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儿童甲型H1N1流感和季节性流感患者的病毒载量及相关临床症状研究
目的 分析并比较儿童甲型H1N1流感和季节性流感患者咽拭子标本的病毒载量及相关临床症状.方法 应用荧光PCR方法对采集的咽拭子标本进行检测,并通过建立核酸标准品,绘制标准曲线,测定标本中的病毒载量,同时结合所收集的患者临床症状数据资料应用随机区组方差和卡方检验方法进行统计分析.结果 2009年9月至2010年9月期间收集的1,040份咽拭子标本中,共检出甲型H1N1流感病毒阳性标本120份,甲型H3N2流感病毒阳性标本61份,乙型流感病毒阳性标本99份；对收集的流感阳性标本病毒载量测定结果显示:不同型别,不同发病时间流感患者咽拭子标本的病毒载量差异无统计学意义(P＞0.05)；甲型H1N1流感、季节性流感感染者的性别比例差异无统计学意义,甲型H1N1流感感染者出现咳嗽,流涕临床症状者明显高于与乙型流感感染者.结论 甲型H1N1流感患者咳嗽,流涕症状比季节性乙型流感患者多见,而甲型H1N1流感和季节性流感患者咽拭子标本的病毒载量无显著性差异.
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乙型肝炎异常血清学诊断模式与HBV-DNA载量的相关性研究
目的探讨乙型肝炎异常血清学诊断模式与HBV-DNA的关系.方法对94例慢性HBV携带患者,根据血清学结果,把病例分A、B、C、D四组,分别采用化学发光法(CLIA)定量检测HBV标志物;采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测HBV-DNA载量.结果A组患者HBsAg和HBsAb同时阳性,HBV-DNA阳性率为96.9％ (31/32);B组患者HBeAg和HBeAb同时阳性,HBV-DNA阳性率为90.0％(18/20),两组间比较差异无统计学意义(x2=2.95,P＞0.05).C组患者HBsAg阴性而HBeAg阳性,HBV-DNA阳性率为64.3％(9/14),C组与A、B组比较差异有统计学意义(x2=32.56和23.41,P＜0.05).结论在受检患者各种异常模式中,均存在HBV-DNA不同程度的复制.HBeAg阳性和HBV-DNA检测结果呈正相关.
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2010年宁夏回族自治区中卫市哨点医院流感样病例监测分析
目的 分析2010年宁夏回族自治区中卫市流行性感冒(流感)发病情况.方法 从中卫市2家哨点医院临床发热病例采集到的咽拭子标本,利用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行流感病毒检测.结果 监测到甲型流感11例,乙型流感161例,H3流感71例.结论 中卫市流感的流行无地区差异,存在年龄差别,流感类型有季节性变化,流感的发病与生活习惯和方式密切相关.
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荧光定量PCR法与ELISA法检测乙肝病毒感染相关性的研究
目的采用荧光定量PCR法与ELISA法检测乙肝病毒标志物,探讨两种检测方法的相关性.方法对952份深圳服务行业从业人员体检乙肝表面抗原阳性的血清,应用HBV荧光定量PCR法和ELISA法检测并对结果进行分析.结果荧光定量PCR检测不同乙肝标志物分组阳性率存在一定的差异;E抗原阳性的HBV DNA阳性对数均值为6.49±1.29,表面抗原阳性而E抗原阴性的HBV DNA阳性对数均值为4.46±1.29,两者间差异具有显著性(P<0.01),而不同性别和籍贯间无明显差异.结论两种方法检测乙肝标志物有密切的相关性;对从业人员用ELISA法检测乙肝表面抗原阳性者应进一步进行荧光定量PCR检测.
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实时荧光定量-聚合酶链反应检测食品中金黄色葡萄球菌方法的研究
目的 利用实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR)技术,建立食品中金黄色葡萄球菌(金葡萄)污染的快速敏感特异的检测方法.方法 以金葡菌的FemB基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以金葡菌菌株提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比和Mg2+浓度,以金葡菌和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性.并初步应用于样品的检测.结果 本研究建立的反应体系在引物和探针的浓度为0.8 μmol/L、0.6 μmol/L,Mg2+浓度为3.5 mmol/L时,具有良好的特异性和敏感性.在10株相关菌株的检测中,除金葡菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性.在纯菌条件下,低检测限为44 cfu/ml.稳定性分析表明:同一样品重复检测3次Ct值的变异系数均<5%.检测样品结果显示real-time PCR方法较传统方法敏感、快捷、简便.结论 该方法特异性强,稳定性高,操作简便快捷,适应食品微生物检验发展需要,具有较大的推广及应用价值.
