首页 > 文献资料
-
SARS冠状病毒S1基因片段真核表达载体的构建及其活性测定
严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)病原体是SARS冠状病毒(SARSCoV),研究开发安全有效的SARS-CoV疫苗以控制SARS成为热点.经过对12株SARS冠状病毒基因序列比较,发现S蛋白的氨基酸突变率仅为0.23%,其较高的保守性为疫苗研究奠定了良好的基础,由此,S蛋白成为候选疫苗的重要靶位[1].pcDNA3.1(+)是一种高效率的质粒型真核表达载体.本研究将SARS-CoV的S1基因片段连至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组pcDNA3.1(+)/S1并初步研究其免疫效果.
-
HCMV pp65和gB联合核酸疫苗表达载体的构建及其体内生物学活性研究
人巨细胞病毒(HCMV)主要被膜磷蛋白pp65(phosphoprotein 65)及糖蛋白gB(glycoprotein B)在病毒感染及诱发机体免疫反应中起重要作用,近年来有不少学者对HCMV pp65和gB这两种抗原进行动物和临床试验研究,虽取得了一定效果,但仍存在免疫原性弱、免疫范围局限等缺点.本研究利用分子生物学方法将HCMV两种保护性免疫原性基因pp65和gB构建在一起,制备HCMV核酸疫苗,并研究其在小鼠体内的免疫活性.
-
人肝素酶基因正反义腺病毒表达载体的构建及鉴定
目的:构建人肝素酶正义和反义腺病毒表达载体.方法:用EcoR I从pcDNA3-hpa质粒上切下约1.7kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入pDC315质粒的EcoRI酶切位点上,经BamH Ⅰ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并对正义重组质粒进一步采用测序鉴定其方向性.结果:经BamH Ⅰ酶切后,正义质粒形成4.3+1.4kb两条带,而反义重组质粒为5.1+0.4kb两条带,与理论计算值完全一致;测序结果与Gene Bank报告的肝素酶序列完全一致.结论:成功构建了人肝素酶的正、反义腺病毒表达载体,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肿瘤细胞的影响奠定了基础.
-
复制缺陷型HCV C基因腺病毒表达载体的构建包装及鉴定
目的:构建能表达HCV C基因的复制缺陷型腺病毒表达载体.方法:将HCV H株C区基因定向插入到腺病毒穿梭质粒pAd.CMV-Link.1中,获得重组质粒pAd.HCV-C,再与pJM1 7共转染293细胞,包装腺病毒表达载体.通过酶切、PCR及测序对穿梭质粒进行了鉴定.对腺病毒载体进行了感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定.利用间接免疫荧光法和Western blot检测了腺病毒载体在人肝癌细胞HepG2中的表达.结果:酶切、PCR及测序鉴定证实,穿梭质粒插入片段为HCV C区基因.包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒,腺病毒载体内携带HCV C区基因,并可以在HepG2细胞中表达HCV C抗原.结论:包装成功的复制缺陷型腺病毒载体可以在HepG2细胞中表达HCV C抗原,为丙型肝炎的基因治疗及疫苗的进一步研究奠定了基础.
-
乙肝病毒X基因真核表达载体的构建及人肝细胞株HL-7702转染
目的:构建表达乙肝病毒(HBV)X基因的人肝细胞株.方法:用PCR法扩增HBV X基因序列,将其添A后连至PUCmT载体上,用EcolI和HindⅢ双酶切PUCmT-X和PcDNA3载体,连接酶切片段PcDNA3及X片段以构建重组质粒PcDNA3-X.用脂质体转染法将PcDNA3-X及空质粒PcDNA3导入肝细胞HL-7702中,G418选择培养,RT-PCR鉴定其稳定表达.结果:已构建的PcDNA3-X经序列测定含有完整的HBV X基因片段,转入HL-7702细胞后经RT-PCR证实该细胞有稳定表达X蛋白.结论:成功构建了表达HBV X基因的肝细胞株,为进一步探讨HBV X基因在肝炎与肝癌发生中的作用提供了理想的实验模型.
