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Ⅱ型成簇恒间隔短回文序列及相关蛋白系统(CRISPR/Cas)研究近况
1987年在大肠杆菌K12的碱性磷酸酶( iap)基因的3′侧翼区首先发现了一类具有短回文特质的DNA重复序列[1]。2002年,这类结构被正式命名为成簇恒间隔短回文重复序列(CRISPR),CRISPR关联蛋白也同时得以命名[2]。2005年,3个研究课题组同时发现间隔序列可能源自于细菌染色体外的其他遗传物质,如噬菌体和接合质粒,并推论CRISPR/Cas系统可以抵制入侵的外源 DNA[3-5]。2007年,来源于侵染噬菌体的新的整合间隔序列得到实验验证;研究同时建立了新获得的间隔序列与细菌抵抗该噬菌体侵袭的直接关联关系,证明了CRISPR/Cas系统是抵抗噬菌体的获得性免疫系统[6]。 Marraffini和Sontheimer[7]证实CRISPR/Cas系统对于接合现象和质粒转化的干扰作用。近基于CRISPR/Cas作用机制的研究,发现了其在细菌毒力、致病性以及如何逃避宿主免疫系统等方面的相关作用[8]。
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携带幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白活减毒鼠伤寒沙门菌口服重组DNA疫苗株的构建
目的:构建携带人幽门螺杆菌(Hpylori)中性粒细胞激活蛋白HP-NAP)基因(napA)的重组活减毒鼠伤寒沙门菌口服DNA疫苗.方法:应用基因工程技术扩增全长napA,测序并同源性分析后,将其亚克隆入真核表达载体pIRES,鉴定正确后将重组质粒转化活减毒鼠伤寒沙门菌.结果:重组质粒经PCR及双酶切,证实成功构建了携带HP-NAP基因的重组真核表达质粒pIRES-napA,后者成功转化活减毒鼠伤寒沙门菌SL7207.所克隆435bp napA与GenBank中SS1-napA核苷酸和蛋白质的同源性均为98%.结论:成功构建并鉴定了携带HP-NAP基因的重组活减毒鼠伤寒沙门菌口服DNA疫苗,为多价抗Hpylori口服DNA疫苗的研制奠定了基础.
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野生型大鼠Rab5a基因表达载体pcDNA3-Rab5(a)WT的转化扩增及鉴定
目的 对含野生型大鼠Rab5a基因载体pcDNA3-Rab5 (a) WT进行体外转化、扩增及鉴定,为基于Rah5a的相关研究提供高纯度、高丰度的表达载体.方法 取pcDNA3-Rab5 (a) WT质粒转化DH 5α感受态菌,再接种到含氨苄青霉素的LB琼脂培养板进行抗性筛选,对挑取的阳性克隆进行LB液体培养基培养后抽提质粒,用超微量核酸蛋白测定仪测定提取质粒的纯度和浓度,并取样进行琼脂糖凝胶电泳及PCR鉴定.结果 经转化后获得了大量抗氨苄青霉素的阳性克隆菌落,挑取阳性克隆并经培养后提取的pcDNA3-Rab5 (a) WT质粒均为浓度高、纯度高、超螺旋结构为主的质粒.pcDNA3-Rab5(a)WT经PCR后得到Rab5a基因.结论 成功转化并扩增了pcDNA3-Rab5 (a) WT,为Rab5的相关研究提供了高质量的表达载体.
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超广谱β-内酰胺类抗生素的耐药性与耐药质粒介导
目的:观察超广谱β-内酰胺类抗生素的敏感性与耐药质粒的关系,探讨耐药质粒在细菌之间传递的方式.方法:(1)配制耐药质粒提取试剂;(2)对LB细菌培养液进行耐药质粒的提取与检测;(3)对从12株ESBL细菌中提取的质粒进行质粒转化、质粒接合传递及药敏试验.结果:(1)此12株ESBL细菌中提取的耐药质粒进行电泳显示此质粒较大,约20.0 kb.(2)质粒转化后,其转化子对β-内酰胺类抗生素全部耐药,对氨基糖甙类、喹诺酮类和磺胺类全部敏感.质粒结合传递体的耐药谱与以上相同.结论:β-内酰胺类抗生素的敏感性与耐药质粒介导密切相关,耐药质粒能把耐药基因传递给其他细菌,在细菌之间相互传递.