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应用磁免疫技术快速检测三种新发病原菌
目的 应用磁免疫分离技术(IMS)建立对3种新发病原菌(0139群霍乱弧菌、EHEC 0157:H7、单增李斯特菌)的快速检测方法.方法 将IMS分别与显色培养(chromogenic media,Ch)和荧光定量PCR技术结合,建立了IMS-Ch、IMS-PCR两种新方法,研究不同方法的灵敏性和特异性,并对高危样品的检测效果进行评价.结果 IMS-Ch法24 h能检出目标菌含量≥50 cfu/10 g的样品,IMS-PCR法用于检测EHEC 0157:H7和霍乱弧菌,9 h可达检出限为10～20 cfu/10 g,实际检测效果评价的尤等指数>95%.结论 IMS-PCR是一种可信的快速筛选方法,IMS-Ch法为较国标法灵敏、快速的确证方法.
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相对定量2-△△CT法分析Caspase-3和Caspase-9在氟诱导大鼠肾脏中的表达
目的 检测caspase-3和caspase-9基因在氟诱导大鼠肾脏组织中的表达.方法 48只雄性SD大鼠分为4组(对照组、低氟组、中氟组和高氟组),每组12只,分别加入不同浓度的氟化钠染毒(0、50、100和200 mg/L).120 d后,处死大鼠,提取各组大鼠肾组织总RNA,实时荧光定量PCR法检测各染氟组caspase-3、caspase-9基因的表达,选择β-actin作为内参基因,使用相对定量2-△△CT法分析.结果 对照组和3个染氟组(低、中和高氟组)caspase-3基因表达量分别是1.01 ±0.01、1.41 ±0.68、2.31 ±0.95和2.69±0.49,其中中氟组和高氟组表达显著增高(P＜0.05).caspase-9的基因表达量分别是1.01±0.01、1.30±0.26、2.63±0.56和3.97±0.60,中氟组和高氟组表达显著增高(P＜0.01).结论 氟诱导大鼠肾脏后caspase-3和caspase-9基因表达增高,为氟中毒发病机制的研究提供一定的理论依据.
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食品中副溶血弧菌FQ-PCR快速检测方法的研究
目的利用荧光定量PCR技术,研制适合各层次实验室使用的,快速、准确地检测鉴定食品中副溶血弧菌污染的定性、定量方法.方法根据副溶血弧菌gyrase基因序列,设计并合成特异性引物和荧光标记探针,将扩增后的特异片断制成阳性模板,绘制标准曲线.以副溶血弧菌菌株8株及同源、非同源参考菌株24株,做特异性检测;将阳性污染菌按梯度加入阴性样品为模拟样本,做敏感性检测.同时使用PE7000型定量PCR仪和国产DA620微量荧光检测仪检测.结果该方法有良好的特异性:8株副溶血弧菌结果均为阳性,而其它24株菌株均为阴性(其中8株是弧菌科,16株分别来自不同的菌属);该方法有良好的敏感性:阳性模板浓度与定量曲线循环阈值之间相关系数达到0.9871.在纯培养的条件下,其检测低限为10cfu/ml.对32个模拟样本直接进行定量检测,则检测低限在102cfu/g;经过24小时增菌培养,检测低限可达2cfu/g.结论该方法特异性强、敏感性高,操作简便快速,能避免常规PCR方法易污染的缺陷,在国产仪器上测试同样取得较好的敏感性和特异性,便于基层实验室使用,具有很好的推广应用前景.
