首页 > 文献资料
-
辽宁省1株犬种布鲁氏菌分离株的分子生物学鉴定
目的 对2010年辽宁省分离的1株疑似犬种布鲁氏菌进行生物型及分子生物学鉴定.方法 采用布鲁氏菌常规鉴定分型方法,结合多重聚合酶链反应(PCR)和多位点可变数量串联重复序列分析(MLVA)方法.结果 常规分型方法和MLVA方法鉴定该分离株为犬种布鲁氏菌.结论 采用传统分型方法,同时结合MLVA方法对布鲁氏菌进行分型鉴定,可以增加鉴定工作的稳定性与正确性.但多重PCR结果也提示犬种布鲁氏菌与猪种布鲁氏菌的亲缘关系较近.
关键词： 犬种布鲁氏菌 多重聚合酶链反应 多位点可变数量串联重复序列分析 分型 -
一种多重PCR方法快速鉴定7种常见肠道病原菌
目的 建立一种能够快速检测并分型5种致泻性大肠埃希菌、志贺菌及沙门菌的多重聚合酶链反应(multiplex polymerase chain reaction,M-PCR).方法 方法设计针对7种常见肠道致病菌的12对引物,通过多重PCR方法扩增后电泳观察相应条带,确定病原菌.临床标本直接划线接种于肠道选择性平皿,挑取可疑菌落直接提取核酸进行多重PCR检测.结果 所有标准菌株均能扩增到相应目的片段,322份腹泻病标本中使用该方法共检出志贺菌24株(福氏志贺菌7株、宋内志贺菌17株)、沙门菌5株、EPEC共12株(均为aEPEC)、ETEC共6株(elt阳性3株；est阳性3株)、EIEC共3株、VTEC共1株(stxl和stx2A均阳性)、EAEC共3株.结论 该方法快速特异,能同时检测7种常见肠道致病菌,可用于腹泻病常见病原的快速检验.
-
肠球菌种属鉴定及万古霉素耐药基因型检测的多重聚合酶链反应方法的建立及应用
目的 建立快速准确的肠球菌种属鉴定及万古霉素耐药基因检测的多重聚合酶链反应(multiplexpolymerase chain reaction,MPCR)方法,并在人及动物源菌株中应用.方法 针对肠球菌属、粪肠球菌、屎肠球菌、vanA、vanB、vanC1、vanC2/ C3保守基因设计引物,建立肠球菌种属鉴定及万古霉素耐药基因型检测的MPCR方法;应用建立的MPCR方法检测98株人及动物源菌株菌种及万古霉素耐药基因,并比较MPCR方法检测结果与检测菌株的VITEK Compact 60自动微生物鉴定仪菌种鉴定结果及琼脂稀释法的万古霉素及替考拉宁药敏检测结果,分析MPCR方法检测结果与其他方法的一致性.结果 成功建立了用于检测肠球菌属和常见肠球菌种及万古霉素耐药基因型的MPCR方法.MPCR方法和VITEK Compact 60自动微生物鉴定仪对98株检测菌株菌种鉴定结果一致;MPCR方法检测98株菌万古霉素耐药基因型与药敏检测其耐药表型相对应.结论 建立的MPCR方法成功用于检测人及动物源肠球菌种属及万古霉素耐药基因型,为快速准确鉴别肠球菌种属及万古霉素耐药肠球菌耐药基因型提供方法,对于有效监测万古霉素耐药肠球菌,控制其传播、流行具有重要意义.
-
布鲁氏菌多重聚合酶链反应鉴定研究
目的 在同一体系中对布鲁氏菌6个种进行鉴定.方法 根据布鲁氏菌6个种的差异基因设计5对引物,应用多重聚合酶链反应(PCR)方法对布鲁氏菌进行鉴定.先用标准菌株建立方法,优化实验条件,然后扩增地方株进行验证.结果 除绵羊附睾种外多重引物PCR方法能将其余5个布鲁氏菌种全部鉴定出来.结论 这种方法快速准确,且对实验操作人员安全,是布鲁氏菌鉴定的辅助方法.
