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比较跨膜型和分泌型TNF-α的体内杀瘤效应及其机制
目的比较跨膜型和分泌型TNF-α在体内的抗瘤作用及机制. 方法在小鼠接种肿瘤细胞H22第3天,于肿瘤接种部位分别皮下注射插入TNF-α及其突变体基因的质粒DNA(分泌型TNF突变体、跨膜型TNF突变体和野生型TNF-α),观察肿瘤的生长情况,并用TUNEL检测肿瘤细胞是否发生凋亡;用免疫组化检测肿瘤局部淋巴细胞浸润和肿瘤组织表达的Fas和CD44V3. 结果 TNF-α及其突变体均可被肿瘤细胞有效表达,并都可明显抑制肿瘤的生长(P<0.01) ,其中跨膜型TNF突变体抑瘤作用强,可促进肿瘤表达Fas,引起肿瘤细胞发生明显凋亡,同时抑制其表达CD44V3(P<0.01);而分泌型TNF则可诱导肿瘤局部大量淋巴细胞(CD4+、CD8+)浸润(P<0.01),并引起肿瘤组织出血坏死. 结论直接注射跨膜型和分泌型TNF-α裸DNA均可在体内有效杀瘤.跨膜型TNF的体内杀瘤机制可能不同于分泌型TNF,前者可直接和通过Fas途径间接诱导瘤细胞凋亡;后者则可能通过募集和激活淋巴细胞发挥抗瘤作用.
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利用噬菌体肽库筛选TNF-α表位的相关短肽
目的从噬菌体肽库筛选TNF-α相关短肽,为临床上治疗肿瘤奠定基础. 方法用可溶性TNF受体Ⅰ(sTNFRⅠ)筛选噬菌体随机12肽库,利用细胞毒效应进行生物学效应筛选,再进行单链DNA测序. 结果分别得到若干模拟跨膜型TNF-α(TM-TNF-α)和模拟分泌型TNF-α(S-TNF-α)细胞毒效应的短肽,选择细胞毒效应好的模拟TM-TNF-α短肽进行人工合成,体外实验显示此肽段对S-TNF-α耐受肿瘤细胞系HL-60具有明显细胞毒效应,且主要引起靶细胞凋亡.另外,利用激光共聚焦显微镜证实该合成肽段不能诱导NF-κB发生核转位.结论获得模拟TM-TNF-α的短肽,为TM-TNF-α用于临床抗瘤治疗提供新线索.
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跨膜型与分泌型TNF对中性粒细胞功能的影响
目的比较跨膜型和分泌型TNF-α对中性粒细胞生物学功能影响的异同，以探讨两型TNF在炎症中的作用。方法通过吞噬、呼吸爆发、原位杂交等方法研究跨膜型和分泌型TNF-α对中性粒细胞生物学功能的影响。结果分泌型TNF-α可促进中性粒细胞吞噬(P<0.001)、呼吸爆发功能(P<0.05)及IL-1β mRNA水平的表达，对中性粒细胞产生NO无明显影响；跨膜型TNF-α对中性粒细胞吞噬、呼吸爆发功能无明显影响，对IL-1β mRNA水平的表达仅有微弱的促进作用，但可明显促进中性粒细胞产生NO。结论分泌型TNF-α对中性粒细胞有明显的激活作用，而跨膜型TNF-α则可能对其功能具有调节作用。
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跨膜型和分泌型TNF-α在内毒素性休克过程中的作用
目的研究跨膜型TNF-α(mTNF-α)的消长与内毒素性休克发生、发展的关系,探讨mTNF-α在内毒素性休克中的作用和机理. 方法首先使用埃希大肠杆菌死菌液制备大鼠内毒素性休克模型,并分不同时间点检测血清中的分泌型TNF-α(sTNF-α)、腹腔巨噬细胞表面上的 mTNF-α.然后,在给大鼠注射死菌液之前30 min,分别注射TNF转化酶(TACE)反义寡核甘酸(5mg/kg)或抗TNF-α多克隆抗体(5mg/kg).6 h后分别检测sTNF-α、mTNF-α水平;检查肺、肾等内脏器官的病理改变;并且监测各组大鼠的血压变化. 结果在内毒素性休克过程中,mTNF-α表达的动态变化不同于sTNF-α,mTNF-α在注射菌液30 min后开始升高,4.5 h达高峰,随后有所下降,但一直维持在较高水平.TACE反义寡核苷酸能有效地抑制mTNF-α转化为sTNF-α,使腹腔巨噬细胞表面上的mTNF-α表达明显增高(P＜0.001),使血压维持在正常水平,肺、肾等脏器无病理改变;抗TNF-α多克隆抗体能中和sTNF-α,其结果与前者基本相似. 结论内毒素性休克的病理过程主要与sTNF-α及其诱导的其它促炎细胞因子如IL-1β、IL-6、IL-8等有关,而mTNF-α则可抵抗内毒素的攻击,稳定血压,限制炎症反应及保护组织免受损伤,为临床治疗休克和感染性疾病提供了新的线索和实验依据.