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锌、铁、锰饱和乳铁蛋白体外抑制乙型肝炎病毒DNA的研究
目的 探讨锌、铁、锰饱和乳铁蛋白体外抑制乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)作用.方法 以天然HBV感染HeDG2细胞为模型,通过应用荧光定量PCR法测定细胞中HBV-DNA水平来检测锌、铁、锰饱和乳铁蛋白抑制HBV效果,并应用四甲基偶氛唑盐比色法(MTT)进行锌、铁、锰饱和乳铁蛋白对HepG2细胞的毒性研究.结果 锌、铁、锰饱和乳铁蛋白对细胞的大无毒剂量(TD0)分别为1.5、3.0和1.5g/L;用HBV感染HepG2细胞,分别加入锌、铁、锰饱和乳铁蛋白,各实验组对HBV-DNA均有显著抑制作用,浓度为1.5g/L的锌、铁、锰饱和乳铁蛋白抗HBV-DNA结果经对数转换后分别为:(5.746±0.114)、(6.446±0.103)和(5.999±0.725).结论 当HepG2细胞感染乙肝病毒后,锌、铁、锰饱和乳铁蛋白可以显著抑制HBV-DNA,抑制作用强弱依次为:锌饱和乳铁蛋白＞锰饱和乳铁蛋白＞铁饱和乳铁蛋白.
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荧光定量PCR仪检测HBV DNA结果比对分析
目的 探讨应用ABI 7500和Roche Light Cycler 480型荧光定量PCR仪器检测乙型肝炎病毒(HBV)结果,并进行对比分析,对结果进行评估.方法 随机选取医院的20例乙型肝炎患者作为研究对象,测定患者血浆中HBV DNA水平,根据临床实验室标准化委员会中对HBV的检测标准要求,将Roche Light Cycler 480作为参比仪器,将ABI 7500作为实验仪器,测定患者的HBV DNA水平,并比较两种不同仪器测定结果,并判断结果的可比性.结果 ABI 7500和Roche Light Cycler 480在HBV DNA检测中相关性良好,偏差在能接受范围之内.结论 ABI 7500和Roche Light Cycler 480在检测HBV DNA中具有较高一致性,能联合应用于HBV DNA检测.
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荧光定量PCR技术在诊断骨关节结核患者中的价值
目的 探索荧光定量PCR技术在骨关节结核患者诊断中的价值.方法 选取2015年1月至2015年9月在首都医科大学附属北京胸科医院骨科进行手术治疗的39例骨关节结核患者(病例组)和20例非骨关节结核患者(对照组)作为研究对象.收集研究对象的石蜡包埋组织标本,并对标本行结核分枝杆菌荧光定量PCR检测,计算荧光定量PCR检测的敏感度及特异度.通过病历查询研究对象的组织形态学及抗酸染色检测结果.比较荧光定量PCR技术与组织形态学及抗酸染色检测敏感度的差异.结果 病例组39例骨关节结核患者中,荧光定量PCR检测的敏感度为97.4％(38/39);病例组中8例组织形态学不能确诊的患者中,荧光定量PCR检测出7例阳性;对照组20例非骨关节结核患者中,荧光定量PCR检测的特异度为100.0％(20/20).病例组中,组织形态学检测的敏感度为79.5％(31/39),抗酸染色检测的敏感度为48.7％(19/39),均低于荧光定量PCR检测,差异有统计学意义(x2=25.39,P=0.000),荧光定量PCR检测敏感度高于组织形态学检测和抗酸染色检测(荧光定量PCR与组织形态学比较,x2=4.52,P=0.033;荧光定量PCR与抗酸染色比较,x2=23.52,P=0.000).对照组中,组织形态学检测的特异度为100.0％(20/20),抗酸染色检测的特异度为100.0％(20/20),与荧光定量PCR检测的特异度比较,差异无统计学意义(x2 =0.00,P=1.000).结论 荧光定量PCR技术较组织形态学及抗酸染色技术具有更高的敏感度,有助于骨关节结核的诊断.
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HBV核酸与HBV血清标志物的关系研究
[目的]探讨乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA)与HBV血清标志物的关系.[方法]将血清样本用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测HBV-DNA和乙型肝炎病毒标志物.[结果]A组(HBsAg和HBeAg两项阳性)、B组(大三阳)、C组(HBsAg、HBcAb两项阳性)和D组(小三阳)的HBV-DNA阳性率分别为97.06%、88.24%、57.14%和43.33%,HBV-DNA量的对数均值分别为6.0267、5.5667、4.9639、5.1520、5.4574,各组间HBV-DNA阳性率和HBV-DNA量均存在显著性差异(P＜0.05);178份HBV-DNA阳性标本中HBsAg 100.00%阳性;HBsAg阳性、HBeAg阳性和HBsAg阳性,HBeAg阴性组中HBV-DNA阳性率分别为89.34%和44.52%,存在显著性差异(P＜0.05).[结论]HBsAg和HBeAg两个阳性组病毒复制活跃,HBV-DNA阳性率和HBV-DNA量显著高于其它组别;HBeAg与HBV-DNA密切相关,但不能完全反映HBV在体内的复制情况,将FQ-PCR定量检测作为血清学方法的补充具有重要的临床意义.
