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比较跨膜型和分泌型TNF-α的体内杀瘤效应及其机制
目的比较跨膜型和分泌型TNF-α在体内的抗瘤作用及机制. 方法在小鼠接种肿瘤细胞H22第3天,于肿瘤接种部位分别皮下注射插入TNF-α及其突变体基因的质粒DNA(分泌型TNF突变体、跨膜型TNF突变体和野生型TNF-α),观察肿瘤的生长情况,并用TUNEL检测肿瘤细胞是否发生凋亡;用免疫组化检测肿瘤局部淋巴细胞浸润和肿瘤组织表达的Fas和CD44V3. 结果 TNF-α及其突变体均可被肿瘤细胞有效表达,并都可明显抑制肿瘤的生长(P<0.01) ,其中跨膜型TNF突变体抑瘤作用强,可促进肿瘤表达Fas,引起肿瘤细胞发生明显凋亡,同时抑制其表达CD44V3(P<0.01);而分泌型TNF则可诱导肿瘤局部大量淋巴细胞(CD4+、CD8+)浸润(P<0.01),并引起肿瘤组织出血坏死. 结论直接注射跨膜型和分泌型TNF-α裸DNA均可在体内有效杀瘤.跨膜型TNF的体内杀瘤机制可能不同于分泌型TNF,前者可直接和通过Fas途径间接诱导瘤细胞凋亡;后者则可能通过募集和激活淋巴细胞发挥抗瘤作用.
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噬菌体展示TM-TNF-α模拟肽体内杀瘤效应的研究
目的研究噬菌体展示TM-TNF-α模拟肽的体内杀瘤效应及机制. 方法大量制备所需的噬菌体展示肽,比较不同展示肽对小鼠的肝癌细胞H22的体外杀瘤效应,挑取杀瘤效应好的展示肽并选择其合适的滴度进行体内实验.小鼠接种H22细胞3d后,于肿瘤接种部位皮下注射噬菌体展示肽,观察肿瘤的生长情况. 结果噬菌体展示TM-TNF-α模拟肽在体内能明显抑制肿瘤的生长(P<0.01).且抑瘤率与展示肽之间呈剂量依赖关系.HE染色发现展示肽治疗组肿瘤组织中有大量淋巴细胞浸润,而sTNF-α治疗组除淋巴细胞浸润还可见中性粒细胞、浆细胞浸润. 结论直接注射噬菌体展示TM-TNF-α模拟肽可在体内有效杀瘤,其杀瘤机制可能不同于分泌型TNF-α.
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激光免疫疗法对小鼠H22肝癌的长期抗瘤效应
目的 观察激光免疫疗法对小鼠H22肝癌的抗瘤效应.方法 昆明种小鼠240只,随机分为4组,每组60只.光动力学组:小鼠腹腔内注射HpD10mg/kg后48h行激光照射(功率320W,时间400s,能量130J);激光免疫组:处理同前组,另于照光前12h小鼠瘤内及瘤周注射糖基化氨基葡糖(GC)0.2ml/只;单纯GC组:仅于瘤内及瘤周注射GC;对照组:不做任何处理.比较前3个实验组的抑瘤率、生存率.结果 3实验组小鼠均有显著抑瘤效果,激光免疫组的抑瘤率、生存率较单纯免疫佐剂治疗组和光动力学治疗组有显著提高,激光免疫组23.3%肿瘤治愈小鼠长期存活.结论 激光免疫疗法对小鼠H22肝癌显示出长期抗瘤效应,该疗法可能成为一种长期有效的综合治疗肿瘤新方法.
