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2010-2012年广州市柯萨奇病毒A4、A10型VP1基因特征分析
目的 检测广州市2010-2012年手足口病(HFMD)病例粪便样本中的肠道病毒,并对其中的柯萨奇病毒A4型(CoxA4)和柯萨奇病毒A10型(CoxA10) VP1基因核苷酸序列进行进化分析.方法 收集2010-2012年广州市HFMD疑似病例粪便样本5 484份,采用RT-PCR进行肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16型(CoxA16)、CoxA4、CoxA10和其他肠道病毒阳性检测,阳性样本共4 111份.对其中的CoxA4及CoxA10阳性样本分别进行巢式RT-PCR,扩增肠道病毒VP1基因片段,并对VP1基因片段进行测序,利用生物信息学分析序列,构建系统进化树,进行进化分析.结果 在4 111份肠道病毒阳性样本中,EV71、CoxA16、CoxA10、CoxA4的阳性率分别为35.1％(1443/4111)、30.7％(1261/4 111)、2.0％(82/4 111)、0.8％(31/4 111),不同肠道病毒阳性率差异有统计学意义(x2=148.34,P＜0.05).CoxA4样本以3岁组阳性率高,为1.3％ (7/534),CoxA10样本以0岁组阳性率高,为3.7％(34/914);CoxA4样本阳性率4月份达到高峰,为2.6％(12/460),CoxA10样本阳性率8月份达到高峰,为4.3％(12/278).VP1基因核苷酸遗传进化分析显示,CoxA4阳性样本VP1基因核苷酸序列可分为A、B2个亚型,Cox A10阳性样本VP1基因核苷酸序列可分为A、B、C3个亚型,广州市2010-2012年CoxA4和CoxA10阳性样本VP1基因核苷酸序列均属于A亚型.结论 广州市2010-2012年HFMD病例粪便样本中CoxA4和CoxA10阳性样本VP1基因核苷酸序列均属于A亚型.
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肠道病毒71型灭活疫苗热稳定性研究
目的 研究肠道病毒71型(EV71)灭活疫苗(人二倍体细胞)生产过程中的中间产品及成品的热稳定性.方法 将不同批次EV71灭活疫苗的病毒收获液、疫苗原液以及疫苗成品分别置于不同温度保存.第0、6、12、24个月时选取存放于-20℃、4℃的病毒收获液及-20℃的疫苗原液的样品,第0、1、3、6、12个月时选取存放于4℃的疫苗原液的样品,第0、6、12、24个月时选取存放于4℃的疫苗成品的样品,第0、7、14、28、42、60天时选取存放于25℃的疫苗成品的样品,第0、3、7、14、21天时选取存放于37℃的疫苗成品的样品,检测样品的病毒感染性滴度(lgCCID50/ml;CCID50,cell culture infective dose 50％,细胞培养半数感染量)、抗原含量、内毒素含量、pH值等;对1 800只BLAB/c小鼠进行疫苗成品的腹腔免疫注射,同时针对每个温度下不同保存时间设立对照组,每组10只小鼠(注射无病毒抗原的稀释液),共150只.接种4周时每只小鼠采集尾静脉血500μl,检测血清的中和抗体效价,计算疫苗成品的半数有效量(ED50).采用随机区组方差分析,对不同温度下,不同保存时间的各项指标进行比较.结果 EV71灭活疫苗的病毒收获液在-20℃条件下,保存0、6、12、24个月时病毒滴度分别为(6.67 ±0.13)、(6.56±0.09)、(6.52±0.04)、(6.39±0.16) lgCCID50/ml;4℃条件下,各时间点的病毒滴度分别为(6.67 ±0.13)、(6.41±0.13)、(6.19 ±0.18)、(5.97±0.09) lgCCID50/ml,均随保存时间的延长呈下降趋势(F值分别为9.81和44.16,P值均＜0.05).疫苗原液在4℃条件下,保存0、1、3个月时的抗原含量均为(3 626.67±1 382.56) EU/ml,保存6和12个月时分别为(2 080.00±876.36)、(951.17±346.35) EU/ml.疫苗成品在4℃条件下,保存0、6、12、24个月时的效力分别为(31.00±2.71)、(32.93±3.22)、(39.37±3.44)、(46.04±3.25) EU/ml;在25℃条件下,保存0、7、14、28、42、60 d的ED50分别为(31.00±2.71)、(32.23±2.66)、(34.70±1.77)、(40.04±2.10)、(47.78±1.93)、(56.97±0.50) EU/ml;在37℃条件下,保存0、3、7、14、21 d的效力分别为(31.00±0.00) 、(36.20±0.00)、(41.87±0.50)、(53.25±0.50)、(64.84 ±0.58)EU/ml,ED50均随时间延长呈上升趋势,与初始值差异均有统计学意义(F值分别为28.49、215.15和156.12,P值均＜0.05).结论 在-20℃保存24个月或4℃保存6个月以内的EV71灭活疫苗病毒收获液,在-20℃保存24个月或4℃保存3个月以内的疫苗原液以及在4℃条件下保存24个月或25℃保存28 d或37℃保存7d以内的疫苗成品,其各项质量指标均具有较好的稳定性.
