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引起吉林省2011年手足口病流行的肠道病毒71型VP1区基因的特征
目的 分析引起吉林省2011年手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)流行的肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71 )VP1区基因的特征.方法 对2011年分离自吉林省8个市(州)HFMD病例的35株EV71分离株的VP1编码区基因进行RT-PCR扩增及序列测定,应用Bioedit和MEGA 4.0软件对VP1基因进行同源性和基因亲缘关系分析.结果 吉林省201 1年的35株EV71分离株均属于C4a基因亚型;其VP1区基因的核苷酸序列同源性在95.9％～100％之间,分属于3个进化枝,形成3个传播链,与2008年安徽阜阳株亲缘关系近,VP1区基因核苷酸序列同源性达97.6％～99.3％,与2007年的北京株和2003年的浙江株亲缘关系相对较远;2011年吉林省各市中,既存在3个EV71传播链共流行的市,同时监测到2个EV71传播链共流行的市,还发现3个只有单一EV71传播链的市,每个传播链均在5个市流行传播.结论 2011年在吉林省内,3个C4a基因亚型EV71的传播链同时循环传播引起HFMD的流行,未发现优势传播链.
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肠道病毒71型相关动物模型实验的研究进展
人肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是导致人类手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)的主要致病原.HFMD已成为严重影响儿童健康的公共卫生问题之一,因此,尽快了解EV71的致病机理及研制安全有效的疫苗是当前急需解决的问题,而建立相关动物模型是研究EV71致病机理以及评价EV71疫苗安全性和有效性的重要一步.本文就目前EV71常用动物模型的研究进展作一综述.
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EV71全病毒灭活疫苗的研究进展
近年来手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)在我国持续流行,已经成为危害儿童健康的严重疾病.肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)感染是引起HFMD病例和婴儿重症死亡的主要病因.为控制EV71感染的流行,国内外均在开展不同种类EV71疫苗的研发,其中以灭活疫苗的进展快,目前国内3家EV71全病毒灭活疫苗即将进入Ⅲ期临床试验阶段.本文就全病毒灭活疫苗的研发进展及质量控制和评价要点作一综述.
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肠道病毒71型2A、3C、3D蛋白的研究进展
肠道病毒71型(Enterovirus type 71,EV71)感染是引起神经系统紊乱、肺水肿、肺出血等严重疾病的主要原因.非结构蛋白2A、3C、3D是EV71在宿主细胞内完成复制和存活的基础,具有不同于肠道病毒其他成员的结构和作用机制.2A和3C蛋白可抑制宿主细胞蛋白的表达,从而促进细胞凋亡,3C蛋白还可抑制天然免疫,3D蛋白与病毒的耐高温和高度变异适应性有关.一些小分子物质可在病毒入侵的不同阶段抑制EV71感染.本文就2A、3C、3D蛋白在EV71复制过程中的结构与功能特点以及一些小分子物质在病毒复制中的抑制作用作一综述.
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微量细胞病变法检测原料血浆中肠道病毒71型中和抗体水平
目的 应用微量细胞病变法检测原料血浆中肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)中和抗体水平,以确定可供EV71免疫球蛋白生产用的原料血浆筛选标准.方法 建立检测EV71中和抗体效价的微量细胞病变法,检测3批质控血浆,验证该方法的重复性;并对1 238份原料血浆进行检测.结果 微量细胞病变法检测高(1:400)、低(1:50)效价质控血浆EV71中和抗体效价的变异系数分别为22.7%和27.3%;约40%的原料血浆中和抗体效价＜1:8,约60%的中和抗体效价≥1:8.结论 微量细胞病变法可用于原料血浆中EV71中和抗体的检测,约23%的献浆员的EV71中和抗体效价达1:32以上,可用于EV71免疫球蛋白的生产.
