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比较跨膜型和分泌型TNF-α的体内杀瘤效应及其机制
目的比较跨膜型和分泌型TNF-α在体内的抗瘤作用及机制. 方法在小鼠接种肿瘤细胞H22第3天,于肿瘤接种部位分别皮下注射插入TNF-α及其突变体基因的质粒DNA(分泌型TNF突变体、跨膜型TNF突变体和野生型TNF-α),观察肿瘤的生长情况,并用TUNEL检测肿瘤细胞是否发生凋亡;用免疫组化检测肿瘤局部淋巴细胞浸润和肿瘤组织表达的Fas和CD44V3. 结果 TNF-α及其突变体均可被肿瘤细胞有效表达,并都可明显抑制肿瘤的生长(P<0.01) ,其中跨膜型TNF突变体抑瘤作用强,可促进肿瘤表达Fas,引起肿瘤细胞发生明显凋亡,同时抑制其表达CD44V3(P<0.01);而分泌型TNF则可诱导肿瘤局部大量淋巴细胞(CD4+、CD8+)浸润(P<0.01),并引起肿瘤组织出血坏死. 结论直接注射跨膜型和分泌型TNF-α裸DNA均可在体内有效杀瘤.跨膜型TNF的体内杀瘤机制可能不同于分泌型TNF,前者可直接和通过Fas途径间接诱导瘤细胞凋亡;后者则可能通过募集和激活淋巴细胞发挥抗瘤作用.
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跨膜型与分泌型TNF对中性粒细胞功能的影响
目的比较跨膜型和分泌型TNF-α对中性粒细胞生物学功能影响的异同，以探讨两型TNF在炎症中的作用。方法通过吞噬、呼吸爆发、原位杂交等方法研究跨膜型和分泌型TNF-α对中性粒细胞生物学功能的影响。结果分泌型TNF-α可促进中性粒细胞吞噬(P<0.001)、呼吸爆发功能(P<0.05)及IL-1β mRNA水平的表达，对中性粒细胞产生NO无明显影响；跨膜型TNF-α对中性粒细胞吞噬、呼吸爆发功能无明显影响，对IL-1β mRNA水平的表达仅有微弱的促进作用，但可明显促进中性粒细胞产生NO。结论分泌型TNF-α对中性粒细胞有明显的激活作用，而跨膜型TNF-α则可能对其功能具有调节作用。
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跨膜型和分泌型TNF-α在内毒素性休克过程中的作用
目的研究跨膜型TNF-α(mTNF-α)的消长与内毒素性休克发生、发展的关系,探讨mTNF-α在内毒素性休克中的作用和机理. 方法首先使用埃希大肠杆菌死菌液制备大鼠内毒素性休克模型,并分不同时间点检测血清中的分泌型TNF-α(sTNF-α)、腹腔巨噬细胞表面上的 mTNF-α.然后,在给大鼠注射死菌液之前30 min,分别注射TNF转化酶(TACE)反义寡核甘酸(5mg/kg)或抗TNF-α多克隆抗体(5mg/kg).6 h后分别检测sTNF-α、mTNF-α水平;检查肺、肾等内脏器官的病理改变;并且监测各组大鼠的血压变化. 结果在内毒素性休克过程中,mTNF-α表达的动态变化不同于sTNF-α,mTNF-α在注射菌液30 min后开始升高,4.5 h达高峰,随后有所下降,但一直维持在较高水平.TACE反义寡核苷酸能有效地抑制mTNF-α转化为sTNF-α,使腹腔巨噬细胞表面上的mTNF-α表达明显增高(P＜0.001),使血压维持在正常水平,肺、肾等脏器无病理改变;抗TNF-α多克隆抗体能中和sTNF-α,其结果与前者基本相似. 结论内毒素性休克的病理过程主要与sTNF-α及其诱导的其它促炎细胞因子如IL-1β、IL-6、IL-8等有关,而mTNF-α则可抵抗内毒素的攻击,稳定血压,限制炎症反应及保护组织免受损伤,为临床治疗休克和感染性疾病提供了新的线索和实验依据.
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PTK 对跨膜型与分泌型TNF-α诱导中性粒细胞功能的调节作用
目的:研究酪氨酸磷酸化激酶(PTK)对跨膜型(TM-TNFα)与分泌型TNF-α(S-TNF-α)诱导中性粒细胞呼吸爆发和NO释放的影响.方法:用化学发光法检测呼吸爆发,用硝酸还原酶法定量检测释放的NO,在体外观察PTK抑制剂对两型TNF-α诱导中性粒细胞以上功能的影响,并用Western印迹比较两型TNF-α诱导中性粒细胞蛋白酪氨酸磷酸化的异同.结果:PTK抑制剂Genistein(50umol/L)不仅可明显抑制S-TNF-α诱导的中性粒细胞呼吸爆发(P＜0.005),也可明显抑制TM-TNF-α诱导的中性粒细胞产生NO(P＜0.001).Western印迹显示大约17kD处,S-TNF-α介导的酪氨酸磷酸化条带比对照略强,而TM-TNF-α介导的酪氨酸磷酸化条带则明显增强;约于31kD处,出现由TM-TNF-α介导的酪氨酸磷酸化的特异性条带,而在其它处理组则均未发现.结论:两型TNF-α对中性粒细胞功能的影响均依赖于PTK的激活;但二者诱导酪氨酸磷酸化的程度及酪氨酸磷酸化的靶分子则存在差异.
