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一种多重PCR方法快速鉴定7种常见肠道病原菌
目的 建立一种能够快速检测并分型5种致泻性大肠埃希菌、志贺菌及沙门菌的多重聚合酶链反应(multiplex polymerase chain reaction,M-PCR).方法 方法设计针对7种常见肠道致病菌的12对引物,通过多重PCR方法扩增后电泳观察相应条带,确定病原菌.临床标本直接划线接种于肠道选择性平皿,挑取可疑菌落直接提取核酸进行多重PCR检测.结果 所有标准菌株均能扩增到相应目的片段,322份腹泻病标本中使用该方法共检出志贺菌24株(福氏志贺菌7株、宋内志贺菌17株)、沙门菌5株、EPEC共12株(均为aEPEC)、ETEC共6株(elt阳性3株；est阳性3株)、EIEC共3株、VTEC共1株(stxl和stx2A均阳性)、EAEC共3株.结论 该方法快速特异,能同时检测7种常见肠道致病菌,可用于腹泻病常见病原的快速检验.
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艾伯特埃希菌快速鉴定方法比较研究
目的 评价目前用于快速鉴定艾伯特埃希菌方法的特异性.方法 利用51株艾伯特埃希菌及其他对照菌株,分别评价基于clpX、lysP和mdh基因的三重聚合酶链式反应(PCR);基于EA0134基因的单重PCR;基于EACBF2103-EACBF2104基因的巢式PCR.结果 51株艾伯特埃希菌三重PCR均为阳性,鉴定吻合率为100％;巢式PCR两轮结果均为阳性,鉴定吻合率为100％,对照组第1轮PCR结果全部为阴性,但第2轮出现非特异条带.51株中49株EA0134基因为阳性,鉴定吻合率为96.08％,对照菌株中伤寒沙门菌和肠出血性大肠埃希菌O157∶H7扩增出大小类似的片段.结论 EA0134基因在一些菌株中缺失,会造成漏判,同时在部分肠道菌株中存在非特异性扩增,会造成误判.三重PCR和巢式PCR的第1轮扩增均具有高特异性,可作为目前艾伯特埃希菌分离株的PCR快速鉴定方法,为艾伯特埃希菌相关的临床诊断和突发公共卫生事件处置,提供准确快速的诊断依据.
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基质辅助激光解析电离飞行时间质谱快速鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
目的 研究基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-Ms)用于快速检测鉴定金黄色葡萄球菌及其耐药性的可行性.方法 用MALDI-TOF-MS和API Staph系统鉴定了40株临床分离的葡萄球菌,用Kirby-Bauer法检测金黄色葡萄球菌的耐药性.结果 40株临床分离的葡萄球菌中34株细菌用MALDI-TOF-MS鉴定为金黄色葡萄球菌,6株为其他葡萄球菌.与API Staph系统鉴定结果一致.Kirby-Bauer法耐药性检测显示其中11株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA),23株为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-susceptible Staphylococcus aureus,MSSA),34株金黄色葡萄球菌用MALDI-TOF-MS鉴定时聚类为2类,结果与耐药性检测结果一致.结论 结果提示MALDI-TOF-MS可以用于MRSA的快速鉴定.
关键词： 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 金黄色葡萄球菌 耐药性 快速鉴定 -
PCR法鉴定结核分枝杆菌复合群亚种的研究
结核分枝杆菌复合群中各菌型致病性和药物敏感性不尽相同,在临床治疗前需要进行菌种鉴定,目前临床使用的生化方法耗时长,给治疗带来不便,本研究采用PCR法可快速鉴定结核分枝杆菌复合群亚种,具有快速、准确的优点,现将研究结果报道如下.
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噬菌体生物扩增法在分支杆菌鉴定和药敏试验中的应用
噬菌体生物扩增法可用于分支杆菌的快速鉴定及药敏试验.我们应用分支杆菌噬菌体D29进行检测,取得了满足结果.现报道如下.
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应用多重PCR技术快速鉴定牛分支杆菌卡介苗株
目的:建立快速鉴定牛分支杆菌卡介苗(Bacillus Calmette Guerin,BCG)菌株的方法.方法:依据近研究发现的牛分支杆菌BCG菌株不存在命名为缺失区1(deleted region 1,RD1)的基因区,而其它牛分支杆菌菌株和其它结核分支杆菌复合群(MTC)菌种(结核分支杆菌、非洲分支杆菌和田鼠分支杆菌)存在RD1基因区的遗传学信息,应用多重聚合酶链反应(PCR)检测RD1基因区存在与否,鉴别BCG菌株与其它牛分支杆菌菌株及其它MTC菌种.RD1区编码约9.5kbDNA片段,至少含8个开放阅读框架.
