首页 > 文献资料
-
结核分枝杆菌核酸检测试剂生产质量控制与临床研究概述
Mtb核酸扩增检测技术泛指以扩增DNA或RNA为手段,从而检测特定Mtb核酸序列或筛查特定Mtb基因的检测技术,常用检测技术有:PCR、连接酶链反应(ligase chain reaction,LCR)、转录依赖的扩增反应(transcription mediated amplification,TMA)等.笔者主要针对Mtb核酸扩增法检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制及临床研究的技术要求进行概述,为Mtb核酸扩增法检测试剂的研制提供参考.
-
分子生物学技术在诊断细胞学中的应用
自人类开始重组DNA实验25年后的今天,分子生物学技术已经成为一种定量的分子诊断(molecular diagnostics)手段,并在不断影响着传统的诊断技术.一般认为,常用的分子生物学技术包括核酸杂交分析和各种基因扩增方法,但不包括免疫细胞化学法.目前临床常用的技术有Southem印迹杂交、多聚酶链反应(PCR)及其扩增产物的电泳分析、原位杂交和荧光原位杂交(FISH)等;其他较新的分子生物学技术,如生物芯片和核酸扩增的原位检测,亦将很快用于细胞学的研究和诊断[1,2].传统的肿瘤细胞学诊断方法是根据经验来判断是否为恶性细胞,缺乏客观指标;而分子生物学技术具有高度的特异性和敏感性,是细胞学诊断的重要手段.
-
LAMP技术及其在病原基因诊断中的应用
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种独特的核酸扩增技术,与PCR有所不同.本文从原理、反应环境、结果判读、优缺点、影响因素、应用范围及发展前景上对其进行了概述.
-
核酸扩增技术在淋球菌检测中的研究进展
淋病是一种性传播疾病,其病原体是淋球菌.淋球菌主要寄生于人体尿道粘膜,导致人类泌尿生殖系感染.及时、准确地诊断淋球菌感染是控制淋病传播的关键,核酸扩增检测技术对淋球菌的临床确诊及治疗有重大意义.本文综述了核酸扩增技术在淋球菌检测中的应用进展.
-
环介导等温扩增技术在临床检测中的优势与展望
环介导等温扩增技术(LAMP)因其在众多核酸扩增技术中具有灵敏、特异、操作简单等优势,被众多研究者用来扩增各种病原体.本文综述了LAMP技术在临床检测方面的显著优势、几点不足和相应建议,后对该技术的未来发展进行展望,旨在为该技术在疫区现场和基层医疗机构的推广应用进一步扩宽研究思路.
关键词: 环介导等温扩增(LAMP) 核酸扩增 快速检测 -
联合检测技术用于结核病及耐多药结核病快速诊断的研究
目的 探讨多技术联合检测用于结核病及耐多药结核病快速诊断的临床价值. 方法 应用浓缩涂片法、结核分枝杆菌DNA荧光定量法(TB-DNA)和结核分枝杆菌RNA恒温扩增检测(SAT TB-RNA)组成的结核快速诊断技术(简称快速法)及线性探针结核分枝杆菌耐药快速检测系统(Hain Geno-Type MTBDRplus,简称HAIN)对1 180例结核病患者和1 120例非结核病对照者分别进行检测,同步进行BACTEC MGIT-960培养、鉴定及药敏试验,比较各方法的敏感性和特异性及结核病、耐多药结核病检出率. 结果 以BACTEC MGIT-960培养鉴定结果为金标准,快速法的敏感度为97.84%(543/555),特异度为96.16%(601/625),符合率为96.95%(1 144/1 180);2种方法的结核病检出率比较差异无统计学意义(x2=0.245,P>0.05);以BACTEC MGIT-960药敏试验为金标准,HAIN检出耐多药结核病的敏感度为93.62%(44/47),特异度为99.41%(508/511),符合率为99.46%(552/555);2种方法的耐多药结核病检出率比较差异无统计学意义(x2 =0.102,P>0.05).快速法结果报告时间缩短为1d,HA1N报告时间为2d. 结论 多技术联合检测对快速诊断结核病及耐多药结核病的敏感性和特异性都有明显的优势,显著缩短了检测时间,具有快速准确的诊断价值.