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肠道病毒71型灭活疫苗诱导小鼠细胞免疫抗原表位的筛选
目的 筛选肠道病毒71型(Enterovirus 71.EV71)灭活疫苗免疫小鼠后诱导的细胞免疫抗原表位,探讨EV71疫苗诱导的细胞免疫应答机制.方法 以EV71 BJ08株(C4基因型)病毒结构蛋白氨基酸序列为模板,合成覆盖EV71 VP1～VP3的256条合成肽(每条肽12个氨基酸),分别以其为刺激物(80 μg/ml),采用ELISPOT法测定EV71灭活疫苗免疫小鼠脾单个核细胞( Mononuclear cell,MNC)诱导IFNγ分泌的斑点形成细胞数(Spot-forming cell,SFC),筛选细胞免疫抗原表位.从脾MNC中去除CD4+或CD8+T细胞及封闭MHCⅡ类分子或MHC Ⅰ类分子,分析抗原提呈途径.结果 通过对256条合成肽的筛选,获得3条可刺激小鼠脾MNC高水平分泌IFNγ的合成肽.以3条合成肽作为刺激物时,小鼠脾MNC分泌IFNγ SFC均值(单针免疫组:22.3、12.8、17.4；两针免疫组:29.3、44.1、28.5)较乙肝表面抗原对照肽S28-29(单针:2.1；两针:5.2)显著升高(P＜0.01).当MNC中去除CI4+T细胞或封闭MHCⅡ类分子后,IFNγ SFC均值显著下降(P＜0.05)；而去除CD8+T细胞或封闭MHC I类分子时,IFNγ SFC均值未见显著性差异(P＞0.05).结论 已成功筛选出3个EV71细胞免疫抗原表位,分别位于VP1、VP2和VP3区域.3条合成肽均属MHCⅡ类限制性多肽.
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肠道病毒71型与甲型肝炎病毒灭活疫苗联合免疫效果的初步评价
目的 初步评价肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)与甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)灭活疫苗联合免疫小鼠诱导的特异性免疫应答水平以及两种抗原间的相互作用.方法 将HAV灭活疫苗和EV71灭活疫苗以不同剂量配比制成联合疫苗,免疫ICR小鼠后,通过ELISA法检测血清HAV抗体效价；固定病毒-稀释血清法检测血清EV71中和抗体效价；流式细胞术检测脾脏中淋巴细胞亚群CD4+/CD8+的百分率；ELISPOT法检测脾脏中淋巴细胞分泌IL-4和IFNγ的水平.结果 初免后28 d和加强免疫后7d,各组小鼠血清中EV71中和抗体阳转率均达100％,单价疫苗组和联合疫苗组EV71中和抗体效价均呈剂量依赖性；初免后28 d,小鼠血清中能够产生保护性HAV抗体,加强免疫后抗体水平升高；联合疫苗组与相应的单价疫苗组间抗体水平差异无统计学意义(P＞0.05),未发现EV71与HAV的相互作用；初免后28 d,各组小鼠脾脏中CD8+细胞比例高于CD4+细胞(P＜0.001),加强免疫后7d则相反(P＜0.001)；初免后28 d,HAV全病毒和EV71多肽均不能刺激各组小鼠脾细胞产生阳性反应,加强免疫后7d,各组小鼠脾细胞分泌IL-4的水平均高于IFNγ(P＜0.05).结论 一定剂量的HAV和EV71联合疫苗可诱导小鼠产生良好的体液免疫应答,同时诱导细胞免疫应答,但相对较弱,未发现两种抗原间存在相互干扰或协同作用.
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氢氧化铝佐剂对肠道病毒71型灭活疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的影响
目的 评价氢氧化铝佐剂对肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)灭活疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的影响.方法 用含铝佐剂及无佐剂EV71灭活疫苗免疫BALB/c小鼠,并设生理盐水对照组.于加强免疫后7d采血,进行小鼠脾单个核细胞( Mononuclear cell,MNC)的分离及CD8+T细胞的去除,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测经EV71疫苗原液或VP2-36刺激后的小鼠脾MNC分泌IFNγ水平；应用液相芯片技术(LUMINEX)检测经EV71疫苗原液刺激后的小鼠脾MNC分泌IL-2、IL-4、IL-5、IL-6和IL-10水平；采用体外微量中和试验法检测小鼠血清中和抗体效价.结果 BALB/c小鼠经2次免疫后,铝佐剂疫苗组小鼠脾MNC的IFNy SFC值显著高于无佐剂疫苗组(P均＜0.05)；铝佐剂疫苗组分泌IL-6和IL-10水平显著高于无佐剂疫苗组(P均＜0.05)；铝佐剂与无佐剂疫苗组小鼠血清EV71中和抗体阳转率均达到100％,铝佐剂疫苗组诱导的中和抗体效价显著高于无佐剂疫苗组(P＜0.01).结论 EV71灭活疫苗可诱导BALB/c小鼠产生特异性IFNy、IL-2、IL-6和IL-10应答,铝佐剂可同时增强EV71灭活疫苗的Th1和Th2类免疫应答.