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MRI与1H-MRS在重症EV71脑炎中的应用价值
目的 观察重症肠道病毒71型(EV71)脑炎患儿MRI和氢质子磁共振波谱(1H-MRS)的改变,探讨1H-MRS临床应用价值.方法 选取10例重症EV71脑炎患儿进行头颅MRI和脑干1H-MRS检查,观察代谢物N-乙酰天门冬氨酸(NAA)、肌酸(Cr)和胆碱复合物(Cho)及NAA/Cr、Cho/Cr及NAA/(Cho+Cr)代谢物比值变化,并和10例健康儿童进行比较.结果 病例组MRI异常6例,1例病灶累及中脑、脑桥顶盖、延髓、双侧枕叶,1例累及脑桥顶盖、延髓,1例累及颈髓6～7和胸髓1～12,1例累及双侧额、颞叶,1例累及双侧额顶颞叶,1例累及颈髓1～4,病灶增强扫描未见强化,T1WI呈低信号,T2WI和T2/FLAIR高信号.1H-MRS异常10例,与对照组相比,Cho/Cr比值(2.15±0.41)增高(P>0.05),NAA/Cr比值(1.48±0.34)、NAA/(Cho+cr)比值(0.51±0.13)显著降低(P<0.01).结论 EV71脑炎急性期1H-MRS改变主要以神经元损伤为主;1H-MRS结合MRI,可为重症EV71脑炎的早期诊断和治疗提供全面、客观的参考依据.
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HLA-A33表型、TNF-α/TNF-RⅡ基因多态性和肠道病毒71型脑炎的相关性研究
[目的]研究HLA-A33表型,TNF-α/TNFRⅡ单核苷酸多态性与肠道病毒71型(EV71)感染遗传易感性的关系,探讨不同基因表型对EV71感染患病风险的影响.[方法]收集2009年9月至2010年10月EV71检测为阳性的急性期中枢神经系统感染患儿123例,根据病情轻重分成轻症组、重症组；提取患儿外周血白细胞的基因组DNA,用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)技术检测EV71感染患儿及正常对照儿童HLA-A33表型、TNF-α-308位点的多态性和限制性片段长度多态性-聚合酶链反应(PCR-RFLP)检测TNFRⅡ+196位点的多态性.[结果]EV71感染患儿中HLA-A33表型阳性率(24.39％)与健康儿童组阳性率(11.82％)的差异有统计学意义(x2=6.099,P＜0.05).EV71中枢感染患儿TNF-α-308位点A等位基因频率明显高于正常对照组(x2=6.367,P＜0.05),感染组TNF-α-308GG基因型分布频率显著低于正常对照儿童(x2=5.393,P＜0.05)；而轻症组与重症组相比,其差异无统计学意义(P＞0.05).TNFRⅡ+196位点T等位基因频率在EV71感染组与对照组、轻症组与重症组之间的差异均无统计学意义(P＞0.05).HLA-A33(+)患儿中,EV71感染组TNFRⅡ+196TG基因型频率明显高于正常对照组(x2=3.866,P＜005),而在HLA-A33(-)儿童中,其差异无统计学意义.[结论]HLA-A33表型、TNF-α-308位点基因多态性与EV71中枢感染有关,TNF-α-308GG基因型可能为儿童不易感染EV71的保护基因.TNFRⅡ+196位点基因多态性与EV71感染无关；TNFRⅡ+196TG基因型在一定程度上升高了HLA-A33(+)患儿EV71中枢感染的发病概率.
