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脂多糖结合蛋白与脂多糖结合位点模拟肽的筛选
目的 应用噬菌体随机12肽库筛选脂多糖结合蛋白(LBP)与脂多糖结合位点的多肽序列.方法 以脂多糖为固相筛选分子,对噬菌体12肽库进行4轮亲合筛选,采用酶联免疫吸附法鉴定筛选后的噬菌体克隆与脂多糖的结合活性,取结合活性较高的克隆进行DNA测序,推导其多肽序列并与LBP序列比对,再进行竞争抑制实验检测筛选噬菌体与LBP竞争结合的效力.结果 选取的86个噬菌体克隆中,多数结合实验鉴定阳性,取20个亲和力高的克隆测序,得到20条不同编码的12肽序列,20条多肽与LBP一级结构有不同程度同源性,均为模拟肽.12个噬菌体克隆有较高的竞争抑制率.结论 用噬菌体12肽库成功筛选出LBP与脂多糖结合位点模拟肽,为进一步以这些多肽为先导物进行定向进化研究提供了实验依据和结构基础.
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用噬菌体肽库筛选SARS病原体的模拟抗原表位
目的筛选SARS病原体的模拟抗原表位.方法以混合SARS患者恢复期血清Ig作为筛选分子,从噬菌体肽库中筛选出能与患者血清Ig结合的模拟抗原表位,并研究其抗原特性.结果得到2个能与SARS患者恢复期血清Ig特异性结合的阳性克隆;DNA测序结果显示这2个模拟抗原表位与SARS抗原无同源性.结论用噬菌体肽库成功筛选得到SARS的模拟表位,为开展用SARS模拟抗原表位探索SARS的防治研究创造了条件.
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应用噬菌体随机9肽库筛选庚型肝炎病毒抗原表位
自1985年美国Missouri大学Smith博士首先建立噬菌体表面展示技术(phage display techniques,PDT)以来,这一技术在研究分子间相互识别,如抗原-抗体、配体-受体、酶-底物等诸多领域已充分显示其独特的优势[1].该技术是以经过改建的噬菌粒为载体,将外源基因插入噬菌体外壳蛋白Ⅲ或Ⅷ基因中,从而使表达的外源肽或蛋白质展示在噬菌体表面,并保持一定的空间构象.噬菌体表面随机表达多肽文库技术的建立,使表面展示由单一表达转入随机表达,应用特定的靶分子(如抗体、受体或其它分子等)可从中筛选出相应的配体,通过测定插入基因的序列即可明确其表达产物的氨基酸序列[2,3].因此,噬菌体随机肽库已成为研究分子间相互作用的有力工具.本文用抗庚型肝炎病毒(hepatitis G virus,HGV)包膜蛋白2(envelope protein 2,E2)单克隆抗体M-13-IgG为靶分子,从构象限制性噬菌体随机9肽库(PVⅢ9aa-cys)中筛选HGV特异性的抗原表位.
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噬菌体肽库的免疫学应用研究
噬菌体展示肽库技术是一种用于筛选蛋白、多肽的强有力的生物技术,将外源蛋白与噬菌体外壳蛋白融合而表达于噬菌体颗粒表面,被展示的外源蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性.本文总结了这一技术及其相关展示系统在蛋白质相互作用的研究、抗体及疫苗的制备、多肽药物的研制等方面的应用潜力和独特的优点.
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从噬菌体12肽库筛选旋毛虫抗原模拟表位
为研究和开发新的旋毛虫病诊断抗原和疫苗,以纯化旋毛虫病患者血清免疫球蛋白(Ts-Ig)对噬菌体12肽库进行5轮筛选获得旋毛虫抗原模拟表位,随机挑选24个克隆,通过ELISA选取吸光度(A)较高的6个克隆(T1～T6)并检测其灵敏性和特异性.结果显示:T1～T6灵敏性与旋毛虫幼虫抗原(TsA)相同(阳性反应率:100%,P＞0.05),特异性与TsA无明显差异(阳性反应率:0～40%,P＞0.05),其中T3,T6与肺吸虫病患者血清无交叉反应,特异性高于TsA(P＜0.05),T6与日本血吸虫病患者血清无交叉反应,特异性亦高于TsA(P＜0.05),证实利用噬菌体12肽库可以成功地筛选到旋毛虫抗原模拟表位,为旋毛虫病诊断抗原和疫苗的研究和开发提供了新的研究途径.