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盐酸洛拉曲克长循环脂质体的制备及其对肝癌细胞的体外毒性
目的:研制出具有缓释作用的盐酸洛拉曲克长循环脂质体并考察其理化特性以及在体外的抗瘤效应.方法:用两亲性聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEGDSPE)对脂质体膜进行修饰,以薄膜挤压-硫酸铵梯度法制备盐酸洛拉曲克长循环脂质体;用MTT法比较盐酸洛拉曲克长循环脂质体与盐酸洛拉曲克普通脂质体及游离的盐酸洛拉曲克的体外细胞毒性.结果:制备的盐酸洛拉曲克隐形脂质体包封率达68%左右,粒径110nm左右;与普通脂质体及游离的盐酸洛拉曲克相对照,长循环脂质体显示了较好长效的毒性作用,2 h组长循环脂质体的ID50明显高于另外两组,而48 h组的ID50则与另外两组无显著差别.结论:新制备的盐酸洛拉曲克长循环脂质体在体外显示了其较好的缓释效应,可以弥补盐酸洛拉曲克在体内半衰期比较短的缺点.
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树突状细胞介导的T细胞抗多发性骨髓瘤细胞活性的研究
多发性骨髓瘤(MM)是B细胞来源的恶性肿瘤.化疗和造血干细胞移植等综合治疗,可获得较高的缓解率,但微小残留病的存在,使骨髓瘤易复发.树突状细胞(DC)为基础的免疫治疗是近几年来治疗MM的热点之一.国外报道[1]用凋亡的骨髓瘤细胞或分泌的异常单克隆Ig,即M蛋白脉冲DC,得到DC瘤苗,再回输体内,可以观察到骨髓瘤特异的抗瘤效应.本实验体外诱导培养DC,负载骨髓瘤细胞全抗原或分泌的M蛋白,探讨负载抗原的DC对淋巴细胞的活化作用及活化的淋巴细胞对自体、异体骨髓瘤细胞的杀伤活性.
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放射联合内皮抑素对人鼻咽癌细胞系VEGF表达及放射敏感性作用的研究
在所有内源性血管生成抑制因子中,内皮抑素拥有广的抗瘤谱和小的毒性,且不产生耐药性~([1]).内皮抑素与放疗联合应用可改善放疗疗效,增强抗瘤效应,而不增加毒副反应.
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HSP70-Id复合物修饰的树突状细胞体外诱导特异性抗肿瘤作用
目的 观察人慢性B淋巴细胞性白血病(B-CLL)细胞的独特型抗原Id-ScFv与热休克蛋白70(HSP70)形成复合物修饰的树突状细胞(DC)体外诱导特异性抗肿瘤作用,并初步探讨其机制.方法 将HSP70与Id-ScFv体外结合形成复合物HSP70-Id,修饰自人外周血单核细胞获取的DC.倒置相差显微镜观察DC的形态特征,流式细胞仪检测修饰前后DC的表型变化,酶联免疫吸咐试验(ELISA)检测DC分泌的白细胞介素12(IL-12)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α),四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测修饰的DC对自身淋巴细胞的激活和增殖作用,流式细胞仪检测激活的自身淋巴细胞T细胞亚群的变化,台盼蓝染色法检测其对Daudi、K562和HepG2等细胞的杀伤作用.结果 DC体外诱导培养成功,HSP70-Id复合物可使DC成熟,镜下可见典型的DC形态,其CD1a表达率为20%～30%,CD83表达率＞72%,CD86和HLA-DR表达显著增加(P＜0.05),上清中IL-12、TNF-α亦显著高于DC对照组(P＜0.01).HSP70-Id复合物修饰的DC激活自身淋巴细胞,对Daudi细胞的杀伤率为71.24%,而对K562细胞杀伤作用较弱,对HepG2细胞无明显作用.其淋巴细胞亚群中,CD4+T细胞、CD8+T细胞的比例均显著增加,分别为56.51%和70.21%,CD4+T细胞/CD8+T细胞比值由空白对照组的1.49倒置为0.81.结论 HSP70-Id复合物修饰的DC生物学活性增强,经其刺激后,传代培养的淋巴细胞可产生高效而特异性的抗肿瘤免疫效应,可能是CD4+T细胞、CD8+T细胞及DC协同作用的结果.