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沙眼衣原体E型MOMP基因原核表达载体的构建和纯化
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)共有19个血清型,其中D~K血清型则可通过性传播,引起人类泌尿生殖道感染,并可引起并发症.沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)携带Ct亚型等多种抗原决定簇,是诊断试剂和疫苗开发的基础.本研究选择MOMP基因作为研究对象,用PCR技术扩增E型沙眼衣原体MOMP基因片段,再将其定位插入到原核表达载体pGEX中,构建重组表达质粒.然后将重组表达质粒转化人大肠杆菌(BL-21)中,并用酶切分析、PCR扩增及部分序列测定等方法对重组质粒进行鉴定.诱导表达,用SDS-PAGE及蛋白印迹进行鉴定,并以亲和层析柱纯化表达产物,为进一步研究该蛋白的生物学特性,了解衣原体的致病机制奠定基础.
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生物代谢基因调控在抗生素生物合成中的应用
抗生素的生物合成是以原核或低级真核生物复杂的次级代谢过程为基础的,次级代谢过程能产生数量丰富、结构复杂的各类代谢物作为具有应用价值的抗菌药物.次级代谢产物的合成与某种遗传物质或基因及其决定的酶密切相关.所以,深入阐明代谢过程及调控基因(靶基因)并对相关基因进行体外重组并高效表达,必将提高药物生物合成的效率.近年来,国外开展了用带关键酶基因的质粒转化菌种,增加菌种中关键酶基因浓度和转录水平以及抑制菌种非必要基因的表达,简化后处理工序,提高产量等代谢基因调控的研究和实践,并取得了一定成果.
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普氏立克次体120 kDa表面抗原N端和C端基因的克隆与表达
采用PCR方法,从普氏立克次体基因组中扩增出120kDa表面抗原的N端和C端基因片断,并将其克隆于原核表达载体pQE30,构建重组质粒pQE30/N和pQE30/C,将重组质粒转入大肠杆菌M1 5,用IPTG诱导大肠杆菌内的目的基因表达.SDS-PAGE分析发现两重组质粒转化菌分别产生了一26kDa(N端)和67kDa(C端)重组蛋白;在免疫印迹分析中,26kDa和67kDa重组蛋白均与普氏立克次体免疫血清发生特异反应,证明27kDa和67kDa重组蛋白分别为120kDa表面抗原的N端和C端重组蛋白,具有普氏立克次体120kDa表面抗原特性.
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表达胞壁结合型贝氏柯克斯体27kDa外膜蛋白的重组卡介苗构建
构建能够表达胞壁结合型贝氏柯克斯体27kDa外膜蛋白的重组卡介苗.用PCR技术从卡介苗(BCG)基因组扩增分支杆菌19kDa抗原的细胞壁结合区基因和从贝氏柯克斯体基因组扩增27kDa外膜蛋白基因,将它们分别插入大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒(pSMT3)的XbaⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/HindⅢ位点.将重组的穿梭质粒转化大肠杆菌和从大肠杆菌提取重组穿梭质粒转化卡介苗.从含潮霉素的培养基筛选到具有该抗生素抗性重组卡介苗菌落,用免疫印迹分析重组质粒转化的卡介苗,发现一约27kD的蛋白带与贝氏柯克斯体27kD重组蛋白免疫兔血清特异反应,用27kD重组蛋白免疫兔血清做间接免疫荧光检测重组卡介苗,结果为阳性.重组卡介苗能表达贝氏柯克斯体27kDa外膜蛋白,表达的27kDa外膜蛋白存在卡介苗菌体表面,卡介苗菌体表面的27kD抗原可能有效地诱导特异性的抗Q热免疫应答.