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应用噬菌体十二肽库筛选卫氏并殖吸虫抗原模拟表位
目的从噬菌体12肽库中筛选卫氏并殖吸虫抗原模拟表位. 方法将卫氏并殖吸虫病患者血清免疫粗球蛋白 ( Ig ) 作为靶分子筛选噬菌体随机12肽库.经过5轮淘筛,随机挑取24个蓝色噬菌斑进行扩增,以ELISA检测其免疫活性并分析其诊断并殖吸虫病的价值. 结果 24个克隆中有12个可以被卫氏并殖吸虫病患者血清Ig所识别,其中有2个克隆(P5、P6)具有较好的特异性和敏感性,可能为特异性的卫氏并殖吸虫抗原模拟表位. 结论应用噬菌体肽库筛选可以获得卫氏并殖吸虫抗原模拟表位,为并殖吸虫病诊断抗原和短肽疫苗的研究提供了新的方法学依据.
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日本血吸虫抗原模拟表位免疫学活性的初步研究
目的研究从噬菌体12肽库中筛选得到的日本血吸虫抗原模拟表位的免疫学活性. 方法以日本血吸虫急感患者血清免疫球蛋白(Ig)作为靶分子,筛选噬菌体12肽库.经过3轮吸附-洗脱-扩增的淘筛过程,在筛选得到的阳性噬菌斑中随机挑取42个扩增,用ELISA检测不同寄生虫病患者和正常人血清,以分析其敏感性和特异性.并进一步免疫昆明株小鼠,经日本血吸虫尾蚴攻击感染后剖检,计算减虫率和减卵率,以分析其在小鼠体内诱导的免疫保护性. 结果在挑取的42个阳性克隆中,有9个与日本血吸虫急感患者血清有不同程度的结合(6.25%～100%).除其中1个灵敏性较低的克隆与其它寄生虫病患者血清有一定的交叉反应外,其余均未发现.而经其免疫后的小鼠也分别获得了29.3%减虫率和35.9%减卵率. 结论从噬菌体12肽库中筛选到的日本血吸虫抗原模拟表位具有较高的特异性和敏感性, 并能够在小鼠体内诱导一定的免疫保护力.
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应用噬菌体肽库技术筛选华支睾吸虫童虫模拟抗原表位的研究
目的 利用噬菌体肽库技术筛选华支睾吸虫童虫模拟抗原表位,观察影响筛选效率和噬菌体滴度的关键因素.方法 收集华支睾吸虫感染童虫期大鼠血清,用正辛酸硫酸铵法提纯多克隆抗体,用提纯的多克隆抗体对噬菌体十二肽库进行3轮筛选.随机挑取噬菌体克隆,用ELISA法检测其特异性. 结果 经3轮免疫学筛选获得19个噬菌体克隆,ELISA测定有17个能被纯化的华支睾吸虫(童虫期)感染大鼠血清抗体识别. 结论 利用噬菌体肽库技术可以筛选出华支睾吸虫童虫模拟抗原表位,靶分子浓度以及噬菌体液的稀释度等因素是技术关键.
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以特异性噬菌体展示肽为靶筛选TNF-α结合肽的研究
目的建立以特异性噬菌体展示肽为靶从噬菌体肽库中筛选结合表位的新方法. 方法以前期工作中筛选得到的模拟TNF-α表位的环七肽克隆LCS-7(c-RRPAQSG-c)为靶,筛选噬菌体线性十二肽库;用间接ELISA及竞争试验鉴定阳性克隆. 结果对噬菌体十二肽库进行3轮筛选后,挑取20个克隆中有10个为阳性克隆,测序结果氨基酸序列相同:EHMALTYPFRPP. 结论以TNF-α模拟肽克隆为靶筛选得到的噬菌体十二肽克隆,能够与TNF-α结合,为TNF-α结合肽;所测得序列完全一致.上述结果提示了该筛选方法的可行性.