关键词： HSP70-Id复合物 树突状细胞 抗瘤效应 -
OK-432联合IL-2对C57BL/6小鼠Lewis肺癌的抑制作用及c-fos蛋白的表达
目的研究OK-432与IL-2抑制近交系小鼠C57BL/6 Lewis肺癌(LLC)的生长及c-fos蛋白的表达。方法以C57BL/6荷瘤LLC小鼠为模型，观察OK-432联合IL-2对肿瘤发生、生长、转移的影响，体内对肿瘤细胞的作用及用抗鼠c-fos单克隆抗体进行SABC免疫组化技术半定量测定c-fos在Lewis肺癌原发灶中的表达。结果二者联用对肿瘤体积和重量的抑制作用明显增强(P＜0.01)，增强抑瘤率(P＜0.05)，肺转移灶数目明显减少。电镜下显示肿瘤灶中出现许多凋亡细胞，瘤细胞核染色质浓集成块，在核膜内呈新月形或环形排列，核膜清楚，瘤细胞内质网扩张，线粒体肿胀。c-fos在联合用药组与对照组比较明显减少(P＜0.01)。结论 OK-432与IL-2有明显的协同抗肿瘤活性，其杀瘤过程主要为对瘤细胞的直接或间接攻击，和促进体内对多种反应细胞的相互作用；部分原因可能阻抑c-fos癌基因的表达；提示OK-432联合IL-2可为临床治疗癌症患者一种有效的生物治疗方法。
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人核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及其体内外抗瘤效应研究
目的 构建人核心蛋白聚糖(human decorin,hDCN)pcDNA3.1(+)真核表达载体,并探讨其对S180细胞在体内、体外的抗肿瘤效应及其作用机制.方法 用PCR法从pPIC9K-DCN扩增hDCN核心蛋白分子编码序列的全长cDNA,与pcDNA3.1(+)载体连接.将重组pcDNA3.1(+)- DCN质粒通过脂质体转染法转入小鼠肿瘤细胞S180中,用G418筛选出阳性克隆细胞,RT-PCR、双酶切及测序鉴定.流式细胞仪对转染了重组质粒pcDNA3.1(+) - DCN、空质粒pcDNA3.1(+)的S180细胞和未转染的S180细胞进行细胞凋亡检测和细胞周期分析.分别注射等量的pcDNA3.1(+) - DCN/S180、pcDNA3.1(+)/S180的细胞和未转染质粒的S180细胞到随机分组的小鼠腋部皮下,观察三组小鼠的肿瘤生长情况;处死三组小鼠后,分别剥离肿瘤组织做病理学检查.结果 转染了DCN的S180细胞凋亡指数明显增高,G0/G1期细胞百分率明显高于其他两组,G2/M期、S期细胞百分率分别明显低于其他两组(P<0.01).与注射pcDNA3.1(+)/S180和S180的小鼠相比,注射pcDNA3.1(+) - DCN/S180的小鼠肿瘤生长速度明显减慢,肿瘤体积小于其他两组(P<0.01).结论 成功构建了人核心蛋白聚糖真核表达载体.体外实验结果 显示转染该表达载体的S180细胞凋亡指数明显增高,且凋亡多发生在G0/G1期;转染DCN表达载体的S180细胞在实验动物体内成瘤性降低,提示转染DCN在实验动物体内外都能表现抑瘤效应.
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超抗原SEB诱导人自然杀伤细胞杀瘤条件优化
目的 通过正交设计优化自然杀伤(NK)细胞佳杀瘤条件.方法 补体裂解法分离NK细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定NK细胞杀瘤活性,正交设计选择NK细胞佳杀瘤条件.结果 在葡萄球菌肠毒素B(SEB)浓度为10-7kg/L,SEB作用NK细胞时间为24 h,NK细胞与肿瘤细胞之比为20:1条件下,NK细胞杀瘤活性强.结论 NK细胞佳杀瘤条件组合为SEB10-7kg/L,作用时间24h,效靶比20:1.