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噬菌体展示TM-TNF-α模拟肽体内杀瘤效应的研究
目的研究噬菌体展示TM-TNF-α模拟肽的体内杀瘤效应及机制. 方法大量制备所需的噬菌体展示肽,比较不同展示肽对小鼠的肝癌细胞H22的体外杀瘤效应,挑取杀瘤效应好的展示肽并选择其合适的滴度进行体内实验.小鼠接种H22细胞3d后,于肿瘤接种部位皮下注射噬菌体展示肽,观察肿瘤的生长情况. 结果噬菌体展示TM-TNF-α模拟肽在体内能明显抑制肿瘤的生长(P<0.01).且抑瘤率与展示肽之间呈剂量依赖关系.HE染色发现展示肽治疗组肿瘤组织中有大量淋巴细胞浸润,而sTNF-α治疗组除淋巴细胞浸润还可见中性粒细胞、浆细胞浸润. 结论直接注射噬菌体展示TM-TNF-α模拟肽可在体内有效杀瘤,其杀瘤机制可能不同于分泌型TNF-α.
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PTK 对跨膜型与分泌型TNF-α诱导中性粒细胞功能的调节作用
目的:研究酪氨酸磷酸化激酶(PTK)对跨膜型(TM-TNFα)与分泌型TNF-α(S-TNF-α)诱导中性粒细胞呼吸爆发和NO释放的影响.方法:用化学发光法检测呼吸爆发,用硝酸还原酶法定量检测释放的NO,在体外观察PTK抑制剂对两型TNF-α诱导中性粒细胞以上功能的影响,并用Western印迹比较两型TNF-α诱导中性粒细胞蛋白酪氨酸磷酸化的异同.结果:PTK抑制剂Genistein(50umol/L)不仅可明显抑制S-TNF-α诱导的中性粒细胞呼吸爆发(P＜0.005),也可明显抑制TM-TNF-α诱导的中性粒细胞产生NO(P＜0.001).Western印迹显示大约17kD处,S-TNF-α介导的酪氨酸磷酸化条带比对照略强,而TM-TNF-α介导的酪氨酸磷酸化条带则明显增强;约于31kD处,出现由TM-TNF-α介导的酪氨酸磷酸化的特异性条带,而在其它处理组则均未发现.结论:两型TNF-α对中性粒细胞功能的影响均依赖于PTK的激活;但二者诱导酪氨酸磷酸化的程度及酪氨酸磷酸化的靶分子则存在差异.
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跨膜型TNF-α介导的反向信号对NK细胞杀伤功能的影响
目的:观察跨膜型TNF-α介导的反向信号对NK细胞杀伤功能的影响.方法:用sTNFRI激活NK92细胞的TM-TNF-α反向信号;MTT比色法检测NK92细胞对靶细胞的杀伤作用;β-己糖氨酶释放实验检测NK92细胞在杀伤靶细胞时的胞吐作用;ELISA实验检测NK92细胞sTNF-α的分泌;流式细胞术检测NK92细胞FasL的表达.结果:预先激活TM-TNF-α反向信号,可以促进NK92细胞对靶细胞的杀伤功能;增强NK92细胞的胞吐;促进FasL的表达和sTNF-α的分泌.结论:TM-TNF-α反向信号可能通过促进NK92细胞胞吐、sTNF-α分泌及FasL的表达而促进NK92细胞对靶细胞的杀伤.