-
Xpert Mtb/RIF全自动核酸扩增技术在结核病应急诊断中的应用
目的 评价半巢式结核分枝杆菌/利福平全自动实时荧光定量核酸扩增技术(Xpert MTB/RIF)用于结核病应急诊断的临床价值. 方法 采集汕头市2015年1-12月疑似结核病突发公共卫生事件现场、口岸、急诊科、重症观察室的915例患者标本,应用涂片荧光染色法、BACTEC MGIT-960液体培养法、结核分枝杆菌DNA荧光定量法(TB-DNA)、Xpert MTB/RIF技术分别进行检测,并将Xpert MTB/RIF利福平耐药结果与BACTEC MGIT 960药敏试验相比较. 结果 915例患者中437例为活动性结核病患者,478例为非结核患者,Xpert MTB/RIF法的敏感性为51.72%(226/437),特异性为100%(478/478),Xpert MTB/RIF法的阳性检出率与涂片荧光染色法检测结果比较差异有统计学意义(x2 =55.91,P<0.01),与BACTEC MGIT-960液体培养法、TB-DNA结果比较差异有统计学意义(x2值分别为3.85和4.40,P<0.05);以BACTEC MGIT-960液体培养药敏试验为金标准,Xpert MTB/RIF检测利福平耐药的敏感度为92.31%(24/26),特异度为99.41%(168/169),二种方法具有良好的一致性(Kappa值为0.93). 结论 XpertMTB/RIF法灵敏度和特异性高,操作简便、快速且易于开展,能在2h内报告结核分枝杆菌及利福平耐药结果,对结核病的应急诊断具有较高的应用价值.
关键词: 分枝杆菌 结核 核酸扩增 Xpert MTB/RIF 液体培养 诊断 耐药 发光二极管(LED)显微镜镜检 -
Xpert MTB/RIF检测痰标本中结核分枝杆菌的方法学研究
目的 探讨Xpert MTB/RIF检测痰标本中结核分枝杆菌(MTB)的佳实验条件并进行方法学评价. 方法 应用Xpert MTB/RIF检测MBT标准株H37Rv、H37Ra和牛分枝杆菌及20种常见非结核分枝杆菌(NTM)、18种非分枝杆菌病原体和临床分离株,分析Xpert MTB/RIF的敏感性、特异性和重复性,比较不同前处理方法对实验结果的影响,针对仪器出现的报警、错误及无效结果进行相应的处置和总结. 结果 MTB标准菌株H37Rv、H37Ra和牛分枝杆菌Xpert MTB/RIF检测阳性,敏感度为1×102 CFU/ml(在痰标本中的检测极限为106 CFU/ml);20种常见NTM和18种非分枝杆菌病原体检测阴性;标本中含有1%浓度的红细胞、白细胞、血清未对103/ml的H37Rv产生干扰作用;重复试验表明本法批间、批内变异系数均小于15%.100株MTB(其中50株Hain线性探针试验确认存在rpoB基因突变)和20株NTM临床分离株加入阴性临床痰标本制备成为含菌浓度为2×102条/ml的模拟痰标本经Xpert MTB/RIF检测均相符.在SR处理液加入半胱氨酸的改良直接法前处理痰液Xpert MTB/RIF检测出现“错误+无效”的比例显著低于沉淀处理法和直接法前处理的痰标本(x2值分别为4.19和6.74,P<0.01). 结论 Xpert MTB/RIF灵敏、特异、快速、简便,可用于MTB和利福平耐药MTB的快速检测,但仍存在错误和无效检测而影响实验结果,应采取有效措施予以避免.
-
血站核酸筛查混样和拆分单检室内质控方法的建立和评价
目的:建立核酸检测技术(NAT)用于血液筛查的室内质量控制(QC)方法.方法:将浓度为60 IU/mlHBV-DNA质控标准品,以6个混样常规筛查浓度稀释至10.0 IU/ml,接近检测下限的2倍.如出现混样结果阳性,则需进行拆分单检,以同管HBV-DNA质控品(浓度为60 IU/ml)作为拆分单检质控品,与需拆分样品同时单检.分别通过平行检测各20份同一批次质控品的方式,所得结果用即刻法分析其核酸扩增循环数,计算Ct值的均值(x)、标准差(SD)和变异常数(CV),以-x±2SD为警告限,超过-x±3SD为失控限,输入Excel后绘制Levey-Jennings质控图,并以此分别建立核酸筛查混样和拆分单检室内质控图框架.结果:混样和拆分单检连续20次检测结果,其-x±2SD分别为33.03±1.47和30.08±0.98;-x±3SD分别为33.03±2.20和30.08±1.47;CV分别为2.22%和1.63%.t检验计算其P值分别为0.08和0.17.在此质控标准下,在同等条件下混样检测60份、拆分单检13份质控品,检测结果为混样检测59次结果在控,1次失控;拆分单检13次全部在控.阴阳性对照物结果均符合实验要求,结果有效.结论:核酸筛查时混样检测和拆分单检采用不同浓度的质控品,混样时以接近试剂检测限的弱阳性血清作为核酸筛查的质控品,拆分单检时的浓度是混样检测浓度的6倍.此质控方法可保证检测核酸提取和扩增的有效性,提高实验结果的稳定性.