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转染TNF-α及其突变体的成纤维细胞的杀瘤效应
目的:比较跨膜型和分泌型TNF-α在体内的抗瘤效应.方法:将3种TNF-α基因(分泌型TNF-x突变体,S-TN-Fm、跨膜型TNF-α突变体,TM-TNFm和野生型TNF-α,Wt-TNF)通过逆转录病毒载体转染成纤维细胞NIH/3T3;并用Southern印迹、RT-PCR、流式细胞仪和生物活性检测等方法,从基因的整合、RNA转录、蛋白的表达及其生物学活性4个方面对转染细胞进行检测鉴定.在小鼠接种肿瘤细胞的第3天,于接种部位分别皮下注射表达TNF-α及其突变体的NIH3T3细胞,效/靶比为5:1或1:1,观察这3种TNF-α的体内抗瘤效应.结果:NIH3T3转染细胞可表达高水平的TNFα及其突变体.在体外,NIH3T3/TM-TNFm的固定细胞、NIH3T3/S-TNFm的上清、NIH3T3/Wt-TNF的固定细胞和上清均可有效杀伤肿瘤细胞H22.在体内,当效/靶比为5:1时,注射NIH3T3/TM-TNFm的抑瘤效果强;而当效/靶比为1:1时,则NIH3T3/S-TNFm的疗效好.此外,在过继治疗期间未见明显副作用.结论:上述结果提示跨膜型和分泌型TNF-α均可在体内有效杀瘤;但如效/靶比适当,TM-TNF-α显示的杀瘤效应较S-TNF-α更强.
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HPD毫米波远位照射对小鼠肝癌的放射增敏抗瘤效应
高功率密度(High Power Density,HPD)毫米波在临床上远位照射对非表浅恶性肿瘤有较好的放射增敏疗效,但未经动物实验研究证实.为此,本研究用小鼠肝癌动物模型进行研究,探针HPD毫米波远位照射对小鼠肝癌的抗瘤效应及放射增敏抗瘤效应.
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重组复制缺陷型腺病毒Ad-p53AIP1的抗肿瘤效应及其作用机制
目的:探讨外源性p53AIP1(p53-regulated apoptosis-inducing protein 1)基因抗肿瘤效应及其作用机制,以评估p53AIP1基因在肿瘤基因治疗中应用的可行性.方法:构建携带p53AIP1基因的重组复制缺陷型腺病毒Ad-p53AIP1,感染人肝癌细胞HepG2,应用MTT比色法、Western blotting、流式细胞术、罗丹明染色以及电镜等观察外源性p53AIP1基因表达对肿瘤细胞的作用及其相关机制.小鼠皮下接种感染Ad-p53AIP1的小鼠乳腺癌4T1细胞,观察Ad-p53AIP1对肿瘤细胞体内成瘤性的影响;建立4T1细胞皮下移植瘤小鼠模型, 直接瘤内多点注射重组腺病毒,观察Ad-p53AIP1的抗肿瘤疗效.结果:感染Ad-p53AIP1的HepG2细胞能够高效表达P53AIP1蛋白.MTT检测显示Ad-p53AIP1对人肝癌细胞HepG2的生长抑制率达50%以上;流式细胞术分析证实p53AIP1使肿瘤细胞周期阻滞于G2/M期;罗丹明染色、电镜观察以及凋亡相关蛋白PARP表达的检测均证实p53AIP1能诱导肿瘤细胞发生明显凋亡.感染Ad-p53AIP1的肿瘤细胞体内成瘤受到非常明显的抑制(P<0.01), Ad-p53AIP1瘤体注射对移植瘤生长也有明显的抑制作用(P<0.05).Western blotting以及RT-PCR检测证实Ad-p53AIP1对p53 mRNA表达无影响,能下调mdm2基因的表达;p53AIP1能上调P53蛋白的表达、下调MDM2蛋白的表达水平,同时还影响P21等细胞周期相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达.结论:p53AIP1有明显的体内外抗肿瘤作用,其作用机制与其反向调控P53蛋白、调控多种细胞周期和细胞凋亡相关蛋白、诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡有关,该基因在肿瘤基因治疗中具有潜在的应用前景.