-
人CD81真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达
目的:构建含人CD81基因的真核表达载体,探讨CD81在COS-7细胞的表达,为研究丙型肝炎病毒(HCV)与CD81相互作用奠定基础.方法:从我们构建的含人CD81全编码基因载体pMD18-T-CD81,应用双酶切回收基因片段,定向克隆入真核表达载体pVAX1;通过脂质体介导的基因转染技术将pVAX1-CD81和空载体转入COS-7细胞;应用抗CD81单克隆抗体通过间接免疫荧光法检测COS-7细胞的表达产物.结果:重组的含CD81基因的真核表达载体pVAX1-CD81经酶切和PCR鉴定分析正确,并证明在COS-7细胞表面有效地表达CD81蛋白.结论:成功构建含CD81全编码基因的真核表达载体pVAX1-CD81,并在COS-7细胞表面有效表达CD81分子,该转染细胞可作为研究CD81在HCV感染中的作用提供模型.
-
人鼠嵌合Fab抗体通用表达载体的构建和抗人肝癌相关抗原HAb18G嵌合Fab抗体的表达
目的:构建一个在大肠杆菌中表达人鼠嵌合Fab抗体的通用载体,并用于抗人肝癌相关抗原HAb18G人鼠嵌合Fab抗体的表达.方法:利用特异引物PCR扩增人IgG3的CHl和Ck基因,分别克隆到表达载体pComb3中,从而构建成人-鼠嵌合Fab抗体的通用表达载体pComb3C.然后将扩增的mAbHAbl8的VL和VH基因分别组装到通用表达载体中,酶切去除gⅢ片段后,连接成为HAb18嵌合Fab抗体的分泌型表达载体pComb3C/cFab.转化大肠杆菌后诱导其表达,通过ELISA检测产物的表达和定位.后,利用亲合层析纯化表达产物,进行SDS-PAGE电泳和Western-blot检测,同时采用ELISA和免疫荧光法检测表达产物的亲和力和特异性.结果:测序及酶切鉴定表明,人IgG3的CHi和Ck基因正确插入到pComb3中,大小分别为324bp和333 bp,同时mAb HAb18的嵌合Fab基因也分别获得正确组装和表达.表达产物的分子质量约为45 ku,主要位于周质腔中.另外,ELISA和免疫荧光检测证实,表达产物含有人的抗体片段,并具有与相应抗原特异结合的活性,亲和力约为亲本抗体的10%.结论:成功构建了人鼠嵌合Fab抗体的通用表达载体并制备了抗人肝癌小分子嵌合Fab抗体,为其进一步在肝癌诊断与治疗中的应用奠定了基础.
-
小鼠AFP-CTLA4融合蛋白真核表达载体的构建及鉴定
目的:克隆小鼠甲胎蛋白(mAFP)基因并构建小鼠甲胎蛋白-细胞毒性T淋巴细胞抗原4(mAFP-CTLA4)融合蛋白真核表达载体.方法:从Hepal-6细胞中提取总RNA进行RT-PCR,扩增出mAFP基因,亚克隆于pcDNA3.1载体.PCR法从质粒pmCTLA4-Ig中克隆出mCTLA4膜外部分基因并通过重叠PCR法添加接头,重组连接于pmAFP质粒中mAFP基因后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆酶切、测序鉴定.用质粒瞬时转染CHO细胞,Westernblot检测融合蛋白的表达.结果:利用RT-PCR从Hepal-6细胞总RNA中成功克隆出1.8kb的nAFP基因;重组阳性克隆经酶切鉴定证实连有接头的CTLA4膜外部分基因已正确插入pmAFP质粒中,测序结果证实各片段连接方向及阅读框正确.用质粒瞬时转染CHO细胞,Western blot检测到预计大小分子量蛋白的表达.结论:mAFP-CTLA4融合蛋白真核表达载体的构建成功,为进一步研究其在肝癌免疫治疗中的作用奠定了基础.