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转染TNF-α及其突变体的成纤维细胞的杀瘤效应
目的:比较跨膜型和分泌型TNF-α在体内的抗瘤效应.方法:将3种TNF-α基因(分泌型TNF-x突变体,S-TN-Fm、跨膜型TNF-α突变体,TM-TNFm和野生型TNF-α,Wt-TNF)通过逆转录病毒载体转染成纤维细胞NIH/3T3;并用Southern印迹、RT-PCR、流式细胞仪和生物活性检测等方法,从基因的整合、RNA转录、蛋白的表达及其生物学活性4个方面对转染细胞进行检测鉴定.在小鼠接种肿瘤细胞的第3天,于接种部位分别皮下注射表达TNF-α及其突变体的NIH3T3细胞,效/靶比为5:1或1:1,观察这3种TNF-α的体内抗瘤效应.结果:NIH3T3转染细胞可表达高水平的TNFα及其突变体.在体外,NIH3T3/TM-TNFm的固定细胞、NIH3T3/S-TNFm的上清、NIH3T3/Wt-TNF的固定细胞和上清均可有效杀伤肿瘤细胞H22.在体内,当效/靶比为5:1时,注射NIH3T3/TM-TNFm的抑瘤效果强;而当效/靶比为1:1时,则NIH3T3/S-TNFm的疗效好.此外,在过继治疗期间未见明显副作用.结论:上述结果提示跨膜型和分泌型TNF-α均可在体内有效杀瘤;但如效/靶比适当,TM-TNF-α显示的杀瘤效应较S-TNF-α更强.
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TM-TNF-α模拟肽P18和S-TNF模拟肽P12的体外生物学活性的鉴定
目的:获得具有生物学活性的跨膜型TNF-α(TM-TNF-α)模拟肽.方法:以噬菌体扩增及PEG/NaCl沉淀法,大量制备所需的噬菌体展示肽.采用细胞毒实验、RT-PCR、Western blot印迹、凋亡检测实验分别检测TM-TNF-α模拟肽的杀瘤效应、对SODD mRNA表达水平、NF-κB核转位及致死亡方式的影响.结果:噬菌体展示肽P12和P18分别能模拟sTNF-α和TM-TNF-α的生物学活性.结论:获得能模拟TM-TNF-α的生物学活性的展示肽,为TM-TNF-α用于临床抗瘤治疗提供新线索.
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跨膜型TNF-α单克隆抗体腺病毒表达载体的构建和鉴定
目的:应用AdEasy-1系统构建包含tmTNF-α单克隆抗体轻、重链序列的重组腺病毒表达载体.方法:首先PCR合成抗体轻、重链序列,分别将轻、重链序列插入经过改造的含有双启动子的穿梭质粒pShuttle-2CMV,将穿梭载体电转化转化AdEasy系统B J5183感受态,挑取单克隆扩增质粒后酶切鉴定.结果:成功构建重组腺病毒表达载体pAdEasy-tmTNF-α,抗体重链、轻链序列酶切后经1％琼脂糖凝胶电泳证实条带片段大小正确,电转化B J5183后挑选重组克隆提取质粒,PacI酶切后重组片段位于4.5kb及3kb位置,证明重组腺病毒质粒pAdeasy-1-tmTNF-α构建成功.结论:将腺病毒系统与单克隆抗体技术相结合,利用AdEasy-1系统成功构建腺病毒重组tmTNF-α单克隆抗体表达载体,为进一步开展肿瘤基因治疗的研究提供基础.
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跨膜型TNF-α与NF-κB在三阴性乳腺癌中的表达及其意义
目的:探讨跨膜型TNF-α与磷酸化NF-κB在三阴性乳腺癌(TNBC)中的表达及其临床意义.方法:采用免疫组化法检测52例三阴性乳腺癌与30例非三阴性乳腺癌组织中跨膜型TNF-α与磷酸化NF-κB的表达,并分析其与三阴性乳腺癌各临床指标的相关性.结果:跨膜型TNF-a与磷酸化NF-κB在三阴性乳腺癌中的阳性表达率分别为82.7％(43/52)和67.3％(35/52),均显著高于非三阴性乳腺癌,差异具有统计学意义(P＜0.05).在三阴性乳腺癌中,跨膜型TNF-α及磷酸化NF-κB的表达与肿瘤大小和淋巴结转移与否显著相关(P＜0.05),且跨膜型TNF-α与磷酸化NF-κB的表达呈显著正相关(P＜0.05).结论:跨膜型TNF-α及磷酸化NF-κB高表达可能预示着TNBC更差的化疗敏感性和预后,有望成为TNBC预后的重要预测因子.跨膜型TNF-α通过激活磷酸化NF-κB激活其下游的抗凋亡和促增殖因子,与三阴性乳腺癌的发生发展有关.