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多重Taqman探针实时RT-PCR检测手足口病病原体方法的建立及临床应用
目的 建立多重Taqman探针实时RT-PCR法同步检测肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16型(CA16)和包括EV71、CA16的肠道病毒通用型(EV).方法 回顾性研究.根据EV71、CA16和EV的保守序列,设计并合成相应的引物和探针,对该体系进行灵敏度、特异性和重复性验证.收集2012年4至7月南京医科大学附属南京儿童医院收治的176例疑似手足口病患儿咽拭子标本作为实验组,另收集10名在此期间到我院体检的健康儿童、10例门诊流感样患儿和90例我院呼吸科收治的呼吸系统疾病患儿咽拭子标本作为对照组.应用该方法对以上286份标本进行EV71/CA16/EV的同步检测.应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析.结果 该方法EV71、CA16和EV3个通道的检测限均为1.0×103拷贝/ml；对9株肠道病毒和3株非肠道病毒毒株核酸的检测结果均正确,特异度100％；对1.0×103拷贝/ml、1.0× 104拷贝/ml、1.0×105拷贝/ml的重组质粒进行重复性实验,其变异系数分别为0.44％ ～ 1.04％,0.38％～0.73％,0.46％ ～0.90％；运用多重Taqman探针实时RT-PCR法与实时RT-PCR法对176例疑似手足口病患儿临床标本进行检测和结果比对,两种方法的一致性为97.2％ (171/176),Kappa=0.94.结论 建立了同步检测EV71/CA16/EV的多重Taqman探针实时RT-PCR法,该方法灵敏度高,特异性好,可为临床快速诊断EV71、CA16和EV感染提供依据,有较强的临床及科研应用前景.
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2013年新疆维吾尔自治区手足口病病原学检测结果分析
目的 分析2013年新疆维吾尔自治区手足口病的病原构成及病原学特征,为手足口病防控策略的制定提供依据.方法 采集2013年1至12月在全疆各级医疗机构就诊的手足口病临床病例标本1 287份(粪便1 083份,咽拭子204份),采用实时荧光逆转录聚合酶链反应RT-PCR检测肠道病毒(EV)、肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇病毒A16 (CA16),对109份其他肠道病毒阳性标本进行柯萨奇病毒A6 (CA6)和柯萨奇病毒A10 (CA10)检测;采用RT-PCR法对6份EV71阳性标本进行衣壳蛋白VP1(VP1)区全长基因扩增和序列检测,运用生物软件ChromasPro1.7.6,Bioedit7.1.9及MEGA6.06进行核酸序列同源性分析并构建系统进化树.用SPSS17.0软件对不同年龄组患者EV阳性检出率进行比较分析.结果 1 287份标本中检出肠道病毒(EV)阳性997份,肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16型(CA16)及非EV71非CA16的其他肠道病毒(其他EV)分别占45.5％(454/997)、13.0％(130/997)和41.4/％ (413/997);不同年龄组患者肠道病毒阳性检出率[7/12 ～85.1％(137/161)]不同,差异有统计学意义(x2=32.29,P=0.000 4),3～5岁组阳性检出率高(82.5％～85.1％).109份其他EV阳标本中检出CA6阳性97份,占89.0％,CA10阳性3份,占2.7％;对6株EV71毒株的VP1区全长基因序列的同源性分析结果显示,6株EV71毒株与2008年安徽阜阳及2007年山东临沂毒株的核酸序列有着较高的同源性(95.3％ ～98.3％),均为C4基因亚型的C4a分支.结论 2013年新疆手足口病的病原中其他EV构成比明显上升,与EV71共同成为当年的优势病原.加强手足口病病原学监测,掌握手足口病的病原特点及重要病原的基因变异变迁规律对手足口病防控工作至关重要.