-
多重聚合酶链反应技术检测严重少精及无精子症患者无精子因子的研究
遗传缺陷引起男性精子发生障碍是男性无精子症、严重少精子症的原因之一。业已证明，位于Y染色体长臂的无精子因子(azoospermia factor, AZF)的基因缺失或突变引起精子发生异常，为调控精子发生的候选基因之一。本研究采用多重聚合酶链反应技术检测50名正常男性及36例严重少精及无精子症患者AZF因子。
-
多重PCR检测食品中的金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌
目的 建立一种能同时检测食品中金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的多重PCR检测方法.方法 采用7.5%NaC1肉汤对食品样品中的金黄色葡萄球菌进行增菌,同时采用GN增菌荆对食品样品中的志贺菌和沙门菌进行增菌.根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、志贺菌的ipaH基因、沙门菌的invA基因设计引物,通过多重聚合酶链反应(PCR)反应对食品样品中上述三种病原菌的目标基因进行扩增,同时对反应体系进行优化.结果 特异性实验表明本方法的特异性良好.对污染金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的牛奶样品进行检测,检出限为lcfu/ml.结论 本实验建立的多重PCR检测方法适用于食品中金黄色葡萄球菌、志贺茼和沙门菌的快速检测,具有快速、简便、灵敏的特点.
-
应用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的研究
目的 建立并评估快速鉴定结核分枝杆菌复合群(MTBC)与非结核分枝杆菌(NTM)的多重PCR方法.方法 应用分别针对MTBC的oxyR-ahpC基因间隔区、MTBC和NTM的rpoB基因可变区的3对分枝杆菌特异性引物进行多重PCR扩增,扩增产物分别为473bp、235bp和136bp.应用该多重PCR方法对6株MTBC标准株、50株NTM标准株、312株MTBC临床分离株和300株NTM临床分离株进行了初步菌种鉴定.结果 经多重PCR扩增后进行凝胶电泳,MTBC标准株473 bp和235 bp片段均可见,NTM标准株仅见136 bp片段.312株MTBC临床分离株中,310株扩增出473 bp和235 bp片段,敏感度为99.36％(310/312),特异度为99.32％(294/296);300株NTM临床分离株中,294株扩增出136 bp片段,敏感度为98.00％(294/300),特异度为100.00％(310/310).结论 该多重PCR方法可检测并鉴别MTBC及NTM,具有高度的特异度和敏感度,有可能作为鉴别MTBC与NTM的有价值的检测手段.
-
应用多重PCR技术快速鉴定牛分支杆菌卡介苗株
目的:建立快速鉴定牛分支杆菌卡介苗(Bacillus Calmette Guerin,BCG)菌株的方法.方法:依据近研究发现的牛分支杆菌BCG菌株不存在命名为缺失区1(deleted region 1,RD1)的基因区,而其它牛分支杆菌菌株和其它结核分支杆菌复合群(MTC)菌种(结核分支杆菌、非洲分支杆菌和田鼠分支杆菌)存在RD1基因区的遗传学信息,应用多重聚合酶链反应(PCR)检测RD1基因区存在与否,鉴别BCG菌株与其它牛分支杆菌菌株及其它MTC菌种.RD1区编码约9.5kbDNA片段,至少含8个开放阅读框架.
-
多重PCR系统快速诊断结核和其它细菌感染
目的:建立一种可用于诊断细菌感染,并能鉴别结核和其它细菌感染的快速诊断方法.方法:根据细菌16S rDNA保守区和多变区设计两条通用引物和一条结核菌特异引物,建立多重PCR系统.进行一次扩增后,普通细菌均可得到相应360bpDNA片断,结核杆菌可得到360bp和210bp两个DNA片断.检测82份临床样本包括:全血42份、脑脊液22份、胸水9份、腹水9份,与培养结果相比较,分别评估该系统检测普通细菌和结核菌的敏感性和特异性.结果:以细菌培养为金标准,本系统检测临床样本中普通细菌和结核菌的敏感性均达100%,特异性分别为76%和94%.结论:所建立的多重PCR系统具有特异性强、敏感性高的优点,是一种快速可靠的诊断细菌感染的新方法,并能有效区分结核感染和其它细菌感染.