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BACTEC 960培养液抗酸涂片细菌形态观察在分支杆菌菌型鉴定中的意义
目的:观察分支杆菌在BACTEC960培养仪中的生长特点和涂片细菌抗酸形态,提供初步快速鉴定分支杆菌的实验室方法,从而提高分支杆菌的鉴定水平.方法:收集我院住院病人痰,脑脊液,胸水,尿液标本共计1544份,经前处理后分别接种MGIT培养基及对硝基基甲酸PNB培养基,置BACTEC960快速培养仪和37C培养箱,待培养仪出现阳性示警后,取出MGIT培养管,吸取培养物直接涂片,作抗酸染色和革兰氏染色形态学检查.结果:MGIT培养管内培养物清淅,有片状或团状沉淀物,涂片分支杆菌为长链状排列,PNB不生长.
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有瓣成蝇快速分类鉴定计算机自动检索系统的建立
[目的]探索有瓣成蝇快速鉴定技术,同时为口岸建立其它媒介生物快速鉴定技术提供参考.[方法]研究用于鉴定有瓣蝇类的部位特征,并对其简化选择及编码,建立检索数据库,通过计算机技术,达到快速鉴定检索的目的.[结果]选择了23个蝇类部位特征作为用以鉴定的依据,对3000多种有瓣蝇类进行编码,建立了计算机自动检索系统.[结论]本系统检索途径多样、检索速度快捷、检索方法简单,易于掌握,大大地提高了工作效率,对口岸媒介生物控制工作具有很大的应用价值.
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对一起由亚硝酸盐引起的食物中毒的思考
1中毒经过2003年8月9日上午,济南市某单位5人到济南市一小饭馆就餐,主菜为酱牛肉、油炸花生米,边饮(扎啤)边吃,进食约15 min,其中1人感觉不适,头晕恶心,皮肤青紫及呼吸困难,随后其余4人也相继出现不同程度的相同症状,并及时被送往就近医院诊治.当即临床诊断为亚硝酸盐中毒,经对症治疗,病人均脱离危险.医院在对病人诊治的同时,向市卫生局报告中毒情况.卫生局接到报告后,立即派出由济南市疾病预防控制中心和市卫生监督所组成的应急队伍,火速赶到医院询问患者,对患者呕吐物进行快速鉴定,结果为亚硝酸盐强阳性反应.鉴于此况,应急小分队立即到达中毒现场进行控制和调查,避免了事态的蔓延.从卫生学调查资料来看,该饭店厨师因故近几天未上班,其徒弟在腌制牛肉时顺手抓了一把"硝"(他不知道"硝"为何物,只知道他师傅在做熟牛肉时使用,做出的牛肉色泽好看,并且是和食盐一样的可食物).腌制0.5 h后煮沸供顾客食用.
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结核分枝杆菌药物敏感性试验研究进展
结核病危害人类健康已有数千年的历史,人类文明的进步与发展遏制了结核病的蔓延与传播,尤其在使用了有效的抗结核药物以后.但是自20世纪80年代后期,许多国家与地区结核病发病率、死亡率出现了回升趋势,造成这一现象的主要原因之一便是多耐药结核菌(MDR-TB)的产生[1].在我国山东省的一项流行病调查发现结核菌耐药水平比较高,这一结果提示我国耐药结核菌的水平普遍偏高[2];处理耐药菌株感染的关键是直接从临床标本中快速鉴定出这些菌株.因此,国内外在耐药结核分枝杆菌检测方法上开展了积极、富有成效的研究,并朝着快速、简便、准确、低成本的方法发展.
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液相色谱-质谱-质谱方法同时测定抗疲劳保健食品中伐地那非、西地那非、他达那非
西地那非、伐地那非、他达那非是用于治疗男性功能障碍的处方药,严禁添加在保健食品中.西地那非柠檬酸盐(sildenafil citrate)俗称伟哥,早进入中国市场;他达那非即西力士(cialis),是第2代磷酸二酯酶(PED-5)选择性抑制剂,药效更快、更持久;伐地那非是继西地那非、他达那非之后第3种男性性功能障碍用药[1],它与西地那非在结构上只有微小差异.3种药物常见副反应都是头痛、面部泛红、鼻溢和消化不良等,对于心血管患者,有可能导致突然死亡[1].一些不法厂家为检测时蒙混过关,往往加入后两种更快、更持久的药物,严重威胁到服用者的健康,所以有必要建立能同时对这3种药物快速鉴定并且准确定量的方法.我们采用液相色谱-质谱-质谱(LC-MS-MS)联用技术,集LC的高分离能力及MS的强定性能力于一体,对这3种药物同时进行检测.