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肠道病毒核酸与抗体联合检测在手足口病病原早期诊断中的应用
目的：探讨肠道病毒核酸与特异性抗体联合检测在手足口病实验室早期诊断中的应用价值，为手足口病患儿实验室诊断提供新参考。方法病例对照研究。收集杭州市儿童医院2014年1至6月1066例临床诊断手足口病的住院患儿，其中普通病例401例，重症病例665例。对上述住院患儿同时采集咽拭子和血清样本进行肠道病毒核酸EV71／CA16／EV通用型实时荧光定量RT-PCR与EV71／CA16-IgM抗体联合检测。采用SPSS16.0软件进行组间χ2检验或McNemarχ2检验统计分析。结果1066例手足口病临床诊断病例中肠道病毒核酸EV71／CA16／EV通用型实时荧光定量RT-PCR检测总阳性率为75.52％（805／1066）（95％CI：72.80％～78.05％）；肠道病毒核酸联合EV71／CA16-IgM抗体检测总阳性率为91.46％（975／1066）（95％CI：89.58％～93.04％），总阳性率比较差异有统计学意义（χ2＝98.338，P＝0.000）。单纯肠道病毒核酸检测EV71型检出率为49.25％（525／1066）（95％CI：46.21％～52.29％），联合检测 EV71型检出率为64.63％（689／1066）（95％CI：61.67％～67.49％），EV71阳性检出率比较差异有统计学意义（χ2＝51.453， P＝0.000）。665例临床诊断为重症手足口病病例中，肠道病毒核酸抗体联合检测总阳性率为96.69％（643／665）（95％CI：94.95％～97.87％），与单纯肠道病毒核酸检测总阳性率79.25％（527／665）（95％CI：75.92％～82.22％）比较差异有统计学意义（χ2＝95.607， P＝0.000）；重症病例中，联合检测EV71阳性率为87.52％（582／665）（95％CI：84.71％～89.89％），单纯核酸检测为68.57％（456／665）（95％CI：64.87％～72.06％），EV71阳性率提高了18.95％（126／665），两者比较差异有统计学意义（χ2＝69.665， P＝0.000）。结论肠道病毒核酸与特异性抗体联合检测可以显著提高手足口病实验室诊断检出率，尤其对于重症手足口病患儿，联合检测总阳性率与EV71阳性率显著提高，具有较高的临床诊断应用价值，有望成为手足口病实验室诊断的新方案。（中华检验医学杂志，2015，38：397-401）
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肠道病毒71型手足口病ELISA诊断试剂盒研制与临床应用
目的 研制早期快速检测抗肠道病毒71型(EV71)抗体的ELISA血清学诊断性试剂盒,评价其临床应用价值.方法 将表达纯化的EV71重组蛋白VP1作为包被抗原,建立EV71型手足口病间接ELISA的血清学检测方法 .通过与逆转录(RT)PCR方法 、EV71病毒分离试验和微量血清中和试验比较,评价抗.EV71 IgM和抗-EV71 IgG血清学诊断方法 在EV71型手足口病的诊断价值.结果 与RT-PCR比较,抗-EV71 IgM敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为83%、85%、81%和87%;抗.EV71 IgG敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为72%、74%、68%和77%.与EV71病毒分离方法 比较,抗-EV71 IgM敏感度、特异度分别为85%和97%;抗-EV71 IgG敏感度、特异度分别为75%和77%.通过直线相关分析发现,抗-EV71 IgG抗体滴度和中和抗体滴度呈显著正相关(r=0.72,P＜0.05).EV71型手足口病患儿恢复期血清抗IgG滴度较急性期升高(P＜0.01),但抗IgM滴度差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利用VP1重组蛋白作为包被抗原,成功开发ELISA检测人血清抗-EV71 IgM和抗-EV71 IgG抗体的诊断试剂盒.