关键词： 核糖体小亚基核糖核酸基因 多重聚合酶链反应 细菌 结核杆菌 -
多重聚合酶链反应检测流感嗜血杆菌
目的 建立检测流感嗜血杆菌的多重聚合酶链反应(M-PCR)方法 .方法 合成扩增流感嗜血杆菌编码P6外膜蛋白基因的引物(Hi),鉴定流感嗜血杆菌种特异性;合成扩增流感嗜血杆菌编码荚膜基因的引物(Hi-cap),鉴定菌株是否具有荚膜;设计并合成6对扩增流感嗜血杆菌不同血清型(荚膜型)编码摹因的引物(Hia-Hif),鉴定菌株的血清型,以其他呼吸道常见病原体菌株做对照,应用M-PCR方法 对200株临床分离的疑似流感嗜血杆菌菌株进行鉴定和血清分型.结果 M-PCR方法 检测流感嗜血杆菌具有高度的敏感性和特异性.对照菌株应用种(Hi)、荚膜(Hi-cap)和荚膜型(Hia-Hif)特异引物没有扩增出DNA片段.M-PCR方法 检测DNA的低检测量为0.935 Pg.对临床分离的200株疑似流感嗜血杆菌鉴定,189株为流感嗜血杆菌,与API R NH鉴定结果 一致.其中1株具有荚膜,为f血清型,与玻片凝集法鉴定结果 一致.结论 M-PCR方法 检测流感嗜血杆菌具有较高的敏感性和特异性,可用于流感嗜血杆菌感染病例标本的快速检测和病例诊断.
-
巢式多重聚合酶链反应在腺病毒检测及分型中的应用
目的 建立一种快速、敏感、特异的腺病毒检测及分型方法.方法 根据编码腺病毒六邻体基因的核苷酸序列设计一对外引物(即通用引物),扩增产物为1278 bp;再分别设计针对腺病毒六邻体基因3、7、11和21型特异性序列的4对内引物,扩增产物分别为502、311、880和237 bp.应用多重巢式聚合酶链反应(nest-PCR)技术将这4对引物用于同一聚合酶链反应管中,根据扩增产物在琼脂糖凝胶电泳上的大小,即可鉴别所测毒株的型别.结果 3、7、11和21型腺病毒标准株和分离株分别产生预期的特异性扩增片段,与其他常见的呼吸道病毒等无交叉反应.118份经病毒分离和/或间接免疫荧光法确定为腺病毒阳性的急性呼吸道感染患儿临床标本中,腺病毒3型占64.4%(76/118),7型占31.4%(37/118),11型占2.5%(3/118),未检测到21型;2份病毒分离和间接免疫荧光均为腺病毒阳性的标本中,用该方法未能鉴定出型别,可能是3、7、11、21型以外的腺病毒,占1.7%(2/118).33份经病毒分离和/或间接免疫荧光法均未检测到腺病毒的标本中,有3份为PCR阳性(包括1份7型,2份3型).结论 该方法鉴别3、7、11、21型腺病毒具有快速、简便、特异等特点,适用于腺病毒型别鉴定,可以为急性呼吸道感染的临床或群体公共卫生事件提供病原学诊断依据.