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登革2型病毒E蛋白免疫优势表位的筛选鉴定
目的用噬菌体展示肽库筛选登革2型病毒(DEN2)E蛋白的抗原表位,并确定该抗原表位性质. 方法以DEN2型特异的E单克隆抗体作为筛选分子,生物淘洗噬菌体随机12肽库,将筛选的噬菌体阳性克隆进行ELISA检测、DNA序列测定及展示肽的氨基酸序列推导,通过噬菌体展示肽序列与DEN2 E蛋白的氨基酸一级结构的对比,初步确定E蛋白的抗原表位;用模拟该表位线性序列的合成十肽进行抗体结合试验、噬菌体竞争抑制试验及与DEN感染患者的血清学试验,确定其为免疫优势线性表位. 结果肽库淘洗获得的11个ELISA阳性的噬菌体克隆有相似的结构基序WFKKGSS,其展示肽与DEN2 E蛋白390～398 AA序列有3～5个氨基酸相同.对应于DEN2 E蛋白390～399 AA的合成十肽能与淘洗单抗特异反应,并可抑制噬菌体阳性克隆与该单抗结合.该合成肽与DEN2感染患者血清有较高的免疫反应性. 结论本实验通过噬菌体随机肽库的生物淘洗确定的DEN2 E蛋白(E390～398 AA)线性序列为免疫优势表位,其对应的合成肽E10可望用于DEN2感染的快速诊断.
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应用噬菌体随机肽库技术筛选幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的抗原表位
目的 筛选和鉴定幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)中性粒细胞激活蛋白(neutrophil-activating protein,NAP)的有效抗原表位,为Hp疫苗的研制提供基础.方法 以抗NAP的单克隆抗体作为固相筛选分子,经3轮吸附-洗脱-扩增免疫,筛选噬菌体随机7肽库,随机挑选噬菌体克隆,经噬菌体酶联免疫吸附试验(ELISA)、交叉反应试验及竞争抑制试验鉴定阳性克隆,测定阳性克隆所携带DNA序列并进行计算机辅助分析.以制备的阳性噬菌体克隆短肽液免疫小鼠,免疫血清与NAP经Western blot分析,以验证NAP的模拟表位.结果 经3轮免疫筛选后挑选到45个阳性克隆,经ELISA鉴定有12个阳性克隆,测序结果显示5种表位,其中P17噬菌体展示肽FAHLATQ与NAP氨基酸序列(137～143)高度同源,位于NAP高抗原区域(118～140),免疫血清可识别NAP.结论 用噬菌体随机7肽库成功筛选到了NAP的模拟表位,为基于NAP的诊断和疫苗的研制提供了基础.
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用噬菌体肽库筛选重组日本血吸虫线粒体相关蛋白的表位
目的筛选和鉴定重组的日本血吸虫(中国大陆株)线粒体相关蛋白rSj338的表位.方法用纯化的rSj338/26GST免疫家兔获得抗rSj338/26GST的多克隆抗体IgG,将抗体进一步纯化,获得抗rSj338单特异多克隆抗体IgG.用纯化抗rSj338抗体对噬菌体12肽库进行5轮免疫学筛选,挑取克隆;采用Western blot免疫识别,核苷酸序列测定分析其获得的表位并与rSj338/26GST进行同源性比较.将获得的不同表位的阳性克隆分别免疫小鼠,并采用Western blot及dot-ELISA方法筛选能刺激小鼠产生较高滴度抗rSj338抗体的阳性克隆.并将阳性噬菌体免疫的小鼠血清对纯化的rSj338/26GST、26GST、日本血吸虫成虫及虫卵抗原进行Western blot识别.结果经5轮免疫学筛选后挑取的32个克隆,用Western blot方法30个克隆能被抗rSj338抗体识别.核苷酸序列分析发现共有11种表位,与rSj338无一级结构的同源性.经动物免疫初步实验筛选,共获得4个免疫原性较强的阳性克隆,其免疫鼠血清均可识别rSj338/26GST、日本血吸虫成虫及虫卵抗原.结论获得了4种日本血吸虫中国大陆株线粒体相关蛋白rSj338的表位,均为模拟表位,这将为日本血吸虫病的疫苗研究开辟新的途径.
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利用噬菌体肽库筛选TNF-α表位的相关短肽
目的从噬菌体肽库筛选TNF-α相关短肽,为临床上治疗肿瘤奠定基础. 方法用可溶性TNF受体Ⅰ(sTNFRⅠ)筛选噬菌体随机12肽库,利用细胞毒效应进行生物学效应筛选,再进行单链DNA测序. 结果分别得到若干模拟跨膜型TNF-α(TM-TNF-α)和模拟分泌型TNF-α(S-TNF-α)细胞毒效应的短肽,选择细胞毒效应好的模拟TM-TNF-α短肽进行人工合成,体外实验显示此肽段对S-TNF-α耐受肿瘤细胞系HL-60具有明显细胞毒效应,且主要引起靶细胞凋亡.另外,利用激光共聚焦显微镜证实该合成肽段不能诱导NF-κB发生核转位.结论获得模拟TM-TNF-α的短肽,为TM-TNF-α用于临床抗瘤治疗提供新线索.
