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新波时间分辨荧光仪原理及故障分析
时间分辨荧光仪是由苏州新波生物公司生产的,具有操作简单、性能稳定、快速准确等优点的仪器.现将仪器的测量原理及日常使用中的故障,分析如下.1测量原理通过应用三价稀土离子作为示踪物,标记蛋白质、多肽、激素等物质,待反应体系(如抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤性反应等)发生后,用荧光分析仪测定后产物中的荧光强度,以此来判断反应体系中被测物质的浓度.
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溶血标本对检测结果的影响
1对生化指标的影响1.1对肝功能指标的影响.溶血对肝功能指标ALT,AST,TP,ALB产生正干扰,对TBIL,DBIL,GGT,ALP,TBA,AFU产生负干扰.这是因为AST,ALT等由于红细胞内外的浓度差异显著.有报道称:红细胞内AST浓度是血浆的38倍,因而轻微溶血就可导致结果假性增高;对于ALP,GGT,由于红细胞内含量低,溶血对标本的稀释作用及对反应体系氧化剂的消耗.
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结核分枝杆菌核酸检测试剂生产质量控制与临床研究概述
Mtb核酸扩增检测技术泛指以扩增DNA或RNA为手段,从而检测特定Mtb核酸序列或筛查特定Mtb基因的检测技术,常用检测技术有:PCR、连接酶链反应(ligase chain reaction,LCR)、转录依赖的扩增反应(transcription mediated amplification,TMA)等.笔者主要针对Mtb核酸扩增法检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制及临床研究的技术要求进行概述,为Mtb核酸扩增法检测试剂的研制提供参考.
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蚊AFLP技术体系的建立
目的 探讨蚊扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)的各种影响因素,建立并优化蚊AFLP反应体系.方法 以淡色库蚊成蚊为研究材料,对AFLP反应中的关键步骤,即多氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)提取、酶切及连接反应、预扩增和选择性扩增体系进行探索.结果 酶切及连接反应5h完成,将产物稀释10倍进行预扩增得到清晰的弥散带;预扩增产物稀释10倍及调整选扩循环数,可获得带型丰富且重复性好的结果.结论 蚊AFLP反应体系的建立为进一步分子生物学研究提供了基础.
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化学发光法测定葡多酚对羟和超氧阴离子自由基的清除
葡多酚,国外多称原花青素(grape procyanidins,GPC),据国外研究报道GPC具有抗氧化、抗自由基损伤等多种生物学功效.我们采用化学发光技术,检测了GPC对羟自由基(*OH)和超氧阴离子自由基(O@2)的直接消除作用.一、材料与方法1.葡多酚:取新鲜葡萄籽晾干粉碎,经石油醚脱脂后,用乙醇浸提并纯化干燥所得,纯度>99.9%.标准品由日本岛田株式会社提供.2.GPC对羟自由基(*OH)的清除试验: 采用Fenton羟自由基产生体系和依赖鲁米诺的化学发光技术进行.在反应体系中加入0.1 mmol/L鲁米诺0.8 ml、GPC样品0.02 ml、3%H2O2溶液和0.2 mmol/L FeSO4溶液各0.02 ml立即混匀测定发光强度值.共设7个剂量组,每个剂量做5个平行管,各管自由基含量以其化学发光强度值表示,计算GPC对*OH的清除率和50%清除浓度.
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胆红素清除自由基作用的顺磁共振研究
本研究利用顺磁共振(ESR)和自旋捕集技术,测定了胆红素清除活性氧自由基的作用,以此来探讨其抗氧化机制。利用ESR和自旋捕集技术,测定胆红素对Fenton体系[产生羟自由基(*OH)的化学反应体系]产生的*OH的清除作用、对次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系产生的超氧自由基(O(*)/(2))的清除作用以及对亚油酸脂质过氧化体系产生的脂质自由基(L*)的清除作用。实验以维生素C、E(VC、VE)作为对照样品。
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开口箭ISSR-PCR实验反应体系条件的优化
目的:建立与优化药用植物开口箭ISSR-PCR实验反应体系.方法:以开口箭DNA为材料,分析了Mg2+,dNTP,引物及Taq DNA聚合酶浓度对ISSR-PCR扩增结果的影响.结果:确立了稳定的、可重复的开口箭ISSR佳反应体系,即在10 μL的PCR反应体系中,含1 × buffer,2 U Taq DNA聚合酶,2 mmol·L-1 MgCl2,0.2 mmol·L-1 dNTP,0.75 μL引物.结论:从80条简单序列重复区间(ISSR)通用引物中筛选出了16条条带清晰稳定的引物,设置了不同的引物退火温度,为进一步进行开口箭的遗传多样性分析的研究奠定了基础.