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手足口病患者体内肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型与常见呼吸道病毒的检测及临床分析
目的 调查手足口病患者中EV71和CA16的感染现状,分析呼吸道病毒合并感染对患者的影响.方法 收集2010年6-10月在北京佑安医院就诊的手足口病患者348例,包括门诊轻症患者100例,住院患者248例.采集患者咽拭子标本提取病毒RNA,用随机引物将标本中的RNA逆转录成cDNA,荧光PCR法检测EV71和CA16.以呼吸道病毒多重PCR引物扩增12种呼吸道病毒的基因片段,通过电泳分析判断结果.比较EV71(+)或CA16(+)组与EV71(-)CA16(-)组合并呼吸道病毒感染阳性率和重症患者比例,住院与门诊手足口病患者中合并感染呼吸道病毒的阳性率.结果 348例手足口病患者,共检测出呼吸道病毒感染36例.在248例住院手足口病患者中,111例EV71(+)或CA16(+)组患者呼吸道病毒感染率7.2%,相比137例EV71(-)CA16(-)组患者呼吸道病毒感染率7.4%,差异无统计学意义(x2=0.059,P＞0.05).在100例门诊轻症手足口病患者中,有17例(17%)合并呼吸道病毒感染,高于111例EV71(+)或CA16(+)组患者呼吸道病毒感染率,差异有统计学意义(x2=4.830,P＜0.05).在111例EV71(+)或CA16(+)组中,重症患者为101例(91.0%);在137例EV71(-)CA16(-)组中,重症患者为132例(96.4%),两组重症患者率差异无统计学意义(x2=3.099,P＞0.05).在348份标本中检出占前3位的呼吸道病毒分别是人鼻病毒A/B(HRV A/B)、人副流感病毒3(PIV3)、甲型流感病毒(FLU A).结论 手足口病患者中存在呼吸道病毒合并感染,但合并感染对手足口病病情未见明显影响.
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临沂市手足口病肠道病毒核酸检测及流行病学特征分析
目的 调查临沂市手足口病患者并对其实验室检查结果进行统计,为手足口病的防治提供参考依据.方法 选取临沂市报告的3621例手足口病患者,根据患者的年龄、性别、职业等分布进行分析,并对采集的样本进行肠道病毒核酸的RT-PCR检测.结果 临沂市2010-2012年手足口病报告病例分别为490、1543、1588例,其中重症病例为3、8、14例,分别占0.61％、0.52％、0.88％；以3-6月份发病多、集中,2010年3-6月、2011年3-6月、2012年3-6月发病例数分别为393、1241、1356例,分别占全年发病数的80.2％、80.4％、85.4％；发病多的在费县、临沭和河东,为985、607、564例,分别占27.20％、16.76％、15.58％;1～4岁发病人数为2568例,占70.9％；散居儿童发病人数2125例,占58.7％；病原学监测结果显示,2010年1月—2011年2月病原型别为EV71 A基因型；2011年3月—2012年12月病原型别以EV71 C4亚型和CA16为主.结论 2010年1月—2011年2月由EV71引起手足口流行,而2011年3月—2012年12月主要由EV71和CA16等肠道病毒引起手足口病流行,1～4岁儿童为易感人群.
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45793例儿童手足口病临床特点分析
目的 探讨广西壮族自治区妇幼保健院收治手足口病(HFMD)患儿的临床特点.方法 选择2013年1月1日至2016年12月31日,于广西壮族自治区妇幼保健院就诊的45 793例HFMD患儿为研究对象.在知情同意情况下,采集其中363例普通型HFMD患儿的咽拭子或(和)疱疹液,以及732例重症HFMD患儿的咽拭子标本,进行肠道病毒(EV)71、柯萨奇病毒(Cox)A16和其他EV检测.回顾性分析患儿病例资料,统计学分析本院2013-2016年HFMD如下特点.①每年HFMD重症率及病死率;②HFMD月份、年龄、性别、人群、地区分布特点,以及与这些因素相关的HFMD重症率情况;③HFMD病原学特点.本研究遵循的程序符合广西壮族自治区妇幼保健院伦理委员会制定的伦理学标准,得到该伦理委员会批准.结果 ①45 793例HFMD患儿中,普通型HFMD占98.40％(45 061/45 793),重症HFMD占1.60％(732/45 793),重症HFMD患儿的病死率为1.64％(12/732).