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体外构建的HTA-HSP70BCG冲激的树突状细胞疫苗的抗肿瘤作用
目的 观察体外构建的榄香烯复合瘤苗抗原-卡介苗热休克蛋白70复合物(HTA-HSP70BCG)诱导的树突状细胞疫苗的抗肿瘤效应.方法 来源于小鼠的肝癌Hca-F榄香烯复合疫苗的抗原(HTA)与卡介苗来源的HSP70(HSP70BCG)在体外构建成HTA-HSP70BCG复合物,用GM-CSF和IL-4诱导树突状细胞(DCs),分别用HTA-HSP70BCG、HTA和HSP70BCG对其冲激.用MTT法检测该DCs刺激的全脾细胞的增殖活性及被刺激的脾细胞的细胞毒活性.用流式细胞仪检测DCs表面CD86和CD40的表达.结果 体外构建HTA-HSP70BCG可以诱导DCs成熟,表现为DCs表达CD86和CD40上调,该DCs可以刺激全脾细胞增殖并使其产生特异性杀瘤活性,其强度明显大于HTA.结论 体外构建HTA-HSP70BCG复合物可以诱导DCs成熟,该DCs可以激活脾细胞产生较强的特异性抗瘤效应.
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OK-432联合IL-2对Lewis肺癌及c-fos蛋白表达的抑制作用
目的 研究OK-432与IL-2抑制近交系小鼠C57BL/6Lewis肺癌(LLC)的生长及c-fos蛋白的表达.方法 以C57BL/6荷瘤LLC小鼠为模型,观察OK-432联合IL-2对肿瘤发生、生长转移的影响,及用抗鼠c-fos单克隆抗体进行SABC免疫组化技术半定量测定c-fos在Lewis肺癌原发灶中的表达.结果 二者联用对肿瘤体积和重量的抑制作用明显增强(P＜0.01),增强抑瘤率(P＜0.01),肺转移灶数目明显减少.光镜下显示肿瘤灶中出现许多凋亡细胞;肿瘤组织电镜观察,瘤细胞核染色质浓集成块,在核膜内呈新月形或环形排列,核膜清楚,瘤细胞内质网扩张,线粒体肿胀.c-fos在联合用药组与对照组比较明显减少(P＜0.01).结论 OK-432与IL-2有明显的协同抗肿瘤活性,部分原因可能阻抑c-fos基因的表达;提示OK-432联合IL-2可望为临床治疗癌症患者提供一种有效的生物治疗方法.
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塞来昔布联合替莫唑胺对胶质瘤U251细胞作用研究
目的 探讨环氧合酶抑制剂塞来昔布联合抗肿瘤药物替莫唑胺对神经胶质瘤细胞系U251细胞的体外抗瘤效应及其可能机制.方法 分别使用塞来昔布、替莫唑胺和两者联合用药干预U251细胞;显微镜下观察细胞形态学变化;以甲基噻唑基四唑比色法检测药物对U251细胞增殖的影响;细胞划痕实验观察药物对U251细胞迁移能力的影响;采用膜联蛋白Ⅴ-碘化丙啶双染色通过流式细胞仪检测药物对肿瘤细胞凋亡的影响;Western Blot法检测药物对U251细胞中Bcl-2和Bax表达的影响.结果 药物处理后,U251细胞出现明显的形态学改变,以联合用药组细胞为显著;当塞来昔布与替莫唑胺联合应用时,显著增强替莫唑胺对U251细胞增殖的抑制效应,抑制细胞迁移,并促进其凋亡;塞来昔布和替莫唑胺联合作用后,U251细胞Bax表达增高、Bcl-2表达降低.结论 塞来昔布和替莫唑胺联合应用可以协同抑制肿瘤细胞增殖、迁移,促进细胞凋亡;其促进细胞凋亡的机制可能与Bax表达的上调以及Bcl-2表达的下调有关.
