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糖皮质激素受体β对糖皮质激素受体α功能的影响及其意义
目的:通过研究糖皮质激素受体β对糖皮质激素受体α功能的影响,探讨糖皮质激素受体β可能存在的生物学意义.方法:(1)用瞬时转染技术将GRβ和报告基因cat共转染HOS-8603细胞,激素处理后,研究GRβ对糖皮质激素诱导GRα外源性靶基因cat表达的影响;(2)GRβ真核表达载体的构建及GRβ在HOS-8603细胞中的稳定过度表达;(3)用定量RT-PCR和Western印迹法检测糖皮质激素对HOS-8603细胞p21表达的诱导及GRβ的稳定表达对GRα内源性靶基因p21表达的影响;(4)用MPT法检测GRβ的稳定过度表达对糖皮质激素抑制HOS-8603细胞增殖作用的影响;(5)GRβ对糖皮质激素诱导HOS-8603细胞AKP(成骨细胞分化标志酶)活性的影响.结果:(1)GRβ抑制GRα外源性靶基因cat的表达,且具有剂量依赖性特点;(2)GRβ抑制GRα内源性靶基因p21的表达;(3)GRβ的稳定过度表达降低糖皮质激素抑制HOS-8603细胞增殖的作用;(4)GRβ的稳定过度表达抑制糖皮质激素对HOS-8603细胞AKP活性的诱导.结论:糖皮质激素受体β对糖皮质激素受体α的功能有抑制作用,糖皮质激素受体β可能是糖皮质激素受体α的内源性抑制因子.
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反义寡核苷酸在胃癌治疗研究中的现状
反义核酸技术是肿瘤基因治疗的策略之一,其基本原理是根据碱基互补原则,用人工合成或生物体表达的特定互补的 DNA或 RNA片断(反义核酸) ,以抑制或封闭专一靶基因表达的技术.反义核酸的来源总体上有 3条途径:第一是人工合成 RNA表达载体的构建;第二是利用诱导剂诱生反义核酸;第三是人工合成反义寡核苷酸,其中反义寡核苷酸因制备容易而得到广泛应用.
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人T细胞免疫球蛋白黏蛋白1基因及其融合蛋白真核表达载体的构建和生物信息学分析
T细胞免疫球蛋白黏蛋白1(TIM-1)基因是目前新发现的TIM基因家族成员之一,初被鉴定为甲型肝炎受体1(HAVCR-1),是甲型肝炎病毒(HAV)侵入机体必需的,并与HAV结合的受体[1-2]。而后又被鉴定为肾损伤分子1 (KIM-1),在受损的上皮细胞表面高表达[3]。并且,TIM-1优先表达于人和小鼠的Th2细胞表面,是哮喘、变应性过敏等Th2细胞介导的相关性疾病的一个重要易感基因[1]。其作为T细胞活化的共刺激分子,调节Th2细胞的免疫应答[2,4]。而Fc融合蛋白在科学研究和疾病治疗中有广泛的应用。本研究中,我们旨在构建人TIM-1基因及其Fc融合蛋白真核表达载体,并运用生物信息学方法对TIM-1基因进行系统分析,预测其可能存在的功能,为进一步探讨和阐释TIM-1基因在免疫调控中可能扮演的作用奠定基础。
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HBV反义全基因真核细胞表达载体的构建及在肝癌细胞内的表达
1. 材料与方法:乳哺动物细胞表达载体pBK-CMV,长约4.5kb,带有T7公用序列。pCP10是pBR322 EcoRI位点中插入双拷贝头尾相接的HBV ayw亚型全基因HBV DNA重组质粒。PCR引物XI1:1428-1448 nt 5′CGT CCC GTC GGC GCT GAA TCC 3′,XI2:1672-1653 nt 5′AGT CCA AGA GTC CTC TTA AG 3′。人肝癌细胞系SMMC-7721,由上海细胞所提供。将EcoRⅠ酶切后回收的全基因HBV片段,在T4 DNA连接酶作用下,与EcoRⅠ酶切后的pBK-CMV粘端连接。利用pBK-CMV具有T7公用序列,选用XI2、T7作为引物,PCR出现1.7kb阳性条带为反接,并命名为pBK-AHBV。用FUGENETM6转染试剂转染SMMC-7721细胞。在含10%FCS的RPMI 1640(pH7.4)培养基中培养至60h后,用总RNA抽提试剂(Trizol Reagent)提取转染的SMMC-7721细胞,依次获得总RNA、DNA。
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人端粒酶催化亚单位诱饵融合蛋白表达载体的构建及初步鉴定