其中,2013年的HFMD重症率1.13％为低,分别与2014年的1.85％、2015年的1.69％及2016年的1.65％比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);2014年HFMD病死率为0.06％,分别较2013年的0.01％和2015年的0高,并且差异均有统计学意义(P＜0.05).②2013年及2015年HFMD发病月份分布构成比中,均为9月所占比重大,分别为30.90％及26.43％,而2014年及2016年则为5月所占比重大,分别为28.59％及31.47％;2013年4月HFMD重症率为2.15％,2014年2月为5.34％,2015年3月为6.48％,2016年10月为5.50％,分别为当年每月HFMD重症率的高值.③本研究HFMD患儿年龄分布以＞1～3岁所占比重大(57.47％),≤5岁患儿所占比重达94.96％;≤1岁患儿及＞1～3岁患儿的HFMD重症率,均分别较＞3～5岁及＞5岁高,并且差异均有统计学意义(P＜0.05).④本研究HFMD患儿中,男性患儿占61.47％(28 149/45 793),男性患儿HFMD重症率为1.80％(508/28 149),较女性患儿1.27％(224/17 644)高,并且差异有统计学意义(x2=19.745,P＜0.001);散居儿童、幼托儿童及学生的HFMD所占比重分别为73.11％、25.56％及1.33％,其HFMD重症率分别为1.92％、0.67％及1.97％;南宁市城区、南宁市其他县份及南宁市以外地区HFMD分布构成比分别为91.48％、8.31％及0.21％,其HFMD重症率分别为1.09％、7.25％及1.03％.⑤本研究普通型HFMD的EV阳性率为87.05％(316/363),较重症HFMD为78.28％(573/732)高,并且差异有统计学意义(x2=12.272,P＜0.001);本院2013、2014、2015及2016年,普通型HFMD分别以CoxA16、EV71、其他EV及CoxA16感染为主,而重症HFMD分别以其他EV、EV71、其他EV及其他EV感染为主;12例死亡病例中,EV71阳性率为83.34％(10/12).结论 本院2013-2016年,HFMD以4～6月或8～10月高发,男性患儿多于女性,主要发生在南宁市城区≤5岁散居儿童.普通型HFMD以CoxA16感染为主,重症HFMD以其他EV感染为主.
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普通型手足口病患儿肠道病毒病原学检测及其临床特点
目的 探讨普通型手足口病(HFMD)患儿一般临床特点及其肠道病毒(EV)血清型分布特点,揭示普通型HFMD的流行特征.方法 选择2014年3～9月于成都市妇女儿童中心医院门诊就诊,临床诊断为普通型HFMD的193例患儿为研究对象.其中,103例取得家长同意后咽拭子取样,采用实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)法进行EV检测,并鉴别其血清型.分析普通型HFMD患儿临床特点,并统计学比较柯萨奇病毒(Cox)A16、EV71及其他EV感染的临床特点差异.本研究遵循的程序符合成都市妇女儿童中心医院人体试验委员会制定的伦理学标准,得到该委员会批准,征得受试对象监护人知情同意,并与之签署临床研究知情同意书.结果 ①本组193例普通型HFMD患儿中,年龄1～3岁为118例(61.1％),1～5岁为167例(86.5％);散居儿童为119例(61.7％);所有受试者均有咽峡部和(或)口腔疱疹,以及手部、足部和(或)臀部皮疹的临床表现,并预后良好.②本组103例HFMD患儿咽拭子样本EV阳性检出率为86.4％(89/103);89例EV阳性普通型HFMD患儿中,CoxA16阳性为57例(64.0％),EV71阳性为16例(18.0％),其他EV阳性为16例(18.0％).③本组89例EV阳性普通型HFMD患儿不同血清型病例的年龄、性别构成比、生活范围构成比及变态反应史阳性率等一般临床资料比较,发热率、发热高峰温度、发热持续时间及并发症发生率等临床表现比较,以及白细胞计数及C反应蛋白(CRP)含量实验室等检查结果比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 CoxA16是2014年成都市妇女儿童中心医院普通型HFMD的主要病原体.尚不能根据患儿的主要临床表现及特点,以及外周血白细胞计数和CRP含量检测结果推测可能的EV血清型.