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大鼠肝细胞浆一氧化氮合酶活性的简易测定法
一氧化氮合酶(NOS)主要有结构型一氧化氮合酶(cNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)两类.NOS在体内催化左旋精氨酸生成了一氧化氮(NO).NO的主要稳定代谢产物有NO2-和NO3-;,NO3-;浓度远远大于NO2-浓度[1],目前,NOS活性测定大多采用放射强度测定法[2],尽管此种方法灵敏度高,但测定过程复杂,需要比较昂贵的仪器,限制了方法的普及,目前亦有通过测定NO稳定代谢产物NO2-浓度测定NOS活性的方法[2],虽然该方法简便,但测定NO2-浓度的试剂具有毒性和腐蚀性,且试剂来源不便和不稳定.故本实验室参考有关文献[2-4],通过测定酶反应体系NO稳定代谢产物NO3-浓度的变化,建立了一种简便易行的NOS活性测定法.
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天麻AFLP反应体系的建立及优化
近年来,随着分子标记技术在植物学研究方面的广泛应用,不少中药研究者也尝试把分子标记技术用于中药材资源的分子鉴定和道地药材的鉴定.
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人巨细胞病毒UL57基因原核表达克隆的构建、表达及初步纯化
现有的IgM血清学试验对HCMV的诊断存在敏感性和特异性较差问题,其主要原因是迄今采用的抗原仍为从纯化的病毒颗粒中提取的病毒抗原性物质或粗提的病毒全抗原成分。近几年来人们致力于探讨能替代HCMV全病毒抗原的基因工程抗原,以完善IgM特异性血清学试验。本文通过构建HCMV DNA结合蛋白的一段基因的原核表达克隆,从而对表达产物的抗原性进行初步分析。 通过Oligosis软件设计UL57基因(aa540~604)两端引物,并在引物的5′端分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ内切酶识别序列及保护位点。引物序列如下:P1:CTGGGATCCCCCAAAGGTGACGAC P2:GTGAATTCTCAGCGATTGAGGA。从感染的人胚肺成纤维细胞中提取和纯化HCMVAD169基因组,以纯化的核酸为模板,加入PCR反应体系进行UL57基因的扩增。
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抗原激活红细胞调控系统血液免疫反应IL-8含量变化体外实验方法建立
癌细胞可被红细胞包绕形成花环的现象说明红细胞在癌细胞系统血液免疫反应中的地位[1-2],按系统生物学观点思考,认为在此血液免疫反应体系中存在4个要素:抗原、血浆、红细胞、白细胞,在一系列连锁免疫反应过程中必有种种产物出现,测定这些免疫反应产物有可能阐明红细胞在系统血液免疫反应中调控白细胞免疫功能的重要作用.
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MPN-PCR法快速定量检测海产品中致病性副溶血弧菌
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是在海洋环境及江湖河口广泛分布的一种条件性致病菌,是可引起人食物中毒的病原菌[1].患者以沿海地区居多,是食品检验的必检项目,常规检验多不能定量检测,常规PCR、多重PCR、荧光定量PCR等检测技术只对反应体系中模板DNA进行定量,无法鉴别污染食品中死活菌体.
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人乳头瘤病毒基因检测方法的初步比较及基因亚型分析
宫颈癌的筛查方法从分子水平检测通常采用多重核酸扩增荧光检测技术(FQ-PCR)和第二代杂交捕获技术(HC-Ⅱ)以及PCR结合反向寡核苷酸探针点杂交技术(PCR/RDB).FQ-PCR实验方法简单,其优点是易于操作,且全部实验均在一个密闭反应体系中完成,能有效避免交叉污染造成的假阳性;而HC-Ⅱ实验方法相对繁琐,其缺点是开放式的操作过程容易交叉污染造成假阳性,且试剂成本较高.但HC-Ⅱ的实验方法比FQ-PCR要早若干年应用于临床,现今仍在广泛应用,并在指导临床宫颈痛早防早治领域有不俗的表现.而FQ-PCR是近一两年来才应用于临床的实验方法,其对人乳头瘤病毒(HPV)检测的灵敏度和特异性如何,目前尚未见报道.