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静注肠道病毒71型人免疫球蛋白(pH4)的研制
目的 研制静注肠道病毒71型人免疫球蛋白(pH4)[Enterovirus 71 human immunoglobulin( pH 4)for intravenous injection,EV71-IVIG],用于治疗重症手足口病.方法 采用细胞病变抑制法检测原料血浆的抗EV71中和抗体效价(EV71 neutralizing antibody titer,EV71-NT),确定EV71抗体血浆的筛选标准；从健康人血浆中筛选中和效价较高的EV71血浆,按《中国药典》三部(2010版)的生产工艺连续制备3批EV71-IVIG;以乳鼠模型评价EV71-IVIG的治疗效果,并以细胞病变抑制法检测EV71-IVIG对EV71临床分离株及CA16病毒的中和活性.结果 从90批原料血浆中筛选出约3.8吨EV71抗体血浆,制备的3批EV71-IVIG符合《中国药典》三部(2010版)“静注人免疫球蛋白(pH 4)”的质量标准,EV71-NT为国内普通IVIG的4～5倍.0.5 mg EV71-IVIG即可充分保护经10 LD50EV71攻击的乳鼠,存活率达100％.EV71-IVIG对近几年流行的EV71临床分离株有较高的中和活性.结论 已成功研制EV71-IVIG,为重症手足口病患者的治疗提供了新的用药选择.
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静注人免疫球蛋白(pH4)中肠道病毒71型中和抗体效价的筛查
目的 对目前市售静注人免疫球蛋白(Human intravenous immunoglobulin,简称IVIG)(pH 4)以及静注肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)免疫球蛋白试验品中的EV71中和抗体效价进行筛查,为手足口病(Hand-foot-mouth disease,HFMD)的被动免疫治疗提供参考.方法 采用微量细胞病变法,在2个实验室,采用2个毒株检测国内IVIG产品以及经原料血浆筛查后制备的静注EV71免疫球蛋白试验品的EV71抗体效价.结果 实验室A采用毒株-01检测国内17个企业55批IVIG的EV71中和抗体效价范围为104～256,其中效价≥239的占23.64％(13/55),效价≥256的占12.73％(7/55),检测3批静注EV71免疫球蛋白试验品GMT为1 203.NIFDC实验室采用毒株-01检测国内8个企业12批IVIG的GMTs为335;检测3批静注EV71免疫球蛋白试验品的GMT为1 402,显著高于12批IVIG(P＜0.05);采用毒株-02检测国内12个企业16批IVIG的EV71 GMT为332,与毒株-01检测结果差异无统计学意义(P＞ 0.05).结论 来自全国各企业的IVIG中EV71中和抗体效价均为阳性,效价分布于104～630之间.经血浆筛查后投浆制备的静注EV71免疫球蛋白具有显著高于普通IVIG的EV71中和效价.
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干扰素及IL-6、IL-1β在肠道病毒71型感染过程中的作用
目的 探讨干扰素(Interferon,IFN)及白细胞介素-6( Interleukin-6,IL-6)、IL-1β在肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)感染过程中的作用.方法 采用EV71-FY23,在IFNα1b、IFNλ1和IFNγ分别存在的条件下感染Vero细胞及KMB17细胞,检测IFN对细胞的保护作用；建立EV71感染乳鼠模型,检测IFNα1b、IFNλ1、IFNγ、IL-6及IL-1β的抗病毒作用.结果 IFNα1b和IFNλ1对EV71感染的细胞具有明显的保护作用,而IFNγ的保护作用不明显；IFNα1b对感染EV71的乳鼠具有较好的保护效果,其在病毒感染之前的预处理方式产生的保护效果较为明显；IL-1β对感染EV71的乳鼠亦有不同程度的保护作用,而IL-6预处理方式不但无保护作用,反而加速了乳鼠的死亡.结论 IFN和IL-1β对EV71感染具有保护作用,而IL-6无此作用.