-
Blast-病毒物种鉴定的新方法
采集自愿献血员中56份HCV-Ab阳性血样,常规分离血清,应用RT-nPCR对HGV-NS3区进行核酸扩增,PCR扩增产物与PMD18-T载体连接,转染DH5d工程菌株,挑选白色菌落,经内套PCR验证克隆阳性者,以碱裂解法提取质粒DNA,应用荧光染料Big Dye标记、Sanger双脱氧末端终止法进行重组DNA的核酸序列测定.将测得的核酸序列,经国际互联网络输入到NCBI的GenBank数据库的局部序列相似形查询(Blast)的查询框中,借助于GenBank数据库中的资料和计算机分析程序中的BlastN软件,与数据库中所有已知的核酸序列进行序列同源性比对搜索分析.
-
生殖器都柏林念珠菌分离与PCR-RFLP鉴定
都柏林念珠菌是1995年采用现代分子生物学方法鉴定的念珠菌属的一个新种.近年来,都柏林念珠菌等非白念珠菌引起的深部感染比例逐渐增长,对氟康唑很容易产生不可逆的耐药性.因此都柏林念珠菌的分离与鉴定引起了国内外学者的高度重视.目前,45℃温度试验筛查都柏林念珠菌操作简便,已得到国内外学术界的广泛认可和采用.都柏林念珠菌DNA经限制性内切酶消化后,可产生独特的RFLP图谱,但单纯RFLP图谱结果模糊.为此,用PCR方法对核糖体DNA内部转录间隔区的编码基因进行核酸扩增,然后分析限制性酶酶切图谱,鉴定都柏林念珠菌,并对都柏林念珠菌在天津的流行情况作了分析.
-
拉米夫定疗程中YMDD变异前后血清IL-12和TH1/TH2型细胞因子变化及意义
拉米夫定疗程中出现HBV变异的慢性乙型肝炎患者20例,HBV DNA阳性,治疗前HBeAg均阳性,给予拉米夫定100mg/d,分别检测治疗前、治疗3个月、治疗6个月、治疗9个月、治疗12个月等5个时相点血清HBV DNA水平,在HBV DNA转阴的基础条件下,如果某时相点出现了HBV DNA反跳,则认为在该时相点发生了YMDD变异.健康献血员作血清细胞因子水平健康对照.采用ELISA法检测5个时相点及健康献血员血清IL-12、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平,检测结果以pg/ml为单位.计算与健康对照校对后的IFN-γ/IL-4比值作为TH平衡指标(健康对照为1).核酸扩增荧光检测乙型肝炎病毒YMDD突变型.t检验进行统计分析.
-
人乳头瘤病毒基因检测方法的初步比较及基因亚型分析
宫颈癌的筛查方法从分子水平检测通常采用多重核酸扩增荧光检测技术(FQ-PCR)和第二代杂交捕获技术(HC-Ⅱ)以及PCR结合反向寡核苷酸探针点杂交技术(PCR/RDB).FQ-PCR实验方法简单,其优点是易于操作,且全部实验均在一个密闭反应体系中完成,能有效避免交叉污染造成的假阳性;而HC-Ⅱ实验方法相对繁琐,其缺点是开放式的操作过程容易交叉污染造成假阳性,且试剂成本较高.但HC-Ⅱ的实验方法比FQ-PCR要早若干年应用于临床,现今仍在广泛应用,并在指导临床宫颈痛早防早治领域有不俗的表现.而FQ-PCR是近一两年来才应用于临床的实验方法,其对人乳头瘤病毒(HPV)检测的灵敏度和特异性如何,目前尚未见报道.
