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DNA标记杂交技术筛选抗HBs-IFN-α融合蛋白表达载体
为在无抗药性改变,转化细胞无生物指示系统改变的克隆载体中扩大筛选范围,提高筛选阳性率,本文应用地高辛标记DNA检测系统筛选人源单抗片段与干扰素融合蛋白表达质粒(Anti-HBs-IFN-α),取得了理想的效果.纯化制备载体的插入段DNA,用地高辛标记系统进行化学标记,制成标记探针.挑取单克隆菌扩增,以溶菌酶加煮沸法批量制备载体DNA,点样于硝酸纤维膜上并经80℃烤2h,分别用预杂交液和标记探针进行42℃2h、42℃6h的膜预杂交和杂交反应,洗膜后用酶标抗地高辛抗体显色.未带插入片段的抗体表达载体为阴性对照,IFN-α质粒DNA作阳性对照,在40株转化细胞中筛选出7个目的克隆.为进一步核实该法的筛选效率和可靠性,分别用单酶切和双酶切法对筛选出的阳性载体进行鉴定,琼脂糖电泳结果显示,两者的符合率为100%.该系统筛选结果可靠,尤其在克隆载体转化细胞后无抗药改变,无其他筛选特征的载体构建中有一定的优势.
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融合蛋白表达载体MK-EGFP的构建及其在不同肿瘤细胞中的定位
MK(Midkine)是一种肝素结合性生长因子,初发现与细胞生长、迁移和存活有关,随后的研究发现它在多种人源恶性肿瘤中高表达[1-2].
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EGFR模拟表位肽筛选及其生物学活性鉴定
目的:帕尼单抗(Panitumumab)可抑制EGFR信号通路,临床用于治疗EGFR高表达的转移性结直肠癌患者。本研究以帕尼单抗为靶分子,应用噬菌体展示肽库进行筛选,获得可模拟与帕尼单抗结合的EGFR表位小肽,并对模拟表位肽的活性进行了初步鉴定。方法:应用噬菌体展示肽库技术筛选可与帕尼单抗结合的噬菌体单克隆,并对阳性噬菌体克隆进行DNA测序鉴定,获得对应的EGFR模拟表位肽序列。通过基因重组、蛋白表达、纯化,获取该小肽与GST的融合蛋白,并通过ELISA,免疫共沉淀和GST-Pull down检测小肽与帕尼单抗的结合,及其对帕尼单抗结合EGFR的竞争抑制作用。结果:通过筛选噬菌体肽库我们获得两种可同帕尼单抗特异性结合的噬菌体单克隆,P19和P26。应用基因重组技术构建GST-小肽融合蛋白表达载体,并在BL21中表达融合蛋白GST-P19、GST-P26。免疫共沉淀(Co-IP)以及GST-pulldown结果初步提示帕尼单抗同GST-P19和GST-P26具有相互作用。ELISA竞争抑制实验结果证明P19和P26可明显抑制帕尼单抗和EGFR蛋白的结合。结论:通过筛选噬菌肽库获得的帕尼单抗特异性结合性小肽有望成为新型EGFR肿瘤疫苗。
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人端粒酶催化亚单位诱饵融合蛋白表达载体的构建及初步鉴定
端粒是真核细胞染色体末端的一个特殊结构,由一段具有特定重复序列的DNA和端粒结合蛋白组成,是维持染色体结构稳定的重要因素.正常细胞随着细胞分裂活动的进行,端粒DNA逐渐缩短,当缩短到一定程度时,染色体结构被破坏,细胞进入衰老期并以死亡而告终.但肿瘤细胞似乎丧失了这种能力,表现出永生化而无限制增殖的特性.尽管端粒研究为肿瘤、衰老难题提供了一个重要的研究方向,但有关端粒蛋白组分的结构及其调控机制仍不十分清楚.因此,寻找新的、关键性的端粒、端粒酶调控分子是非常重要的[1].本课题拟以已发现的端粒相关蛋白中较为重要的人端粒酶催化亚单位(Human telomerase reverse transcriptase, hTRT)为诱饵,构建hTRT诱饵融合蛋白表达载体,为从cDNA文库中筛选与hTRT作用的端粒相