-
乙型肝炎病毒核心启动子部分缺失真核表达载体的构建及对病毒抗原表达的影响
乙型肝炎病毒核心启动子(CP)部分缺失变异已证实在几种HBV感染的临床现象中存在[1-3].我们在一组14例血清抗-HBe阳性的无症状携带者中,发现有9例在nt1748(或nt1747)至nt1767间20(或21)个核苷酸的缺失,此9例中有5例合并有nt1896G→A点变异[4].本研究在此基础上,拟构建这种CP 20/21 bp缺失及合并存在A1896点变异的HBV全基因重组真核表达载体,并转染HepG2细胞,以研究此类变异株对病毒抗原表达的影响.
-
NT4-NAP融合基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达
神经营养因子作为神经保护剂用于治疗中枢神经系统变性疾病已得到了广泛关注,但因其均为大分子蛋白质而难以通过血脑屏障的特点限制了临床应用.
-
丙型肝炎病毒NS3蛋白真核表达载体的构建及其基因免疫研究
基因免疫是指将编码特异抗原的目的基因重组表达载体直接接种到宿主组织内,在体内表达基因产物,进而激发宿主产生特异性免疫反应.自1990年首次报道发现基因免疫以来,这一新的免疫技术已经在基础免疫学研究和疫苗研制等许多领域得到广泛应用.对许多疾病(如流感)的基因免疫接种,可以产生抵御再次感染的保护性免疫反应[1].在小鼠体内接种HCV包膜蛋白和核心蛋白的重组质粒可诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫反应[2~4].本研究中我们构建了HCV NS3区真核表达载体,对其基因免疫效果进行初步探讨.
-
凋亡相关基因PNAS-2 siRNA质粒表达载体的构建、鉴定及转染后筛选方法的选择
硫化砷作用后急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞凋亡相关基因PNAS-2(apoptosis-related protein)表达显著降低[1,2].Busch等[3]认为PANS-2基因与细胞增殖有关.我们前期的研究发现硫化砷作用后的急性早幼粒细胞白血病(APL)患者白血病细胞及NB4细胞PNAS-2基因表达特异性下调,且呈时间依赖性而K562和U937细胞则无此较应[4].为了进一步研究封闭该基因后对细胞凋亡的影响,我们扩增其5'端未知序列,构建了PNAS-2 siRNA质粒表达载体并转染U937细胞,筛选、纯化转染细胞后检测U937细胞凋亡的变化以初步了解PNAS-2的作用.
-
人转化生长因子-β1基因克隆、测序及真核表达载体的构建
目的 克隆人转化生长因子-β1(TGF-β1)基因编码区cDNA序列,构建并鉴定TGF-β1真核表达载体.方法 设计含有EcoRⅠ和XholⅠ酶切位点的TGF-β1cDNA引物,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,以人白细胞mRNA为模版,扩增TGF-猹1基因,纯化PCR产物,TA克隆,双酶切与pcDNA3质粒表达载体连接,转化感受态大肠杆菌JM109,酶切鉴定阳性重组子,并进行序列测定.结果 琼脂糖凝胶电泳显示,用双酶切后形成分子量1.2kb的条带,符合物理图谱,表明表达载体构建成功,序列测定结果与预测结果完全一致.结论 成功克隆了TGF-猹1基因,并成功地构建了真核表达载体pcDNA3-TGF-β1.
-
pcDNA3.1(+)GDNF真核表达载体的构建及其在真核细胞中的表达
目的构建pcDNA3.1(+)胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达.方法将GDNF逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)产物克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以Fu Gene 6介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性.结果 RT-PCR产物为640bp特异片段,pcDNA3.1(+)GDNF重组体经酶切后分别出现640bp和300bp片段,测序分析与文献报道结果完全一致,表明重组pcDNA3.1(+)GDNF表达质粒克隆成功.可见pcDNA3.1(+)GDNF质粒在真核动物细胞中得到表达,GDNF蛋白能够刺激含多巴胺的细胞生长,表明重组质粒能在真核细胞中表达出具有活性的GDNF蛋白.结论以Fu Gene 6介导pcDNA3.1(+)GDNF质粒转染真核细胞为基因治疗帕金森病奠定了一定基础.
