首页 > 文献资料
-
鼠CD40配体基因的克隆及表达
目的:克隆和在真核细胞中表达鼠CD40配体(mCD40L)基因,为进一步研究打下基础.方法:用RT-PCR法扩增mCD40L基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1+中,重组质粒用脂质体转染H22细胞,G418筛选抗性细胞,用RT-PCR检测目的基因的插入,间接免疫荧光检测目的基因的表达.结果:含mCD40L基因重组表达质粒用酶切分析和序列测定进行鉴定后,转染H22细胞经G418筛选获得抗性细胞,经RT-PCR鉴定有含目的基因,间接免疫荧光鉴定有mCD40L的表达.结论:成功克隆mCD40 L基因并在真核细胞得到有效表达.
-
三种不同腺病毒基因组提取方法对全基因组克隆构建的影响分析
目的 建立一种简单、快速、有效、纯度高的人腺病毒全基因组提取的方法.方法 用60 mm细胞培养皿培养A549或AD293细胞,接种培养人7型腺病毒(HAdV-7)CQ1198株,收集病毒感染的细胞,分别用Hirt's改良法、试剂盒A和试剂B提取HAdV-7-CQ 1198病毒株全基因组,提取的基因组进行限制性内切酶酶切实验、细菌内同源重组实验和转染细胞拯救病毒实验.结果 几种方法都成功获得高质量的腺病毒全基因组,可以用于PCR、测序、酶切、同源重组和转染实验;两种试剂盒方法较传统的Hirt's改良法更快,不需要特别步骤去除细胞基因组,可以在1h内完成基因组提取.其中,试剂盒A提取的病毒基因组量多(20~50 μg),RNA含量少,不需要另外加入核糖核酸酶(RNase),而Hirt's改良法需要在裂解液中或终产物中加入RNase以去除细胞RNA成分.结论 试剂盒A和试剂盒B均可替代传统Hirt's提取方法用于快速提取高质量腺病毒基因组,提取的基因组能用于酶切分型、转染等实验操作.
-
沙眼衣原体E型MOMP基因原核表达载体的构建和纯化
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)共有19个血清型,其中D~K血清型则可通过性传播,引起人类泌尿生殖道感染,并可引起并发症.沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)携带Ct亚型等多种抗原决定簇,是诊断试剂和疫苗开发的基础.本研究选择MOMP基因作为研究对象,用PCR技术扩增E型沙眼衣原体MOMP基因片段,再将其定位插入到原核表达载体pGEX中,构建重组表达质粒.然后将重组表达质粒转化人大肠杆菌(BL-21)中,并用酶切分析、PCR扩增及部分序列测定等方法对重组质粒进行鉴定.诱导表达,用SDS-PAGE及蛋白印迹进行鉴定,并以亲和层析柱纯化表达产物,为进一步研究该蛋白的生物学特性,了解衣原体的致病机制奠定基础.
-
353例不同人群生殖器支原体检测分析
生殖器支原体(Myeoplasma genitalium Mg)首先由Tully等于1980年在美国从男性非淋菌性尿道炎患者泌尿生殖道分泌物中分离到两株(G-37株和M-30株).其后的研究提示Mg可引起人类非淋菌性泌尿生殖道感染,并与盆腔炎、输卵管炎、呼吸道感染和关节炎等疾病的发生有关.此外,Mg实验感染雄、雌性非人灵长类动物时也可引起泌尿生殖道感染.由于Mg的分离培养非常困难和缺乏特异性血清学试验[1],国内外至今报道较少.为了解武汉市有无Mg感染及其频率,为防治工作提供依据,我们对不同人群353例标本以分离培养Mg和聚合酶链反应检测了MgDNA,并对Mg扩增的特异性DNA进行了酶切分析,现报道如下.
-
抑制性消减杂交构建凋亡肝癌细胞差异表达cDNA文库
目的 应用抑制性消减杂交技术构建肝癌细胞凋亡消减杂交cDNA文库 ,以期克隆肝癌细胞凋亡相关基因. 方法 用三氧化二砷诱导人肝癌HCC-9204细胞凋亡,提取poly A+ RNA,反转录合成cDNA,消化成短片段后分成两组,分别与 两种不同的接头连接,再与普通肝癌细胞的cDNA进行两次杂交及两次抑制性PCR扩增,将PCR 产物与PT-Adv线性载体连接,转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆进行酶切鉴定, 反向Northern blot分析差异基因的可靠性. 结果 成功地构建了具有高消 减效率的人肝癌凋亡细胞cDNA文库,随机挑取200个克隆制备质粒并酶切分析,其中83.5%的 克隆均具有100~600 bp左右的插入片段. 随机选取30个插入片段,分别以未凋亡和凋亡的肝 癌细胞cDNA为探针,进行Reverse Northern Blot,其中21个被证明为差异表达的细胞凋亡 相关基因cDNA片段. 结论 应用抑制性消减杂交技术成功构建了人肝癌凋 亡细胞cDNA消减文库,为大批量筛选、克隆肝癌细胞凋亡相关的未知新基因奠定了基础,有 助于了解细胞凋亡的分子机制.
-
质粒DNA的转化、提取及酶切分析
目的:构建人Bcl-2基因原核表达载体,并对其酶切鉴定.方法:将Bcl-2重组质粒转化进入经CaCl2法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选培养充分克隆,然后用碱裂解法分离提取重组质粒DNA,后用限制性内切酶酶切重组质粒DNA,并跑电泳鉴定.