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小鼠PPARδ基因表达载体pCMV-PPARδ的转化扩增
取含鼠过氧化物酶体增殖物激活受体δ(mPPARδ)基因载体pCMV-PPARδ质粒转化DH5α感受态菌,再接种到含卡那霉素的LB琼脂培养板进行抗性筛选,对挑取的阳性克隆进行LB液体培养基培养.结果 转化的DH5α菌在含卡那霉素的琼脂平板上呈克隆样生长,经LB液体培养基培养后提取的pCMV-PPARδ质粒其A260/A280=1.88,浓度为560 ng/μl.提示本研究成功转化并扩增了pCMV-PPARδ质粒,为PPARδ的相关研究提供了高纯度、高浓度的表达载体.
关键词: 过氧化物酶体增殖物激活受体δ 质粒转化 质粒扩增 DH5α感受态细胞 -
钩体内鞭毛蛋白基因重组质粒的构建、表达和免疫保护性研究
对钩端螺旋体病的有效预防亟需广谱、高效、安全、价廉的疫苗.为了获得重组表达的钩体内鞭毛亚单位蛋白抗原,以探讨制备新疫苗的途径,我们设计一对引物(P1=5'-GCC GTC GAC ATG ATT ATC AAT-3',P2=5'-GGC TAG CTA TTA GAT ATG CTG CAG-3'),以赖型017株钩体DNA为模板,利用PCR扩增其编码基因完整的开放阅读框架,扩增产物经Sal I、Cla I双酶切消化后定向克隆于pT7-7载体上,构建原核表达重组质粒pLF2.将该质粒转化入大肠杆菌JM109(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示此产物相对分子量为34 kd.
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含小鼠PPRE反应元件报告质粒的转化扩增
目的 对含小鼠过氧化物酶体增殖物反应元件(PPRE)报告质粒p4×PPRE-luc进行体外转化和扩增,为基于PPAR为靶标的药物筛选分子平台的建立提供高纯度、高丰度的报告载体.方法 取p4×PPRE-luc质粒转化DH5α感受态菌,再接种到含氨苄青霉素的LB琼脂培养板进行抗性筛选培养,挑取阳性克隆菌落进行培养后抽提质粒,紫外分光光度计测定提取质粒的纯度和浓度,并取样进行琼脂糖凝胶电泳验证.结果 经转化后获得了抗氨苄青霉素的阳性克隆菌落,挑取阳性克隆并经培养后提取的p4×PPRE-luc质粒其A260A280=1.84,浓度为750 ng/μl.结论 成功转化并扩增了p4×PPRE-luc质粒,为基于PPAR为靶标的药物筛选分子平台的建立提供了高纯度、高浓度的报告质粒.
关键词: 过氧化物酶体增殖物反应元件 报告质粒 质粒转化 -
小鼠PPARγ2基因表达载体pcDNA3-PPARγ2的转化扩增
目的 对含小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(mPPARγ2)基因载体pcDNA3-PPARγ2进行体外转化和扩增,为基于PPARγ2的相关研究提供高纯度、高丰度的表达载体.方法 取pcDNA3-PPARγ2质粒转化DH5α感受态菌,再接种到含氨苄青霉素的LB琼脂培养板进行抗性筛选培养,挑取阳性克隆菌落进行培养后抽提质粒,紫外分光光度计测定提取质粒的纯度和浓度,并取样进行琼脂糖凝胶电泳验证.结果 经转化后获得了大量抗氨苄青霉素的阳性克隆菌落,挑取阳性克隆并经培养后提取的pcDNA3-PPARγ2质粒其A260/A280=1.89,浓度为420 ng/μl.结论 成功转化并扩增了pcDNA3-PPARγ2质粒,为PPARγ的相关研究提供了高纯度、高浓度的表达载体.
关键词: 过氧化物酶体增殖物激活受体γ 质粒转化 质粒扩增 DH5α感受态细胞 -
质粒DNA的转化、提取及酶切分析
目的:构建人Bcl-2基因原核表达载体,并对其酶切鉴定.方法:将Bcl-2重组质粒转化进入经CaCl2法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选培养充分克隆,然后用碱裂解法分离提取重组质粒DNA,后用限制性内切酶酶切重组质粒DNA,并跑电泳鉴定.