-
鉴别脑膜炎奈瑟菌A、B、C、Y、W135群的多重聚合酶链反应诊断方法
目的建立一种能鉴别脑膜炎奈瑟菌(Nm)A、B、C、Y、W1355个血清群的多重聚合酶链反应(PCR)方法.方法首先PCR扩增Nm crgA基因,确定Nm感染;再通过多重PCR扩增荚膜表达基因orf-2和siaD基因,根据特异条带区分不同群Nm.结果多重PCR检测61株Nm与4株非Nm,能准确地鉴定并可将Nm分成5个血清群;检测4例流行性脑脊髓膜炎患者的脑脊液,2例出现A群400 bp的特异条带,而细菌培养和胶乳凝集方法检测均为阴性;检测18份流行性乙型脑炎患者标本,与胶乳凝集试验结果一致.结论多重PCR诊断方法能正确鉴别不同群Nm,对流行性脑脊髓膜炎的临床诊断与流行病学调查有重要意义.
-
空肠弯曲菌多重聚合酶链反应基因鉴定及其毒力相关基因分析
目的 建立空肠弯曲菌、结肠弯曲菌多重聚合酶链反应(m-PCR)鉴定方法,并对菌株毒力相关基因cadF、virB11、flaA、cdtA、cdtB、cdtC的分布进行初步分析.方法 利用m-PCR的方法对经过传统生物化学方法鉴定的65株弯曲菌进行鉴定,并通过空肠弯曲菌特异基因hipO、结肠弯曲菌glyA基因特异片段的PCR扩增对鉴定的结果进一步验证;利用特异引物PCR方法初步分析其毒力、毒素相关基因cadF、virB11、flaA、cdtA、cdtB和cdtC的分布.结果 m-PCR扩增结果发现65株不同来源的弯曲菌,42株为空肠弯曲菌,23株为结肠弯曲菌.hipO、glyA基因PCR扩增结果与m-PCR扩增结果一致.16.9%菌株PCR鉴定结果与传统的生物化学鉴定结果不一致.100%(65/65)菌株cadF、flaA基因阳性,并且PCR扩增片段大小一致.virB的阳性率为10.8%(7/65),其中空肠弯曲菌阳性率11.9%(5/42),结肠弯曲菌阳性率为8.7%(2/23).空肠弯曲菌、结肠弯曲菌cdtA的阳性率分别为100%(42/42)和78%(18/23);空肠弯曲菌cdtB扩增的的阳性率为97.6%(41/42),而23株结肠弯曲菌扩增结果均为阴性;空肠弯曲菌、结肠弯曲菌cdtC的阳性率皆为100%,但PCR扩增产物大小不一致,空肠弯曲菌为555 bp,结肠弯曲菌约为465 bp.结论 m-PCR的方法可以有效的对空肠弯曲菌和结肠弯曲菌进行属内分型.中国菌株细胞溶涨毒素基因簇cdt基因的特征与文献报道国外菌株存在差异.
-
多重聚合酶链反应在性病病原体鉴别中的应用
淋球菌(Ng)、沙眼衣原体(Ct)和解脲脲原体(Uu)所致疾病的主要临床表现非常相似,而治疗方案不尽相同.采用多重聚合酶链式反应进行病原体检测,978份标本均取自来本院就诊的性病怀疑者,其中男570例,年龄18～58岁,均取尿道拭子;女408例,年龄18～55岁,均取宫颈拭子.
-
乙基亚硝基脲对人白血病细胞HPRT基因的影响
目的探讨乙基亚硝基脲(ENU)诱导人次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因突变的分子图谱和发生机制.方法采用单细胞克隆培养、双向筛选计数、多重聚合酶链反应扩增和电泳分析等方法.结果随着ENU剂量的增加,细胞接种存活率非常显著下降(100～200 μg/ml剂量组)、突变频率显著升高(12.5～200.0 μg/ml剂量组).自发突变没有全部基因外显子缺失型,只有7.7%检测出单个外显子缺失;而ENU诱发突变中却有79.7%显示缺失改变,其中缺失突变可以发生于HPRT基因的每个外显子,且诱发突变中大多数是多个外显子连锁缺失(88.1%).结论 ENU诱发HPRT基因突变图谱与自发突变完全不同,易诱发较大遗传结构改变,提示其具有较强的致突变作用.