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OK-432联合IL-2对C57BL/6小鼠LeWis肺癌的抑制作用及p21的表达
目的研究OK-432与IL-2抑制近交系小鼠C57BL/6 Lewis肺癌(LLC)的生长及p21的表达. 方法以C57BL/6荷瘤LLC小鼠为模型,观察OK-432联合IL-2对肿瘤发生、生长、转移的影响,体内对肿瘤细胞的作用及用抗鼠p21单克隆抗体进行SABC免疫组化技术半定量测定p21在Lewis肺癌原发灶中的表达.结果二者联用对肿瘤体积和重量的抑制作用明显增强(P＜0.01),增强抑瘤率(P＜0.05),肺转移灶数目明显减少.电镜下显示肿瘤灶中出现许多凋亡细胞,瘤细胞核染色质浓集成块,在核膜内呈新月形或环形排列,核膜清楚,瘤细胞内质网扩张,线粒体肿胀.p21在联合用药组表达明显减少.结论 OK-432与IL-2有明显的协同抗肿瘤活性,其杀瘤过程主要为对瘤细胞的直接或间接攻击,部位原因可能阻抑ras癌基因的激活,诱导瘤细胞凋亡;提示OK-432联合IL-2可为临床治疗癌症患者一种有效的生物治疗方法.
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OK-432和IL-2联合用药对C57BL/6 小鼠Lewis肺癌的抑制作用及Bcl-2表达的影响
目的 研究A组溶血性链球菌冻干生物制剂OK-432联合白细胞介素2（IL-2）对小鼠C57BL/6Lewis 肺癌（LLC）生长的抑制作用及对Bcl-2表达的影响。方法 将40只C57BL/6荷瘤LLC小鼠分4组，分别用生理盐水、OK-432、IL-2和OK-432联合IL-2处理，观察用药后肿瘤生长的状况, 用抗鼠bcl-2单克隆抗体进行SABC免疫组化技术半定量测定Bcl-2在Lewis肺癌原发灶中的表达。结果 OK-432/IL-2抑制肿瘤作用强，抑瘤率为60%，（P<0.05）。对照组中的Bcl-2的表达明显高于联合用药组（P<0.05）。结论 OK-432与IL-2有明显的协同抗肿瘤活性，其杀瘤过程主要为对瘤细胞的直接或间接攻击，并促进体内多种反应细胞相互作用，其机制可能与抑制Bcl-2基因的表达、诱导瘤细胞的凋亡有关。
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造血干细胞移植自体造血干细胞移植微小残留病净化
造血干细胞移植(HSCT)是当今治疗白血病和某些实体瘤的主要和有效的手段,甚至是治愈的唯一方法.但是,HSCT后仍有相当一部分病人复发,复发的根源与微小残留病(MRD)有关.因此,HSCT中的MRD治疗是影响疗效的关键,包括AHSCT(自体)和Allo-HSCT(异体).AHSCT与Allo-HSCT相比较其复发率高,原因有二:一是移植物中含有MRD,二是缺乏Allo-HSCT具有的移植物抗瘤(白血病)效应(GVL).针对这两个原因,目前解决的主要手段包括:对移植物进行体外净化;移植后应用免疫调节剂诱导或放大自身免疫诱导抗瘤效应;以及在移植前进行有效的强烈化疗,尽量减少移植物中及移植时体内MRD的负载.
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HER2/neu诱导DBA/2小鼠特异性CTL应答及其抑瘤效应研究
目的探讨HER2/neu原癌基因DNA疫苗免疫诱导特异性细胞免疫应答及其在体内的抑瘤效应.方法将重组HER2/neu原癌基因真核表达载体转染P815细胞,用细胞组织化学及Western-blot方法鉴定质粒在细胞中的表达.在DBA/2小鼠体内构建表达HER2抗原的肿瘤动物模型,通过重组质粒免疫小鼠,诱导小鼠产生细胞免疫应答,观察免疫动物体内的抗瘤效应.结果在体外获得了稳定表达HER2/neu基因的P815细胞;免疫小鼠脾细胞中诱导出特异性CTL,并杀伤HER2/neu阳性的P815细胞;荷瘤小鼠的肿瘤生长受抑,存活期延长.结论 HER2/neu原癌基因DNA疫苗免疫可诱导特异性细胞免疫应答,并具有一定抗瘤效应.