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转染TNF-α及其突变体的成纤维细胞的杀瘤效应
目的:比较跨膜型和分泌型TNF-α在体内的抗瘤效应.方法:将3种TNF-α基因(分泌型TNF-x突变体,S-TN-Fm、跨膜型TNF-α突变体,TM-TNFm和野生型TNF-α,Wt-TNF)通过逆转录病毒载体转染成纤维细胞NIH/3T3;并用Southern印迹、RT-PCR、流式细胞仪和生物活性检测等方法,从基因的整合、RNA转录、蛋白的表达及其生物学活性4个方面对转染细胞进行检测鉴定.在小鼠接种肿瘤细胞的第3天,于接种部位分别皮下注射表达TNF-α及其突变体的NIH3T3细胞,效/靶比为5:1或1:1,观察这3种TNF-α的体内抗瘤效应.结果:NIH3T3转染细胞可表达高水平的TNFα及其突变体.在体外,NIH3T3/TM-TNFm的固定细胞、NIH3T3/S-TNFm的上清、NIH3T3/Wt-TNF的固定细胞和上清均可有效杀伤肿瘤细胞H22.在体内,当效/靶比为5:1时,注射NIH3T3/TM-TNFm的抑瘤效果强;而当效/靶比为1:1时,则NIH3T3/S-TNFm的疗效好.此外,在过继治疗期间未见明显副作用.结论:上述结果提示跨膜型和分泌型TNF-α均可在体内有效杀瘤;但如效/靶比适当,TM-TNF-α显示的杀瘤效应较S-TNF-α更强.
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R31L TNF-α突变体重组质粒的构建、真核表达及其产物的胞毒效应
目的:研究膜型、分泌型TNF-α的31位氨基酸在其生物学效应中的作用,进一步探讨TNF-α结构与生物学效应的关系.方法:采用重叠PCR方法将wt TNF-α 31位精氨酸(R)密码子(CGC)定点突变替换成亮氨酸(L)密码子(CTC),构建R31L TNF-α-pcDNA3.0重组质粒,经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,采用脂质体转染法将其瞬时转染COS-7细胞进行表达,通过MTT法检测R31L TNF-α突变体的胞毒效应.结果:酶切、PCR及测序鉴定证实目的基因R31L TNF-α正确连接到pcDNA3.0的多克隆位点;TNF-α 31位突变可增强sTNF-α的胞毒效应,突变体的CC50值是野生型的1/10,而对mTNF-α的生物学效应无明显影响.结论:本实验成功地构建了R31L TNF-α-pcDNA3.0重组质粒,且在真核细胞COS-7中获得表达;TNF-α 31位置换成亮氨酸后,主要增强其分泌型分子的胞毒效应,而对其膜分子无作用.
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两型TNF-α的细胞毒效应与靶细胞内Ca2+浓度变化的关系
目的: 比较分泌型TNF-α(S-TNF-α)和跨膜型TNF-α(TM-TNF-α)发挥细胞毒效应时,引起靶细胞内Ca2+浓度的变化.方法: 采用生物学活性检测法, 观察两型TNF-α对不同靶细胞的杀伤效应; 用Fura-2检测细胞内Ca2+浓度的变化.结果: TM-TNF-α可杀伤实验所用6株靶细胞; 而S-TNF-α则仅对其中两株有细胞毒效应. 两型TNF-α杀伤靶细胞时, 均伴有明显的Ca2+浓度升高.用钙螯合剂EGTA(10 mmol/L)预先处理靶细胞30 min, 只能降低S-TNF-α作用的靶细胞内的Ca2+浓度, 并使其细胞毒效应明显减弱(P《0.01); 对TM-TNF-α无影响.结论: 两型TNF-α发挥细胞毒效应时, 均可引起靶细胞内钙离子的重分布, 导致靶细胞内Ca2+浓度的升高, 但S-TNF-α的作用还可能与促进胞外Ca2+内流有关.
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稳定高效表达TNF-α基因及其突变体的H22肿瘤细胞株的建立
目的建立转染3种TNF-α基因(分泌型TNF-α突变体、跨膜型TNF-α突变体和野生型TNF-α的H22细胞株,以比较不同类型TNF-α的杀瘤效应.方法采用逆转录病毒载体,将3种TNF-α基因导入小鼠H22肿瘤细胞中,用Southern印迹、RT-PCR、流式细胞术和生物学活性检测等方法,从基因的整合、RNA转录、蛋白的表达及其生物学活性4个方面,对转染细胞进行检测鉴定.结果 3种TNF-α基因均在H22细胞中得到有效表达,并具有生物学活性.结论获得3种稳定高效表达TNF-α的H22肿瘤细胞株,为进一步研究跨膜型和分泌型TNF-α体内的抑瘤效应建立了良好的实验模型.