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利用噬菌体肽库技术获得与人Fas结合的多肽基序
目的利用噬菌体随机肽库技术获得与人Fas胞外区结合的多肽及其多肽基序,观察多肽基序的生物学功能. 方法以人Fas胞外区与IgG Fc段的融合蛋白Fas.Fc为筛选配基,筛选噬菌体随机九肽库;微量淘洗与ELISA相结合鉴定阳性克隆,DNA测序和分析.化学合成多肽进行竞争性ELISA以及细胞增殖抑制实验. 结果经过4轮亲和筛选,微量淘洗鉴定,获得42个阳性克隆;固定ELISA实验显示筛选到的噬菌体短肽能与Fas.Fc特异性结合,并呈剂量依赖关系;随机选取13个阳性克隆进行DNA测序,其序列及出现几率分别为:PRKARVDTS(2/13)、YKKKSLQVQ(2/13)、YKKKSMLQA(2/13)、SRKKYDQYA(4/13)、YARKIKPTA(2/13)和ARKKTEGAG(1/13).经多重序列分析,获得多肽基序:*R/KKK****A.在ELISA和竞争性ELISA实验中,化学合成多肽EGEFYKKKSMLQADPAK (P3)可抑制Fas与抗人Fas单抗Apo-1的结合,且呈剂量效应关系;P3不能抑制Fas与FasL的结合.细胞增殖实验表明,多肽可抑制Jurkat细胞增殖,且随多肽剂量的增加而加强.多肽与单抗Apo-1联合作用对Jurkat细胞增殖的影响与单独使用P3没有明显差别. 结论通过噬菌体随机肽库技术获得与Fas结合的多肽及其多肽基序,它们可能模拟了抗Fas抗体Apo-1对Fas的结合位点,为基于Fas凋亡的多肽药物前体设计提供了实验依据和结构基础.
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交叉保护性抗LPS多克隆抗体的制备与LPS多表位模拟肽的筛选
目的获得具交叉保护性的抗细菌脂多糖(LPS)多克隆抗体与模拟LPS多表位的噬菌体展示环肽克隆. 方法制备具交叉反应性的兔抗鼠伤寒沙门菌抗血清,鉴定抗血清对大肠杆菌和铜绿假单胞菌攻击小鼠的交叉保护性.以亲和纯化的多克隆抗体为靶,亲和筛选噬菌体随机环七肽库.双夹心ELISA和竞争抑制ELISA鉴定阳性噬菌体克隆. 结果兔抗血清能与多种来源的LPS反应,对用大肠杆菌和铜绿假单胞菌攻击的小鼠有显著的保护性.用亲和层析纯化的多克隆抗体为靶分子进行3轮筛选,随机挑选46个克隆,其中20个克隆显示与多抗结合.鼠伤寒沙门菌LPS可抑制阳性噬菌体克隆与多抗结合,所有克隆的IC50(达到50%抑制率的LPS浓度)为125ng/ml.挑选其中10个克隆测序并推导氨基酸序列,其中5个克隆具X-QFYP-X-A保守序列;3个克隆具LFTFAHY序列;2个克隆具YQYYPAA序列,所有序列非极性氨基酸含量平均值为80.0%. 结论获得能与多种LPS反应且具交叉保护作用的兔多克隆抗体,筛选得到可模拟鼠伤寒沙门菌LPS多表位噬菌体展示环七肽.