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3种荧光定量聚合酶链反应试剂筛查入境人员中疑似肺结核病例的效果比较
目的 比较3种荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)试剂检测痰标本中结核杆菌的灵敏度和特异性,探讨FQ-PCR在国境口岸快速检测结核病人的价值.方法 对129例疑似肺结核患者的痰标本分别采用FQ-PCR试剂法、痰涂片抗酸染色法、改良罗氏培养法检测结核分枝杆菌;以培养法为金标准比较艾康、匹基和博奥3种FQ-PCR试剂的特异性和灵敏度.结果 艾康检测疑似肺结核病病例、涂片镜检阳性和涂片镜检阴性者的灵敏度为90.12％、93.55％、78.95％,特异度为95.65％、100％、95.65％;匹基检测疑似肺结核病病例、涂片镜检阳性和涂片镜检阴性者的灵敏度为87.50％、95.16％、61.11％,特异度为100％、100％、100％;博奥检测疑似肺结核病病例、涂片镜检阳性和涂片镜检阴性者的灵敏度为86.59％、95.24％、57.89％,特异度为100％、100％、100％.结论 FQ-PCR是一种简便快速方法,对于涂片镜检阳性结核病病例的检测具有很高的敏感性和特异性,对于涂片镜检阴性结核病病例检测有很高的特异性,适于国境口岸出入境人员中结核病病例的快速检测.
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两种结核分枝杆菌快速检测方法的比较
目的 比较荧光定量PCR检测和直接扩增检测两种方法对结核分枝杆菌检测的敏感性、特异性,及在国境口岸卫生检疫工作中的应用前景.方法应用结核分枝杆菌荧光定量PCR和直接扩增检测47份疑似或确诊活动性肺结核空腹痰标本,并与液体培养结果进行比较.结果荧光定量PCR法与直接扩增法对结核分枝杆菌检测敏感性分别为46.7％和100％,特异性分别为81.2％和84.4％.结论结核分枝杆菌直接扩增检测是一种较为敏感而特异的快速检测方法,在国境口岸卫生检疫部门具有重要的应用价值.
关键词： 结核分枝杆菌 液体培养 荧光定量PCR 结核分枝杆菌直接扩增检测 -
2009年深圳口岸流感疫情监测结果分析
目的 分析深圳口岸2009年流感监测结果,了解口岸这一特定人群流感流行特征.方法 选择监测期内由深圳罗湖口岸、福田口岸、深圳湾口岸3个传染病监测口岸工作部采集入境有流感样症状的发热旅客鼻咽拭子样本,提取病毒RNA,采用实时荧光定量PCR法进行检测;同时进行流行病学个案调查.结果 共采集鼻咽拭子样本2166份,其中497例阳性,总阳性率为22.95％.甲型H1N1流感阳性264例(占53.12％),季节性甲型流感阳性220例(占44.27％),季节性乙型流感阳性13例(占2.62％).男性样本1 590份,阳性339例(阳性率21.32％);女性样本576份,阳性158例(阳性率27.43％).10～19岁年龄组甲型流感病毒阳性率高,为21.91％.2009年7、8月流感阳性率高,阳性率分别为46.70％,41.44％;其次为2009年1、2月,阳性率分别为19.61％、21.70％.结论 深圳口岸存在甲型H1N1、季节性甲型和乙型3种流感流行,以甲型H1N1和季节性甲型流感病毒为优势流行毒株;青少年易于感染甲型流感.