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肠道病毒71型感染患儿外周血自然杀伤细胞比例、亚群、表面受体及免疫效应分子的变化
目的 探讨肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)感染患儿外周血中自然杀伤(Natural killer,NK)细胞比例、亚群、表面受体及免疫效应分子的变化.方法 将EV71阳性的急性期患儿按疾病严重程度分为重症病例组和普通病例组,同时设健康对照组.提取各组患儿外周血,采用流式细胞术检测外周血中NK细胞比例、NK细胞亚群、自然细胞毒受体NKp30和NKp46、激活性受体NKG2D、抑制性受体CD94和NKG2A、脱颗粒标记CD107a及免疫效应分子(PF、GrB和GNLY)阳性细胞所占NK细胞的比例.结果 重症病例组患儿外周血NK细胞比例较健康对照组明显减少(P＜0.01),普通病例组CD16+NK细胞亚群比例较健康对照组升高(P＜0.05),重症病例组较普通病例组低,但差异无统计学意义(P＞0.05)；重症病例组和普通病例组NKG2D阳性细胞百分率均较健康对照组低(P＜0.01),而CD94和NKG2A阳性细胞百分率均较健康对照组明显升高(P＜0.01),NKp30和NKp46阳性细胞率3组之间差异无统计学意义(P＞ 0.05)；重症病例组和普通病例组CD107a、PF、GrB、GNLY的阳性细胞百分率均较健康对照组明显降低(P＜0.01或P＜0.05).结论 EV71感染可能抑制宿主NK细胞的增殖、激活及其杀伤功能.重症病例组与普通病例组比较,NK细胞比例和CD16+NK细胞亚群降低,抑制性受体CD94表达增高,胞浆内CD107a、GrB和PF表达显著降低,可能与重症病例的发生有关.
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肠道病毒71型中和抗体检测用标准病毒候选株的筛选及制备
目的 筛选并制备肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)中和抗体检测用标准病毒候选株,规范EV71中和抗体检测方法.方法 通过对亲本株与非亲本株交叉中和试验,进行相应的几何平均滴度(GMT)比较,从10株EV71毒株中筛选出具有理想亲本中和能力、又具有较广泛交叉中和作用的毒株.筛选出的毒株按《中国药典》三部(2010版)相关要求,冷冻干燥后制备1批符合我国疾病流行特征的标准病毒候选株,联合3家实验室对候选株的病毒滴度进行协作标定,并初步应用于人血清样品的检测.结果 筛选出交叉中和能力强、分离、传代背景清晰的EV71V03株(523-07T)作为候选病毒株;制备的候选病毒株分装精确度、水分含量、无菌检查、支原体检查、其他外源因子检查等项目均符合《中国药典》三部(2010版)相关要求;经联合标定,候选毒株的平均病毒滴度为4.83 lgTCID50/ml(95％ CI:4.53～5.12 lgTCID50/ml),变异系数为3.16％;应用候选毒株和中和抗体定值标准品检测EV71自然感染人血清样品,可将实验室间检测差异由4.4倍降至1.6倍.结论 初步筛选出的候选株EV71／523-07T株具有理想的亲本株中和作用,又具有较广泛的交叉中和特性,有望成为EV71中和抗体检测的标准毒株候选株.
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肠道病毒71型疫苗研究进展及质量标准
肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是导致手足口病的主要病原体之一,近年来在我国持续流行,对婴幼儿的健康造成了严重威胁.安全有效的疫苗是控制EV71流行的重要手段.全球有多家研究机构正在开展EV71疫苗的相关研究,目前由我国自主研发的3种EV71疫苗已获准上市.同时,为保证疫苗的安全性、有效性和质量可控性,已在研发中建立了合适且规范的质量标准.
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肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗研究进展
肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是引起儿童手足口病的主要病原体之一.由于尚无有效的抗病毒药物,故研发安全有效的疫苗是控制手足口病的有效措施.目前研发的EV71疫苗以灭活疫苗和病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗为主,研究表明,VLP具有良好的免疫原性和稳定性.此文对目前EV71 VLP疫苗的研究进展做一综述,以期为预防EV71相关手足口病及其他手足口病的新型疫苗的研制提供思路.
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肠道病毒71型疫苗的研究进展
肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是近年来我国流行的手足口病的主要病原体之一,并且由其感染引发的重症和死亡病例的比例较大.目前尚无治疗手足口病的特效药物.我国大陆有3家单位完成了EV71灭活疫苗的Ⅲ期临床试验,国家食品药品监督管理总局批准了其中两家单位的灭活疫苗.目前,减毒活疫苗、病毒样颗粒疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗等已开展动物研究.