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三阴性乳腺癌原代细胞的培养及其特异性结合肽的筛选
目的：利用噬菌体肽库筛选技术获得与三阴性乳腺癌原代细胞特异性结合的多肽，为探索三阴性乳腺癌的治疗靶点提供试验支持。方法从三阴性乳腺癌新鲜组织分离、培养原代癌细胞并以其为靶细胞，以hs578bst人正常乳腺细胞为吸附细胞，对噬菌体随机十二肽库进行三轮减性筛选；随机挑取15株富集后的噬菌体单克隆，ELISA及DAB染色鉴定噬菌体克隆的亲和力及特异性，并对阳性噬菌体单克隆测序。结果经过3轮筛选，噬菌体克隆得以明显富集，随机挑取的15株噬菌体单克隆中有11株为阳性，ELISA及DAB鉴定发现，5号噬菌体（phage-5）对靶细胞亲和力及特异性强，经DNA测序和推导，其多肽序列为PHETLTSFVRRG。结论从噬菌体随机十二肽库中成功筛选出与三阴性乳腺癌原代细胞特异性结合的多肽，该多肽可能作为三阴性乳腺癌靶向治疗药物的载体。
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肝癌特异性噬菌体多肽的筛选和初步鉴定
目的 利用噬菌体展示肽库筛选与肝癌HepG2细胞特异性结合的多肽,为筛选及明确新的肝癌早期诊断和治疗标志物打下基础.方法 以肝癌细胞HepG2为靶细胞,LO-2为吸附细胞,在37℃条件下对噬菌体随机12肽库进行多轮减性筛选,挑取单克隆扩增并鉴定.利用ELISA初步鉴定克隆亲和力,测定阳性克隆DNA测序并进行同源性及氨基酸分析.结果 经过3轮减性筛选发现,随机挑选的30个单克隆中,其中ZS-9对HepG2具有较高亲和力,氨基酸测序结果表明,该序列与美国国立生物技术信息中心(NCBI)GenBankDNA序列数据库和Swiss-Prot蛋白数据库中的已知基因和蛋白无同源性,而且,国内外文献均未见报道,表明笔者筛选到一新的肝癌相关抗原的配体.结论 利用噬菌体随机12肽库成功筛选到与肝癌细胞HepG2具有较高亲和力的多肽,为筛选鉴定新的肝癌特异的标志物奠定工作基础,也为肝癌的早期诊断和靶向治疗进一步研发确定了靶标.
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HAb18G/CD147拮抗肽的筛选及对肝癌细胞侵袭力的抑制
目的筛选能与HAb18G/CD147相结合的多肽,从中寻找该因子的肽类拮抗剂,抑制肝癌的恶性转移.方法利用亲和层析法获得HAb18G/CD147抗原,在此基础上通过筛选噬菌体12肽库得到与HAb18G/CD147相结合的多肽,以固相法合成这些多肽并用质谱仪进行鉴定.后利用侵袭力抑制实验从中筛选拮抗肝癌细胞转移的功能多肽.结果经纯化的HAb18G/CD147分子量为65 000,Western blot验证结果阳性.用此纯化分子筛选噬菌体肽库,得到9条多肽.经体外功能验证,9条肽抑制肝癌细胞侵袭力的活性不一,其中3条有显著活性(P《0.01),活性好的一条肽能使穿过Boyden小室膜的肝癌细胞数量较对照减少90.1%.结论以亲和层析法和噬菌体随机肽库法相结合,筛选获得了有抗肝癌细胞侵袭力功能的多肽,此结果为抗肝癌转移肽类药物的研制奠定了基础.
关键词： 肝肿瘤 肿瘤转移 HAb18G/CD147拮抗剂 噬菌体肽库 -
应用噬菌体表面展示技术筛选丙型肝炎病毒核心蛋白抗原模拟表位
为筛选丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(core)特异性噬菌体12肽模拟表位,应用噬菌体表面展示技术,以抗-HCV核心蛋白抗原的单克隆抗体作为固相筛选分子,对人工化学合成的噬菌体随机12肽库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选过程,随机挑取50个克隆,经噬菌体酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定,并进行交叉反应实验以及竞争抑制性结合实验,后对所选克隆进行DNA序列分析,以确定HCV核心抗原的模拟表位.经免疫学鉴定后,从随机筛选的50个克隆中确定10个阳性克隆,进行DNA序列测定,确定氨基酸序列XRQXXPXXXHXX为HCV核心的模拟表位.本实验为开展用HCV模拟表位探索HCV的防治研究创造了条件.
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从噬菌体随机十二肽库中筛选NF-κB(p65)亲和肽的研究
目的:采用噬菌体展示技术筛选核转录因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)亚基p65亲和肽.方法:以p65亚基为靶分子,利用噬菌体随机十二肽库进行亲和筛选,用ELISA法进行阳性克隆结合特异性验证.结果:经过3轮亲和筛选后,随机挑选15个噬菌体克隆,对其亲和力做ELISA试验 ,其中 6个克隆显示较强的阳性结果.将上述6个阳性克隆DNA测序 ,序列均为CGTCAGCCTCGGCGAATAAGTATCCGAAGGAGTAAA,相应的氨基酸序列为FTPSDTYSPRLT.竞争性ELISA的结果显示,抑制率随p65亚基浓度的增大而升高.结论:从噬菌体随机肽库中筛选到能与NF-κB p65亚基特异性结合的克隆,并确定了其核心序列.
