋亡的关系.方法用NBT还原实验和细胞表面特异性标记CD11b、CD33的表达检测细胞分化,用流式细胞术进行细胞周期和细胞凋亡分析,用巢式RT-PCR法检测NB4细胞中PML-RAR αmRNA.结果TanⅡA能增强NBT还原能力、升高CD11b而降低CD33、降低细胞增殖指数、增加凋亡细胞,但不影响PML-RAR α mRNA表达.结论TanⅡA诱导细胞分化和凋亡,而不抑制PML-RAR α融合基因转录.
关键词： TanⅡA 细胞分化 凋亡 PML-RAR αmRNA 巢式RT-PCR -
精神分裂症患者BDV-p24基因的扩增及其产物的测序鉴定
目的扩增精神分裂症患者PBMCs标本中博尔纳病病毒(Borna Disease Virus,BDV)p24基因,并对基因扩增产物进行测序鉴定,分析其与标准株之间的差异.方法用巢式RT-PCR方检测黑龙江省精神分裂症患者及正常人PBMCs中BDV-p24基因片段,对2例BDv-p24基因阳性的巢式RT-PCR产物进行测序,并与标准株比较.结果9例精神分裂症患者中有2例BDv-p24基因阳性,7例正常人标本中未发现BDv-p24基因阳性.测序结果进一步证实扩增产物为BDv-p24基因,其序列与标准株高度同源.结论用巢式RT-PCR方法可以特异性扩增出BDv-p24基因,扩增产物序列与标准株高度同源,提示黑龙江省的精神分裂症的发生可能与BDv感染有关.
-
巢式RT-PCR对肺癌外周血中微转移灶的检测和半定量测定
目的对肺癌外周血中微转移灶的检测和半定量测定.方法以CK-19为标记,采用巢式RT-PCR和半定量方法对肺癌患者外周血中微转移灶的检测,比较治疗前后外周血中癌细胞数的相对变化.结果 60例肺癌中有29例CK-19阳性, 18例健康人中,仅1例检测出CK-19阳性, 7例肺良性疾病患者有2例为CK-19阳性.实验组CK-19阳性率48%(29/60)与对照组12%(3/25)相比有极显著差异(P<0.01).2例肺癌患者化疗前相对癌细胞数分别为25和16个,经1周期化疗后,相对癌细胞数分别为5和1个.结论以CK-19为标记,采用巢式RT-PCR方法检测肺癌患者外周血中的癌细胞有较高敏感性和特异性,半定量RT-PCR法,能早期反映外周血中癌细胞数的相对变化情况,有助于对临床疗效及早做出评价.
-
上皮钙黏着蛋白mRNA表达与肺癌的相关性研究
目的 探讨E-cadherin(上皮钙黏着蛋白,E-cad)mRNA与肺癌及其病理类型之间的相关性.方法 用巢式RT-PCR检测50例肺癌患者的癌、癌旁和远癌肺组织及5例肺良性对照标本中的E-cad mRNA的相对表达量.结果 癌组织1.33±0.53、癌旁组织1.65±0.60、远癌组织2.01±0.46、非肺癌对照肺组织2.09±0.09,经方差分析癌、癌旁和远癌组织差异有统计学意义(F=18.810,P<0.01),但远癌组织与非肺癌对照肺组织之间的差异无统计学意义(P>0.05).肺鳞癌、腺癌及腺鳞癌的癌组织、癌旁组织和远癌组织中E-cad mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05).结论 E-cad mRNA表达减少或缺失与肺癌的发生和发展有相关性,与肺癌的组织类型无关.
关键词： 肺癌 上皮钙黏着蛋白mRNA 巢式RT-PCR -
巢式RT-PCR检测肝癌患者外周血微量转移癌细胞
目的建立肝癌患者外周血微转移癌细胞的分子检测方法.方法从肝癌患者外周血中分离有核细胞,用TRzol提取RNA,特异引物扩增AFP mRNA,凝胶电泳观察结果.分析AFP mRNA扩增结果与患者临床指标的关系.结果肝癌患者外周血有核细胞RNA提取成功率为100%,33例肝癌患者AFP mRNA阳性率为69%(23/33),临床肝内门静脉癌栓、肝外转移患者AFP'mRNA扩增阳性率为100%,临床无转移患者AFPmRNA阳性率为56%(15/27),P＜0.05,AFP mRNA阳性患者的肿块大径平均为10.67,AFP＞400 μg/L者占40%(8/20),AFP'mRNA阴性患者肿块大径平均为7.13 cm,AFP＞400μg/L者占10%(1/10).结论巢式RT-PCR是检测肝癌患者外周血微转移癌细胞的稳定方法.
-
外周血CK-19评价乳腺癌术后化疗及监控血液微转移
目的 以外周血CK-19为指标评价术后化疗作用及其监控血液微转移意义.方法 以120例乳腺癌术后患者为研究对象,巢式RT-PCR检测外周血CK-19 mRNA,比较化疗前后表达差异及CK-19表达与乳腺癌远处转移关系.结果 化疗前血液微转移阳性率为23.33％,化疗后为3.33％,差异有统计学意义(P＜0.01)；CK-19阳性组肿瘤转移率为76.9％,阴性组肿瘤转移率为8.6％,两组差异有统计学意义(P＜0.01).结论 术后辅助化疗能降低乳腺癌血液微转移；外周血CK-19能监控乳腺癌血液微转移.
-
尼帕病毒巢式RT-PCR方法的建立和初步应用
目的 建立灵敏、特异的检测尼帕病毒的巢式RT-PCR方法.方法 根据GenBank公布的尼帕病毒N基因序列,设计2对特异性引物(外引物和内引物),建立巢式RT-PCR方法,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行临床样品的检测.结果 该方法扩增的片段序列与源序列同源性均为100％.特异性试验结果表明本试验设计的内外侧引物不能从新城疫病毒、牛瘟病毒和日本乙型脑炎病毒中扩增出条带.敏感性试验结果表明,该方法低能检测出的标准模板RNA浓度为39 fg/μL.100份临床样品检测结果全部为阴性.结论 初步建立了快速、灵敏、特异的检测尼帕病毒N基因的巢式RT PCR方法,可用于动物疫病监测和检验检疫等领域.