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肠道病毒71型与宿主相互作用
肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是引起手足口病的主要病原体之一.EV71传播广泛,感染后可引发中枢神经系统疾病,并导致重症手足口病,给公共卫生安全带来极大挑战.EV71的致病机制与病毒和宿主间的相互作用关系密切,涉及EV71病毒复制、微RNA等多个环节.此文就近年来这些方面的研究进展做一综述.
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肠道病毒71型抗原定量检测方法的建立
目的 建立肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)抗原的定量检测方法,用于EV71疫苗生产过程中EV71抗原含量的监测.方法 用EV71抗原免疫新西兰兔制备抗EV71多克隆抗体,纯化后用辣根过氧化物酶标记.采用双抗体夹心ELISA法建立抗原检测系统.以EV71国家抗原标准品为定量标准,建立剂量反应曲线,确定该方法的线性范围和定量限,并对该方法的特异性、精密度、准确性、稳定性及适用性等进行验证.结果 建立的ELISA法的线性范围为5～80 U/ml,定量限为5 U/ml,线性决定系数均大于0.990 0;不同浓度样品回收率为85.0％～110.0％,变异系数均小于15％;置于2～8℃及37℃3、6d的抗体包被板对不同浓度样品的检测值变异系数均小于15％;该方法可特异性检测EV71原液,与非EV71样品无交叉反应.结论 建立了EV71抗原定量检测方法,为EV71疫苗生产工艺过程的质量控制奠定了基础.
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2010年至2012年深圳市手足口病分子流行病学研究
目的 了解2010年至2012年深圳市手足口病病原构成、分子特征和流行病学规律,为制订防制措施提供科学依据.方法 收集2010年至2012年深圳市手足口病疑似患者粪便或肛拭子标本1 523份,实时荧光定量PCR和反转录半套式PCR (RT-snPCR)法进行VP1基因系统进化分析,数据分析行x2检验.结果 手足口病发病以2岁以下儿童居多,其次为2～3岁组;宝安和龙岗区患者数多;各年龄组性别比较差异有统计学意义(x2=12.365,P=0.030).2010年至2012年1 523例手足口病患者病原学分析,肠道病毒阳性1 148例,占75.4％,包括肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒(Cox)A组和B组、埃可病毒等28种病原;居前4位分别为EV71 (57.1％)、CoxA6(18.5％)、CoxA16 (14.0％)和CoxA10(3.7％),以A组人肠道病毒(HEV-A)为普遍(96.2％).深圳市CoxA6毒株与2008年芬兰、2010年法国和2011年日本毒株亲缘性较近,CoxA10与2007年斯洛伐克、2008年西班牙毒株同源性高.结论 2010年至2012年深圳市手足口病病原谱以HEV-A组的EV71、CoxA6、CoxA16和CoxA10为主,CoxA6是继EV71之后的第2位主要病原体,深圳市CoxA6毒株可能起源于欧洲和日本.位于深圳北部的宝安区和龙岗区是手足口病的主要分布地区;＜2岁是手足口病高发年龄段.
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不同病程手足口病患者咽拭、肛拭配对标本肠道病毒检出率的比较
目的 比较不同病程手足口病患者咽拭、肛拭配对标本中肠道病毒的检出率.方法 采集2010年7月至2011年12月上海市儿童医院临床诊断手足口病患儿175例咽拭、肛拭配对标本,采用实时-PCR法进行柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)、肠道病毒71型(EV71)和其他EV属检测,分析不同病程配对标本肠道病毒检出率.配对标本行McNemar检验.结果 175例患者的配对标本CoxA 16、EV71、其他EV属咽拭子阳性率分别为38.29％、20.57％和8.00％,肛拭子阳性率分别为44.00％、23.43％和13.14％.结果显示两种标本检测结果的差异均有统计学意义(均P＜0.01).发病当天至发病后2d及4～11 d肛拭EV71阳性率均比咽拭阳性率高；发病后2～3d肛拭CoxA 16阳性率均比咽拭阳性率高；发病当天至发病后3d肛拭其他EV属阳性率均比咽拭阳性率高.对于EV71,咽拭标本在发病后3～11 d均可检出阳性,而CoxA 16、其他EV属在发病3d后都无法检出阳性.结论 肛拭标本总体阳性率高于咽拭标本.EV71在呼吸道带毒持续时间长于CoxA 16和其他EV属.在发病2d内肠道病毒在咽部繁殖扩增,此时病毒可通过呼吸道途径传播.