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ARRDC4通过NF-κB和MAPK信号通路促进EV71诱导的IL-6产生
目的 研究含阻遏蛋白结构域蛋白4(arrestin domain-containing protein 4,ARRDC4)对肠道病毒71(EV71)诱导IL-6产生的调节作用和相关机制.方法 利用特异性靶向ARRDC4的小干扰RNA(siRNA)在THP-1诱导分化的巨噬细胞(t-M?)中干扰ARRDC4的表达,无关siRNA序列干扰作为阴性对照组,采用实时定量PCR、ELISA和Western印迹等技术观察ARRDC4对IL-6产生、EV71复制以及相关天然免疫信号通路接头分子活化的影响.结果 EV71感染时,ARRDC4表达显著上调.以siRNA靶向干扰ARRDC4的表达,能抑制EV71感染诱导的IL-6 mRNA的表达和IL-6的分泌产生,促进EV71的复制.靶向干扰ARRDC4能明显抑制EV71诱导的p-65、IκBα、ERK、JNK和p38的活化.结论 ARRDC4通过增强NF-κB和MAPK信号通路的活化,促进EV71诱导的IL-6产生,从而抑制EV71的复制,正向调控EV71触发的天然免疫反应.
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肠道病毒71型(EV71)ICR乳鼠动物模型的建立
目的 建立ICR乳鼠动物模型,为抗EV71药物的筛选和活性评价提供一定的信息支撑.方法 采用EV71国际标准株BrCr株,分别对1日龄、7日龄及21日龄ICR乳鼠经腹腔注射感染,并定期采集感染小鼠器官组织进行病原学诊断,确定EV71的感染情况.结果 经腹腔途径感染1日龄和7日龄ICR小鼠出现精神萎靡、肢体麻痹瘫痪、消瘦、死亡等症状.腹腔注射分别在1日龄乳鼠肺、脑、肠及7日龄乳鼠肺、脑、肠、大腿肌肉检测到病毒RNA.而21日龄乳鼠出现轻微症状后自行恢复.本研究同时建立了一种分子生物学方法,为今后研究其他适合EV71的动物模型奠定了基础.结论 成功建立EV71感染动物模型.发现不同日龄ICR乳鼠对EV71国际标准株感染的易感能力和感染后发病程度不同,低龄(1日龄和7日龄)乳鼠易感,而高龄(21日龄)乳鼠不易感染.ICR乳鼠可用于EV71病毒感染机制、病毒体内分布等基础研究,并可作为抗EV71病毒药物筛选和活性评价动物模型应用,但模型的稳定程度尚需继续研究.
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重症肠道病毒71型感染并发肺出血28例抢救成功原因分析
手足口病是由肠道病毒引起的急性传染病，以儿童发病为主，临床以发热和手、足、口腔及臀部出现皮疹为主要特征。重症病例多由肠道病毒71型（EV71）感染引起，病情凶险，病死率高。目前，国内对于手足口病并发肺出血的抢救成功病例报道不多[1]，而且对影响肺出血患儿临床预后的因素也尚未进行总结分析。本研究回顾性分析我院（三级甲等医院，天津市手足口病定点收治医院）28例重症EV71并发肺出血患儿的抢救成功原因，以期为诊断和治疗提供参考依据，并分析影响危重症手足口病临床预后的因素。
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肠道病毒71型危重症手足口病多脏器损害的机制
近年来,肠道病毒71型(EV71)感染的危重症手足口病是儿科高度重视的危重疾病,重症病例可导致患儿多脏器功能损害及衰竭,病死率高.现就该疾病各个脏器的损伤机制做一阐述.
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四川地区供浆员中肠道病毒71型中和抗体效价的分布
目的 通过检测EV71中和抗体效价(EV71-NT),对四川地区供浆员中EV71-NT的分布进行分析.方法 应用基于细胞病变抑制的EV71-NT检测方法,检测四川地区349份健康人血浆的EV71-NT,同时用肠道病毒(EV)71型抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)检测其EV71抗体,并分析二者的相关性；检测四川地区21 817份健康人血浆中EV71-NT的分布.结果 该EV71-NT检测方法具有较好的重复性,测定高效价和低效价EV71中和抗体标准品的变异系数分别为30.9％和33.6％；该方法与ELISA法的相关性较差(r=0.024)；四川地区21 817份健康人血浆中含高效价EV71中和抗体的比例在7.1％～18.4％之间,EV71高效价血浆占10.3％.结论 在四川地区供浆员血浆中含有一定比例的高效价EV71中和抗体,可以直接从自然感染人群中筛选EV71抗体血浆进行EV71特异性免疫球蛋白的研制.