端粒是真核细胞染色体末端的一个特殊结构,由一段具有特定重复序列的DNA和端粒结合蛋白组成,是维持染色体结构稳定的重要因素.正常细胞随着细胞分裂活动的进行,端粒DNA逐渐缩短,当缩短到一定程度时,染色体结构被破坏,细胞进入衰老期并以死亡而告终.但肿瘤细胞似乎丧失了这种能力,表现出永生化而无限制增殖的特性.尽管端粒研究为肿瘤、衰老难题提供了一个重要的研究方向,但有关端粒蛋白组分的结构及其调控机制仍不十分清楚.因此,寻找新的、关键性的端粒、端粒酶调控分子是非常重要的[1].本课题拟以已发现的端粒相关蛋白中较为重要的人端粒酶催化亚单位(Human telomerase reverse transcriptase, hTRT)为诱饵,构建hTRT诱饵融合蛋白表达载体,为从cDNA文库中筛选与hTRT作用的端粒相
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A20基因真核表达载体的构建及抑制内皮细胞组织因子(TF)表达的研究
本研究旨在克降人A20基因与真核表达载体进行连接,并对其在内皮细胞的表达及功能进行研究.方法:将N-末端标记E-tag的人A20cDNA与穿梭质粒pCAGG S进行连接后得到重组表达质粒pCAGGSEhA20,将pCAGGSEhA20用脂质体包裹转染培养的人脐静脉内皮细胞,同时转染pCAGGS空载体进行对照;G418加压筛选重组细胞克隆.随机挑选pCAGGSEhA20转染的内皮细胞5株,调整为1000 0/ml,用鼠抗人E-tag抗体进行免疫荧光染色.转染pCAGGSEhA20阳性的内皮细胞及pCAGGS空载体转染对照细胞调整为10000/ml,每孔加200μ l,加LPS致终浓度为(100ng/ml),作用4小时后细胞固定,用anti-T F抗体进行免疫荧光染色及行TF原位杂交,图象分析相应的参数.结果:重组表达质粒p CAGGSEhA20酶切鉴定证实含有人A20cDNA,将pCAGGSEhA20和 pCAGGS转染的内皮细胞随机挑选G418抗性克隆数个,用抗E-tag抗体染色后 ,FACS检测其A20基因的表达情况,结果显示大多数克隆均有不同程度的表达,表达率为90%以上,选取高表达克隆扩增传代.LPS作用后表达A20基因的阳性细胞TF 仅有微弱表达或不表达,而对照细胞TF表达呈强阳性.结论:组织因子是炎症内皮细胞表达的细胞因子,在血栓形成中起重要作用.本实验表明A20基因能抑制LPS所致炎症内皮细胞表达TF,从而抑制血栓形成,在血栓预防和治疗中有重要作用.
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C端带cmyc和多聚组氨酸双标记的重组人β防御素-2真核表达载体的构建及其在COS-7细胞的转染表达
目的:人类β-防御素(β-defensins hBDs)是一类具广谱抗微生物活性的小分子阳离子多肽,在人体多种器官尤其是粘膜上皮细胞中广泛存在,起着重要的屏障防御作用.由于Hbd-2在粘膜上皮组织受炎症刺激呈诱导性表达,提示其在机体粘膜防御中的作用更为突出.本研究旨在探索建立不仅能有效表达和分泌人类β-防御素-2而且其表达产物易于被检测和分离纯化的哺乳类动物型工程细胞的可能性及技术路线.
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人类TAP1基因克隆及表达载体的构建
抗原处理相关转运体(TAP)属于ABC(ATP-binding cassette)转运体超家族B亚家族.人类TAP基因位于6号染色体上的MHC-II类基因区, 其编码的TAP1和TAP2分子, 分别由748和686个氨基酸残基所组成, 两者可形成异源二聚体参与肽类的转运过程, 在MHC-I类分子介导的抗原递呈途径中起着重要作用[1, 2].因此, TAP的异常将严重影响抗原递呈, 成为病毒感染及肿瘤细胞逃避免疫监视的重要机制[3], 如卵巢癌 [4]、肝癌[5]及宫颈癌[6]细胞中TAP1的表达量明显下降.我们在本实验中, 从B淋巴母细胞系中克隆出TAP1基因, 并构建了其表达载体pcDNA3.1/V5-His TOPO TA-TAP1.
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人CD81真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达
关键词: 表达载体的构建 -
Der p2重组胞壁型E. coli-BCG穿梭表达载体的构建和鉴定