-
不明原因无精症及少精症的AZF微缺失的分析
目的 探讨男性不育患者中无精症、少精症与Y染色体基因(无精子因子,AZF)微缺失的关系,建立一个完整的适合中国人的AZF微缺失筛查的临床基因诊断方法.方法 对62例无精症、少精症患者及20例正常男性采用多重聚合酶链反应法进行AZF区基因微缺失检测.结果 44例无精症患者中存在6例缺失,占13.64%,18例少精症患者中存在4例缺失,占22.22%,缺失以AZFc区为主,20例正常男性对照AZF无缺失.结论 Y染色体AZF微缺失是不明原因无精症、少精症的主要原因之一.
-
人芳香二烷基磷酸酯酶基因丛基因多态性快速分析法
目的建立一种人芳香二烷基磷酸酯酶(PON)基因丛等位基因快速分型法.方法在Multiplex-PCR-RELP基础上,通过引物设计错配,在一体系中同时扩增分别含PON1-192、PON1-55和PON2-311位密码子的DNA片段,当等位基因为PON1-192R/PON1-55L/PON2-311S时,PCR扩增产物中均被引入唯一的限制性内切酶HinfⅠ的识别位点G*ANTC.PCR扩增产物经酶消化,聚丙烯酰胺凝胶电泳后,相互分开的不同组合的片段,确认为不同的基因型组合,同时对3个位点进行基因分型.结果在检测的80例健康个体中,等位基因频率为PON1-192:Q 46.9%,R 53.1%;PON1-55:L 95.6%,M4.4%;PON2-311:S 78.8%,C 21.2%.结论此方法快速分析3个位点的基因多态性,省时省力、节约经费,便于3个位点之间的连锁分析,具有推广价值.
-
应用毛细管无胶筛分电泳诊断缺失型杜氏肌营养不良基因
毛细管电泳是一项新兴的分离、分析技术,它以高效、快速、重复性好、自动化及微量等优点,在核酸分离分析的各方面均较以往的方法更具优势.本工作应用毛细管无胶筛分电泳与多重PCR技术相结合对缺失型杜氏肌营养不良的病人进行了直接基因诊断.与传统方法相比,本技术在分离速度、分辨率及灵敏度方面均有较大改善.毛细管电泳技术将广泛用于遗传病基因诊断.
-
细菌性脑膜炎多重聚合酶链反应检测方法的研究
目的 建立8种细菌性脑膜炎多重聚合酶链反应(Multiplex-polymerase Chain Reaction M-PCR)检测方法.方法 针对脑膜炎奈瑟菌、流行性感冒嗜血杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌、猪链球菌、结核杆菌、新生隐球菌的种特异性基因,通过优化单-PCR扩增体系及扩增程序,建立M-PCR方法检测8种导致细菌性脑膜炎的病原体,检测M-PCR体系的灵敏度.结果 初步建立了检测8种导致细菌性脑膜炎病原体的M-PCR扩增方法,能够同时检测多种导致细菌性脑膜炎的病原.结论 M-PCR方法较常规的分离培养鉴定方法具有较高的灵敏度和检测快速的特点,适合临床疑似细菌性脑膜炎感染病例的检测及筛查,提高临床细菌性感染脑膜炎病例的诊断阳性率.
-
鼠疫耶尔森菌的多重PCR检测方法
目的 研究一种快速、特异的检测鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)的多重聚合酶链反应(PCR)方法.方法 选用针对鼠疫菌F1抗原基因、pla基因、inv基因和一段鼠疫特异染色体序列设计的4对引物,以鼠疫菌及其他肠道致病菌DNA为模板并加入内部对照模板,在同一扩增体系中进行PCR扩增.结果 鼠疫菌DNA模板可扩增出预期产物,而其他菌株只能扩增出内部对照模板的片段.结论 多重PCR方法具有较高的特异性.可迅速、有效地将鼠疫菌与其他肠道致病菌相鉴别,也可应用于鼠疫监测.