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急性肝组织损伤跨膜型肿瘤坏死因子α表达变化及意义
目的 探讨急性肝组织损伤跨膜型肿瘤坏死因子α(tmTNF-α)表达变化及其与肝组织损伤的关系.方法 用脂多糖(LPS)和D-氨基半乳糖(D-gal)建立鼠急性肝损伤模型,采用免疫组化检测肝组织tmTNF-α的表达,HE染色检测肝组织损伤;采用蛋白酶法分离肝脏库普弗细胞(KCs),以CD11b和F4/80为标志,采用流式细胞术鉴定KCs,同时检测LPS/D-gal处理后不同时间KCs tmTNF-α表达水平.结果 LPS/D-gal处理后6h,肝组织tmTNF-α表达显著增加,tmTNF-α主要来源于KCs;tmTNF-α表达与肝组织损伤是一致的.结论 tmTNF-α表达与严重肝组织损伤密切相关.
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乳腺癌NFAT对tmTNF-α基因转录的调节作用
目的 研究乳腺癌NFAT对跨膜型肿瘤坏死因子α(tmTNF-α)基因转录的调节作用.方法 构建质粒,FACS检测内源性tmTNF-α的表达,Westemblot检测内源性NFAT的活化;采用ChIP法对人的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7分析NFAT1对tmTNF-α启动子的结合;给予低表达tmTNF-α的乳腺癌细胞系MCF-7 NFAT的刺激剂PMA/iono以促进其入核活化;给予高表达tmTNF-α的乳腺癌细胞系MDA-MB-231NFAT的抑制剂VIVIT以阻止其入核.结果 人乳腺癌细胞MDA-MB-231高表达tmTNF-α(89.2％),而MCF-7几乎不表达tmTNF-α(1.0％);高表达tmTNF-α的MDA-MB-231细胞中不仅存在细胞浆中表达的非活化蛋白pNFAT1,在细胞核中也检测到其活化形式蛋白NFAT1;而在MCF-7中没有检测到NFAT1活化蛋白的表达;根据特异性启动子引物,MDA-MB-231的染色质样品可检测到相应的目的片段,说明该细胞系中存在NFAT1对tmTNF-α启动子的结合.而在MCF-7中没有出现可看到的目的片段.Western blot检测到tmTNF-α的表达显著增加,提示在乳腺癌细胞MCF-7,PMA/iono可促进NFAT活化,通过对转录活性的调节促进tmTNF--α的表达;给予高表达tmTNF-α的乳腺癌细胞系MDA-MB-231NFAT的抑制剂VIVIT以阻止其入核,West-ern blot检测到tmTNF-α的表达明显减少.结论 可通过抑制NFAT1来影响tmTNF-α的表达.
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TNFR2基因敲除小鼠H22移植瘤生长特点和Treg数量与功能检测
目的 观察tmTNF-α/TNFR2信号轴对荷瘤鼠肿瘤生长影响及其机制.方法 采用Western blot检查H22荷瘤鼠肿瘤微环境中Treg细胞TNFR1及TNFR2的表达.TNFR2敲除BALB/c小鼠和野生型鼠各10只,在TNFR2敲除的BALB/c小鼠皮下接种H22肝癌细胞株,观察肿瘤直径及肿瘤微环境中Treg的募集数量,同时以野生型小鼠做对照.用tmTNF-α刺激Treg细胞,ELISA检测上清IL-10和TGF-β的含量.结果 荷瘤鼠微环境中Treg细胞TNFR2表达明显高于野生型小鼠脾脏Treg细胞(P＜0.05),而TNFR1表达未见明显变化;TNFR2基因敲除鼠肿瘤直径明显低于野生型小鼠(P＜0.05),且肿瘤微环境中Treg细胞数量也明显少于野生型小鼠(P＜0.05).在体外tmTNF-α可以促进Treg细胞产生IL-10和TGF-β(P ＜0.05).结论 TNFR2基因敲除小鼠肿瘤生长减缓,肿瘤局部微环境中Treg细胞减少,同时tmTNF-e能够刺激Treg细胞释放抑炎因子IL-10和TGF-β,增强其免疫抑制功能.