-
等温核酸扩增技术检测KPC耐药方法的建立及初步评价
碳青霉烯类抗生素是治疗重症感染有效的抗生素之一。近10年来,对碳青霉烯类抗生素耐药的细菌在世界各地的不断暴发威胁着人类的生命健康。产碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制,其中报道较多的是肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶( Klebsiella pneumoniae carbapenema-ses,KPC)。而且携带KPC的细菌感染与高死亡率呈正相关。因此及时、准确、快速地检出产KPC酶细菌对预防、控制耐药菌株流行具有重要意义。碳青霉烯酶表型检测方法均较费时;PCR扩增是常见的分子生物学检测方法,检测时间大大缩短,但对模板DNA质量、仪器设备和场所要求较高。等温核酸扩增技术( nucleic acid sequence-based amplifica-tion,NASBA)具有快速、灵敏、特异的优点。本研究以RNA为靶序列,建立了 NASBA 快速检测细菌KPC耐药的方法。
-
简便敏感的环介导等温扩增基因诊断新技术
核酸扩增是基因诊断技术中常用的方法之一,目前核酸扩增的方法很多,如聚合酶链反应(PCR)、依赖核酸序列扩增(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)、自主序列复制(self-sustained sequence replication ,3SR)以及链置换技术(strand displacement amplification, SDA).
-
RNA病毒扩增检测的质控品和标准品研究进展
RNA病毒如丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)等的核酸检测对于感染的早期诊断和抗病毒治疗疗效的动态观察具有重要价值.自1983年发明聚合酶链反应(PCR)技术以来,出现了基因扩增的概念.目前多采用核酸扩增技术(NAT)检测病毒RNA,常用的是逆转录(RT)-PCR方法.核酸扩增检测想得到可靠的结果,必须使用质控品进行严格的质量控制,而对病毒进行定量测定,通常还须有病毒RNA标准品.目前RNA病毒扩增检测的质控品和标准品分为两大类,一是裸露的RNA片段,二是内含特定RNA的病毒样颗粒或称之为带盔甲的RNA(armored RNA).
-
结核病的诊断与误诊
结核病的诊断有两个世界.在一个世界,痰涂片镜检是唯一可用的方法.通常在病人支付的起的情况下,可能还有一些放射性的方法.在另一个世界,有所有可用的现代化技术,包括痰培养、核酸扩增、分子诊断和一些尖端的放射性技术,如计算机断层扫描和正电子发射断层扫描.在这两个世界,结核病的诊断或误诊有很大的不同.本文概述了结核病的临床、影像学、分子生物学和免疫学诊断,并着重介绍结核病诊断常见的困难和缺陷.
-
培养和PCR对抗生素预治疗的社区获得性肺炎患儿的病原学诊断
社区获得性肺炎(CAP)是世界范围内危害儿童的常见的一种感染性疾病.由于难以获得合适的标本,儿科通过常规细菌培养的方式进行CAP的病原学诊断一直是个挑战,而且CAP的住院病人在住院前普遍都有使用抗生素的历史,这将影响常规细菌培养的结果.一些研究表明使用体外核酸扩增的方法可以迅速检测和确定细菌病原体.其临床价值值得探讨.
-
原料血浆病原体核酸检测技术应用的现状与思考
病原体核酸扩增检测技术泛指以扩增DNA或RNA为手段达到筛查病原体目的的检测技术,如聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)、依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)、转录介导的扩增系统(Transcript-mediated amplification ,TMA)等.现有资料表明,采用核酸检测技术可以明显缩短血浆感染病毒阳转前的潜伏期(窗口期)的检出期限,降低血源性病毒的传播危险.目前,核酸检测技术已经在欧美国家广泛用于血液和原料血浆的病原体筛查.我国血液制品技术管理部门从2002年开始,先后进行了原料血浆核酸检测的方法学研究和超过4万份取自不同地区样本的病原体筛查,并根据国家食品药品监管机构的要求拟定了相关技术文件;同时,国内已有部分血液制品生产企业开始采用核酸检测技术进行原料血浆的病原体筛查.
-
环介导等温核酸扩增检测缓冲液成分的探索
目的 探索环介导等温扩增(LAMP)检测反应体系缓冲液,为我国野战/灾害等紧急输血的血液筛查提供技术支持.方法 通过对LAMP体系不同组分的梯度分析对检测结果的影响进行研究.结果 扩增效率随着反应体系内Mg2+浓度的增高而降低;LAMP反应的扩增效率随着反应体系内Betain浓度的增高而增高.随着Calcein浓度的降低,LAMP反应体系内的绿色荧光逐渐减弱.结论 建立的反应体系具有较好的反应灵敏度及特异性,与成品化的试剂相似,可适用于临床血液病原体筛查.