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基于DNA条形码的翠云草快速鉴定方法研究
目的:基于卷柏属植物DNA条形码鉴定序列,运行TaqMan探针技术探讨翠云草快速鉴定新方法.方法:本文利用DNA条形码鉴定技术对采集的11种32份卷柏属样本提取总DNA扩增ITS2序列,结合Genbank数据库的34种103条序列综合分析,针对翠云草设计特异引物及探针,运用实时荧光PCR检测技术比较序列扩增荧光信号差异实现翠云草的快速鉴定.结果:在所分析的物种中ITS2序列可将翠云草与其它卷柏属近源物种有效区分,TaqMan探针及引物特异性较好,本研究建立的方法在翠云草的鉴别中具有良好的特异性、重复性及灵敏性,甚至可从低至1 mg的样品中提取DNA得到有效检出.结论:基于DNA条形码鉴定序列变异位点信息,运用高特异TaqMan探针实时荧光PCR检测技术,可实现翠云草真伪快速鉴别,具有中药材市场监管应用前景,将为中药材快速鉴定应用研究提供参考.
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红曲菌株鉴别中SCAR分子标记的应用
目的:建立一套基于DNA遗传标记技术的红曲菌株快速鉴定方法.方法:采用RAPD方法对分离收集的10个红曲菌株进行多态性分析,从菌株F中获得1个421 bp的特异RAPD标记片段F421.Blast分析未发现F421序列(GenBank登录号EF063107)与GenBank中相关序列有较高同源性.根据该序列设计特意引物,对10个红曲菌株进行PCR检测.结果:利用所获得的特征性片段扩增区域(SCAR)标记能能在1 d内准确地鉴别出红曲F菌株.结论:利用SCAR分子标记技术对红曲菌株进行分类鉴别是红曲研究领域的新尝试,为推广应用SCAR分子标记技术对药用真菌进行菌株快速准确鉴定提供技术依据.
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清开灵注射液中14种胆汁酸的HPLC-ESI-MS/MS快速鉴定
目的:研究清开灵注射液中胆汁酸类成分的ESI-MS/MS裂解规律及其快速识别方法.方法:采用HPLC-ESI-MS/MS技术研究5种胆汁酸类成分的ESI-MS/MS裂解规律,并对8个生产厂家清开灵注射液中的胆汁酸类成分进行快速鉴别.结果:5种胆汁酸类成分具有相似的ESI-MS/MS裂解特征；利用这些特征从清开灵注射液中快速鉴定了14个胆汁酸类成分；其中11个为8个厂家注射液共有成分,3个存在于个别厂家产品中.结论:利用HPLC-ESI-MS/MS技术可以从复杂物质体系中快速鉴定胆汁酸类成分,并为中药复方制剂的复杂物质基础阐明与质量标准提高提供了有效的方法.
关键词： 清开灵注射液 胆汁酸 液质联用 ESI-MS/MS裂解规律 快速鉴定 -
高压固相萃取-高效液相色谱-质谱法快速鉴定甘草酸单铵原料中的微量成分
目的:建立高压固相萃取-高效液相色谱-质谱法快速鉴定甘草酸单铵原料中微量成分的方法.方法:以高效液相制备色谱仪为辅助手段,通过条件优化,确定高压固相萃取的佳方法.以5C18-MS-Ⅱ色谱柱(20.0 mm× 20.0 mm)为萃取柱,进样0.5 mL,以35％乙腈-醋酸溶液(pH 2.2)为洗脱剂,在16 mL·min-1的洗脱流速下进行洗脱,萃取周期为4.5 min.所得萃取液在浓缩100倍后进行液相色谱-质谱(LC-MS)分析.结果:在优化的高压固相萃取-液相色谱-质谱条件下,快速鉴定出甘草酸单铵原料中的10种化学成分,其中采用多级质谱信息分析和文献对照推测出6种微量成分的化学结构,分别为3-O-[β-D-葡糖醛酸-β-D-葡糖醛酸]-30-O-β-D-芹菜糖甘草次酸/3-O-[β-D-葡糖醛酸-β-D-葡糖醛酸]-30-O-β-D-阿拉伯糖甘草次酸,甘草皂苷F3,18α-甘草皂苷G2,3-O-[β-D-鼠李糖]-24-羟基甘草酸,甘草皂苷J2,甘草皂苷B2；通过液相色谱、多级质谱和紫外光谱信息,与对照品对照,确证了甘草酸单铵原料中4种主要化学成分,分别为甘草皂苷G2,18β-甘草酸,乌拉尔甘草皂苷乙,18α-甘草酸.结论:该方法无需对照品即可快速有效地鉴定出甘草酸单铵原料中的化学成分,为甘草酸单铵相关产品的质量控制和安全应用提供了依据.