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ω-3脂肪酸联合跨膜型TNF-α对MCF-7细胞凋亡的影响及机制研究
目的探讨半胱氨酸蛋白酶(caspase)在ω-3脂肪酸联合细胞外源性跨膜型TNF-α诱导MCF-7细胞凋亡过程中的作用.方法带有脂肪酸受体反应元件的跨膜型TNF-α表达载体转染MCF-7细胞,经ω-3脂肪酸处理后,MTT比色法检测细胞增殖能力, DNA梯形带分析ω-3脂肪酸对细胞凋亡的影响,RT-PCR和Western blot方法检测细胞caspase-1、8和9基因的表达变化,应用caspase特异性底物检测肿瘤细胞caspase-8活性变化,观察caspase特异性抑制剂Ac-IETD-CHO对ω-3脂肪酸联合细胞外源性跨膜型TNF-α抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡的拮抗作用.结果与MCF-7细胞相比,MCF-7转染细胞经ω-3脂肪酸处理后,细胞增殖能力减弱,检测到明显的DNA梯形带,caspase-1、8、9基因表达增加,caspase-8活性增高,caspase抑制剂可以部分拮抗ω-3脂肪酸联合跨膜型TNF-α抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的发生.结论ω-3脂肪酸联合跨膜型TNF-α可以更有效地诱导MCF-7细胞凋亡,而上调caspase的表达和/或活性可能在此过程中发挥重要作用.
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两型TNF-α的细胞毒效应与靶细胞内Ca2+浓度变化的关系
目的: 比较分泌型TNF-α(S-TNF-α)和跨膜型TNF-α(TM-TNF-α)发挥细胞毒效应时,引起靶细胞内Ca2+浓度的变化.方法: 采用生物学活性检测法, 观察两型TNF-α对不同靶细胞的杀伤效应; 用Fura-2检测细胞内Ca2+浓度的变化.结果: TM-TNF-α可杀伤实验所用6株靶细胞; 而S-TNF-α则仅对其中两株有细胞毒效应. 两型TNF-α杀伤靶细胞时, 均伴有明显的Ca2+浓度升高.用钙螯合剂EGTA(10 mmol/L)预先处理靶细胞30 min, 只能降低S-TNF-α作用的靶细胞内的Ca2+浓度, 并使其细胞毒效应明显减弱(P《0.01); 对TM-TNF-α无影响.结论: 两型TNF-α发挥细胞毒效应时, 均可引起靶细胞内钙离子的重分布, 导致靶细胞内Ca2+浓度的升高, 但S-TNF-α的作用还可能与促进胞外Ca2+内流有关.
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两型TNF-α对单核细胞系U937细胞功能的影响
目的: 比较两型TNF-α对单核细胞系U937细胞功能的影响, 以探讨跨膜型TNF-α在炎症中的作用.方法: 通过吞噬、 RT-PCR、 Western blot及FACS等方法, 比较两型TNF-α对U937细胞生物学功能(包括吞噬、细胞因子mRNA、胞质IκB-α及ICAM-1表达等)的影响.结果: 分泌型TNF-α可明显促进U937细胞吞噬功能, 使TNF-α、IL-1β及IL-8 mRNA积累增加, 促进胞质IκB-α降解及提高黏附分子ICAM-1的表达; 而跨膜型TNF-α对上述U937细胞的生物学功能则无明显影响.当二者联用时, 跨膜型TNF-α与分泌型TNF-α亦无协同作用.结论: 分泌型TNF-α对U937细胞具有明显地激活作用; 而跨膜型TNF-α则无影响, 提示两型TNF-α在炎症过程中的作用不同.
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稳定高效表达TNF-α基因及其突变体的H22肿瘤细胞株的建立
目的建立转染3种TNF-α基因(分泌型TNF-α突变体、跨膜型TNF-α突变体和野生型TNF-α的H22细胞株,以比较不同类型TNF-α的杀瘤效应.方法采用逆转录病毒载体,将3种TNF-α基因导入小鼠H22肿瘤细胞中,用Southern印迹、RT-PCR、流式细胞术和生物学活性检测等方法,从基因的整合、RNA转录、蛋白的表达及其生物学活性4个方面,对转染细胞进行检测鉴定.结果 3种TNF-α基因均在H22细胞中得到有效表达,并具有生物学活性.结论获得3种稳定高效表达TNF-α的H22肿瘤细胞株,为进一步研究跨膜型和分泌型TNF-α体内的抑瘤效应建立了良好的实验模型.