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肠道病毒71型中和抗体的保护水平
目的 通过检测乳鼠模型、健康婴幼儿和疫苗免疫后目标人群的肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)中和抗体效价,为确定EV71疫苗保护水平提供基础数据.方法 6份不同EV71病毒株免疫血清经中和抗体准确定量后,分别通过两个EV71乳鼠攻毒模型,检测EV71中和抗体保护水平.采用标准化的中和抗体检测法和EV71中和抗体定值标准品,分别对健康婴幼儿及疫苗免疫后血清进行中和抗体准确定量.结果 在2个乳鼠攻毒模型中,6份免疫血清的中和抗体保护水平接近,ED50分别为10 ～ 50 U和6.1～54.2U；婴幼儿人群7、12和24月龄抗体阳性率分别为45.0％、48.8％和56.8％,阳性人群的抗体效价分别为113.8、120.3和330.6 U/ml(均值为173.2U/ml),母亲抗体阳性率和效价分别为86.7％和114.3 U/ml；中、高剂量疫苗2针免疫后,婴幼儿抗体阳性率均为100％,效价为356.0和1 136.2 U/ml,较婴幼儿人群自然感染水平高2.1～6.6倍.结论 应用标准化的中和抗体检测法和EV71中和抗体定值标准品,确定了以U/ml为单位的乳鼠攻毒抗体保护水平及婴幼儿人群抗体水平和疫苗免疫后抗体水平,为EV71疫苗免疫人群中和抗体保护水平的确定提供了依据.
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肠道病毒71型类病毒颗粒在昆虫细胞Sf9中的表达
目的 构建含有肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)P1和3CD基因的嵌合型重组杆状病毒质粒,探讨3CD蛋白酶对P1蛋白的切割作用及形成类病毒颗粒(Virus-like particles,VLPs)的可能性.方法 将EV71的P1和3CD基因克隆至同一pFastBac Dual质粒上,转化感受态大肠杆菌DH10,构建重组杆状病毒质粒Bac-P1-3CD,转染昆虫细胞Sf9,制备重组杆状病毒,经SDS-PAGE、Western blot及电镜对目的 基因表达产物进行分析.结果 重组杆状病毒质粒Bac-P1-3CD经PCR鉴定证明构建正确.重组杆状病毒感染的Sf9细胞经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约39 000、32 000和26 000的特异条带,大小与EV71的VP1、VP0、VP3蛋白相符;Western blot分析可见与EV71 VP1蛋白大小相近的特异条带;电镜观察可见EV71类病毒颗粒.结论 EV71的P1和3CD嵌合基因可以通过重组杆状病毒在昆虫细胞中表达,3CD蛋白酶可以切割P1蛋白得到VP1抗原,并能形成类病毒颗粒.
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肠道病毒71型3C基因原核表达质粒的构建表达及纯化
目的 构建肠道病毒71型(Entervirus71,EV71)3C基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中进行表达并纯化.方法 以病毒的反转录产物为模板,PCR扩增EV71 3C基因,克隆至pGEx-4T-1载体中,构建重组表达质粒pGEx-3C,转化大肠杆菌BL21 (DE3)中,IPTG诱导表达.表达的重组融合蛋白GSR-3C经GST-Agarose亲和层析和分子筛层析纯化后,Western blot检测其反应原性.结果 重组表达质粒pGEx-3C经双酶切及测序证实构建正确；表达的重组融合蛋白相对分子质量约46000,表达量约占菌体总蛋白的50％,主要以可溶性形式表达；纯化后的重组融合蛋白纯度大于90％,可与小鼠抗EV71单克隆抗体特异性结合.结论 成功构建了重组表达质粒pGEx-3C,在大肠杆菌中高效分泌表达并纯化了重组GST-3C融合蛋白,为EV713C蛋白酶结构与功能的研究及3C靶向药物和疫苗的研究奠定了基础.