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荧光定量PCR快速检测食品中肠出血性大肠杆菌O104
目的 建立针对肠出血性大肠杆菌O104的荧光定量PCR快速检测方法.方法 针对O104的wzx保守基因,设计特异性引物和探针,采用倍比梯度稀释法检测该体系的灵敏度,以另外34株肠道致病菌评价检测方法的特异性;建立了肠出血性大肠杆菌O104感染食品的检测模型以验证方法的适用性.结果 建立了荧光定量PCR快速检测肠出血性大肠杆菌O104的方法.每次检测低限为12.0 copies,特异性为100％.结论 该法缩短了检测时间,并有良好的灵敏性和特异性,在疾病防控及食品卫生行业中具有应用前景.
关键词： 肠出血性大肠杆菌O104 荧光定量PCR 检测 食品 -
裂谷热病毒荧光定量PCR检测方法的建立
[目的]建立一种快速、敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,用于裂谷热病毒的检测.[方法]通过序列对比在裂谷热病毒L基因保守区设计引物及Taqman探针,建立实时荧光定量PCR反应体系.[结果]经优化的荧光定量PCR方法有较好的灵敏度和特异性,对阳性对照质粒标准品的灵敏度可达37拷贝/μl,通过检测同为蚊媒传播的日本脑炎病毒、黄热病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒无交叉反应.[结论]本方法的建立在国境口岸传染病的防控方面有较好的应用前景.
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复合探针荧光定量PCR法检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究
目的 建立用复合探针荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌的方法.方法 研究根据鼠疫耶尔森氏菌pla基因的核苷酸序列设计特异引物,通过PCR法的特异性、灵敏度和重复性研究,建立了复合探针荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法,用于鼠疫的筛选和诊断.结果 该检测方法的特异性为100％,低可检出10个拷贝的质粒DNA分子,可对1×101～1×106拷贝范围内的模板进行定量,低可检测至1×102 cfu/ml细菌.该方法的精密度好,阳性质控品和阴性质控品不同时间测定3次及同一时间5次重复实验结果Cv值均＜5％.结论 本研究建立的复合探针实时荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法,可对鼠疫耶尔森氏菌进行快速检测、准确辨别和早期诊断,对鼠疫的早期快速诊断具有重要意义.
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2009-2010年黑龙江中俄边境口岸鼠类动物中汉坦病毒分子流行情况调查及分析
[目的]研究黑龙江省中俄边境6个口岸鼠类动物的种类和携带汉坦病毒情况及病毒基因分型,为口岸防控肾综合症出血热提供科学依据.[方法]采用夹夜法和鼠笼法捕获鼠类,荧光定量PCR(TaqMsn探针法)对鼠肺标本进行检测.[结果]此次调查共捕获鼠类动物295只,经鉴定隶属3科8属10种,其中黑线姬鼠为优势种群,占42.37％.检测出汉坦病毒核酸阳性鼠肺标本22份,鼠总带毒率为7.46％,其中,汉滩型15份,汉城型共7份.在调查的6个口岸中逊克、抚远、黑河、东宁和绥芬河5个口岸发现了汉坦病毒核酸阳性标本.[结论]本次共调查黑龙江省中俄边境6个口岸,其中有5个口岸发现了汉坦病毒核酸阳性标本,北部边境逊克、抚远和黑河3个口岸均发现了汉坦病毒核酸阳性标本,东部边境东宁、绥芬河、牡丹江3个口岸中东宁和绥芬河发现了汉坦病毒核酸阳性标本,黑龙江省口岸肾综合症出血热防控形势依然严峻.
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结核分枝杆菌通用检测方法的建立及应用
目的 建立一种快速检测结核分枝杆菌的方法,并探讨其临床应用价值.方法 以结核分枝杆菌细胞色素氧化酶(CYP141)基因为靶点设计多对引物和探针,用BLAST软件分析其特异性,优化PCR反应条件,用国家标准品(阴性参考品15份、阳性参考品15份、低检出量参考品4份及重复参考品10份)和124份经培养鉴定的临床样本(结核分枝杆菌阳件75份)验证方法的可靠性和临床应用价值.结果 国家阴性和阳性参考品的符合率均为100％,低检出量参考品为不高于1×102 cfu/ml;10份重复参考品均呈阳性,对临床样本检测的灵敏性和特异性分别为96.00％、97.96％,总符合率为96.77％,一致性好(Kappa值=0.933;x2=104.21,P＜ 0.001).结论 建立了结核分枝杆菌通用型核酸检测方法,适用于卫生检疫系统和临床实验室应用.