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重复序列引物聚合酶链反应在医院感染流行病学调查中的应用
随着医学治疗手段日益增多和细菌耐药株逐年增加,医院感染的暴发流行时有发生.绿脓假单胞菌由于在外界生长繁殖分布广泛,耐药性强,已成为当今医院尤其是重症监护室(ICU)医院感染主要病原菌之一[1].重复序列聚合酶链反应(rep-PCR)是一种新型基因分型方法[2,3].本研究通过优化反应体系,建立自己实验室绿脓假单胞菌rep-PCR分型技术,并对上海市某医院同一时期ICU病人及相关呼吸机的螺旋管、储水池及湿化器采样分离得到的绿脓假单胞菌株进行分型,并与同一时期其他病区菌株相比较.
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等位基因特异性多重聚合酶链反应技术对载脂蛋白E基因多态性检测的评价
载脂蛋白E(apolipoproteinE,apoE)是血浆主要载脂蛋白之一,具有明显的遗传多态性,3种常见的等位基因(ε2、ε3、ε4)分别编码3种主要异构体(E2、E3、E4),产生6种不同的基因型(ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4).apoE基因多态性不仅是心血管疾病的一种重要易患因素,而且与Alzheimer病密切相关.目前国内外检测apoE基因多态性的方法很多,因而快速简便的检测方法也就成为研究中关注的焦点.等位基因特异性多重聚合酶链反应(PCR)技术(multi-ARMS)是利用TaqDNA聚合酶对引物3′端核苷酸的特异性,在不同的反应体系中分别加入与待检测位点野生型、突变体相配的一对引物,通过扩增产物的有无来判定该位点是否突变.
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基因芯片分型中荧光标记引物的多重扩增及试验优化
基因芯片技术以其平行高效多位点多态性分型的优势,在基础和临床研究中被广泛应用.然而,随着位点增多,扩增目的片段更繁琐,为了提高效率和降低成本,就需要在同一反应体系内进行多重扩增[1].而多重扩增的关键问题是,同一体系内引物对的大化,并有效减少非特异扩增.目前,此环节可通过计算机辅助设计和尝试不同引物对组合解决.
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8种细菌随机扩增多态性DNA引物筛选与反应体系优化
随机扩增多态性DNA(RAPD)是一种新兴的基因分型方法,可对细菌等病原微生物进行基因分型并广泛应用于分子微生物学的追踪调查及医院感染的分析[1].该方法的大特点是可对模板序列未知,而随机引物可以是任意10个bp的单链寡聚核苷酸片段.本研究以临床常见的8种细菌为对象,各筛选200条随机引物,并应用反应曲面设计(RSD)方案[2]对反应体系中关键反应成分(模板、引物及镁离子)浓度进行了优化,旨在为相关细菌的RAPD反应体系标准化及分型提供科学依据.
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荧光偏振技术同步检测沙眼衣原体解脲脲原体方法的研究
沙眼衣原体(CT)、解脲脲原体(UU)是常见泌尿生殖系感染等病原体,其早期检测对临床诊断治疗十分重要[1].传统的单一检测这两种病原体工作繁琐、费用高.本研究建立了荧光偏振与模板指导的末端延伸反应检测技术(TDI-FP),在同一反应体系应用多重引物,检测CT、UU感染,大大提高了检测时效.
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荧光偏振技术同步检测肺炎支原体肺炎衣原体方法的研究
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)、肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae,CP)是呼吸道感染的常见病因,及早准确地检测,对预防控制相关疾病非常重要[1].本研究采用荧光偏振检测与模板指导的末端延伸反应检测技术相结合(TDI -FP)的方法,建立了在同一反应体系中同步检测肺炎支原体、肺炎衣原体感染的方法.
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免疫学检验中的酶免疫技术
20世纪中期,以放射免疫技术为代表的标记免疫技术相继问世,它将某种可微量或超微量测定的物质(如放射性核素、荧光素、酶、化学发光剂等)标记于抗原(抗体)上制成标记物,加入到抗原抗体的反应体系中与相应的抗体(抗原)反应,以检测标记物的有无及含量间接反映被测物的存在与多少.