-
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因真核表达载体的构建及抑瘤功能研究
PJ综合征(Peutz-Jeghers syndrome)是一种常染色体显性遗传疾病.临床表现以唇、颊黏膜、指(趾)黑色囊性斑、多发性胃肠息肉以及肿瘤易患性增加为特征.其疾病基因丝氨酸/苏氨酸激酶(STKⅡ/LKBⅠ)基因于1998年被克隆[1,2],基因所编码的STKⅡ/LKBⅠ蛋白在细胞内广泛表达,行使多种重要复杂的生理功能,参与细胞生命活动的调节.
-
沙眼衣原体E型MOMP基因原核表达载体的构建和纯化
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)共有19个血清型,其中D~K血清型则可通过性传播,引起人类泌尿生殖道感染,并可引起并发症.沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)携带Ct亚型等多种抗原决定簇,是诊断试剂和疫苗开发的基础.本研究选择MOMP基因作为研究对象,用PCR技术扩增E型沙眼衣原体MOMP基因片段,再将其定位插入到原核表达载体pGEX中,构建重组表达质粒.然后将重组表达质粒转化人大肠杆菌(BL-21)中,并用酶切分析、PCR扩增及部分序列测定等方法对重组质粒进行鉴定.诱导表达,用SDS-PAGE及蛋白印迹进行鉴定,并以亲和层析柱纯化表达产物,为进一步研究该蛋白的生物学特性,了解衣原体的致病机制奠定基础.
-
脂肪特异性蛋白27基因的慢病毒载体的构建及其在星状细胞中的表达
我们通过构建脂肪特异性蛋白27( Fsp27)基因的慢病毒载体,并感染活化态肝星状细胞(HSCs),为探讨该基因的抗纤维化作用奠定基础.一、材料与方法1.材料:293T及HSCs由温州医学院实验动物中心提供;病毒构建所需试剂分别购自Genechem公司、Promega公司及TaKaRa公司.2.Fsp27重组表达载体的构建:设计Fsp27基因引物序列,以大鼠cDNA为模板进行聚合酶链反应( PCR)扩增.将PCR产物和载体连接后转化感受态大肠杆菌,对长出的克隆菌落进行PCR鉴定及测序分析.3.慢病毒颗粒的包装和生产:将Fsp27慢病毒与293T细胞的混合培养.收集细胞上清进行病毒滴度测定.收集感染3d后的293T细胞.提取蛋白电泳鉴定.
-
血小板衍生生长因子-C开放阅读框克隆及真核表达载体的构建及鉴定
血小板衍生生长因子(PDGF)-C是Li等[1]新近发现的血管内皮生长因子(VEGF)/PDGF家族成员.研究结果表明其不仅具有与VEGF相似的作用,还具有多重独特的表达形式和生物学效应.本研究旨在通过克隆大鼠PDGF-C基因开放阅读框,从而构建增强型绿色荧蛋白(pIRES2-EGFP-PDGF-C)真核表达载体.
-
人柯萨奇-腺病毒受体基因真核表达载体的构建及在膀胱肿瘤细胞中的表达
我们通过本实验构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的高效、双向真核表达载体pIRES2-EGFP-hCAR,并以阳离子脂质体介导法转染人膀胱癌细胞,研究EGFP与柯萨奇腺病毒受体基因(CAR)蛋白在膀胱肿瘤中高效的表达.
-
靶向低氧诱导因子-1α mRNA核酶基因表达载体的构建及在真核细胞中的表达
我们通过本实验构建转录因子低氧诱导因子-1α(HIF-1α)真核表达载体,研究其在真核细胞内的表达及切割活性.