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基于12S序列的蛤蚧LAMP快速鉴定方法
蛤蚧为我国名贵动物中药材,为建立蛤蚧的LAMP可视化检测方法,实现其与混伪品的高效特异鉴别,该研究通过MEGA 6.0分析蛤蚧与其13种混伪品共65条12S rRNA序列,在线设计LAMP引物,并优化扩增条件,考察反应灵敏度,对蛤蚧及其混伪品进行鉴别验证.结果表明,基于12S rRNA序列的蛤蚧及其13种混伪品均可通过BLAST比对准确区分.蛤蚧12S rRNA序列较为保守,10批次30条序列在引物设计区仅含2条单倍型和3个变异位点,成功设计了6条LAMP特异引物.64℃反应1h,80℃灭活5 min,即可完成蛤蚧的可视化检测,低检测浓度为5μg·L-1,高于传统PCR 2个数量级.该方法特异性强、灵敏度高、检测方便、反应时间短,且闭管操作,避免了污染,可实现蛤蚧与混伪品的快速可视化鉴别.
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基质辅助激光解析离子-飞行时间质谱仪在临床分离革兰阴性杆菌鉴定中的应用
目的 了解基质辅助激光解析离子-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)在临床分离革兰阴性杆菌鉴定中的应用,为临床医师正确诊断提供科学依据.方法 采用 MALDI-TOF-MS技术对1625株临床常见革兰阴性杆菌进行鉴定.VITEK MS鉴定结果与VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定系统对比,结果差异的菌株采用16S rDNA测序验证.结果 VITEK MS共鉴定出常见革兰阴性杆菌1625株,肠杆菌科1219株共6种,非发酵菌属406株共4种.VITEK MS系统与VITEK-2 Compact系统鉴定结果比较,120株常见革兰阴性杆菌鉴定符合率为95.83%.5株鉴定结果不符菌株用16S rDNA测序验证,与VITEK-2 Compact 鉴定符合率为2/5(40%),与VITEK MS鉴定符合率为3/5(60%).结论 VITEK MS能快速鉴定出常见革兰阴性杆菌,为临床治疗及鉴别感染病原菌提供了快速的筛选方法.
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多重逆转录-聚合酶链反应对甲1与甲3型流行性感冒病毒神经氨酸酶亚型的快速鉴定
为建立流行性感冒(流感)病毒甲1、甲3型神经氨酸酶(NA)N1与N2亚型的快速鉴别方法,通过对大量NA基因序列的比较,分别在N1与N2亚型的保守区域设计特异性引物,采用多重逆转录-聚合酶链反应(MRT-PCR)进行NA基因扩增,并评价了其灵敏度和特异性.结果表明:MRT-PCR能特异性扩增甲1、甲3型流感病毒NA N1与N2亚型基因,灵敏度为0.1TCID50,可从临床患者含漱液中直接检测到N1、N2基因.MRT-PCR方法不仅可作为甲型流感病毒NA亚型的快速鉴定方法,而且可以作为人类甲型流感病毒基因快速诊断方法的补充,应用于流感爆发疫情的应急诊断.
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一种基于TIL的肿瘤相关抗原特异性T细胞的筛选方法
Wolfl 等[1]的研究建立了一种以 CD137为表面标记，从人 CD8+T 细胞中快速鉴定和分离抗原特异性 T 细胞的方法。由于 CD137分子表达于活化的 CD4+和 CD8+T 细胞表面[2]，其表达上调依赖于 T 细胞经抗原刺激后活化，并可在抗原刺激后12 h ~5 d 内持续表达[3]。因此可以CD137为标记，从 T 细胞中检测和分离比例较低的抗原特异性 T 细胞。
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应用高通量测序技术快速鉴定未分型甲型流感病毒
目的 利用Ion Torrent半导体二代测序技术开展禽类和外环境中禽流感病毒基因组测序和亚型的快速鉴定,建立快速鉴定未分型甲型流感病毒亚型的高通量测序方法.方法 提取9份禽类拭子和外环境标本中的病毒RNA,进行甲型流感病毒通用型、H5N1亚型、H7N9亚型和H9N2亚型荧光定量PCR检测;利用PathAmpFluA试剂盒对病毒RNA进行全基因组扩增,利用Next Fast DNA Fragmentation & Library Prep Set for Ion Torrent试剂盒进行文库制备,并在Ion torrent二代测序仪上完成测序;采用Ion Torrent Suite v3.0进行测序数据提取和质量评估,并且用FluAtyping v4.0和PathogenAnalyzer两个插件进行流感序列拼接和数据库比对,终确定9份禽流感标本的流感病毒亚型.结果 9份禽类拭子和外环境标本甲型流感病毒核酸阳性但常规监测的H5N1、H7N9和H9N2亚型均为阴性,经二代测序和生物信息学分析共鉴定出7种亚型:H2N3、H5N6、H5N8、H7N1、H7N7、H11N3亚型流感病毒阳性标本各1个,H6N6亚型流感病毒阳性标本3个.结论 浙江省外环境中禽流感病毒亚型众多,Ion torrent半导体测序技术适用于禽及外环境监测中发现的未分型甲型流感病毒亚型的快速鉴定.
