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跨膜TNF-α文献资料
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R31L TNF-α突变体重组质粒的构建、真核表达及其产物的胞毒效应
目的:研究膜型、分泌型TNF-α的31位氨基酸在其生物学效应中的作用,进一步探讨TNF-α结构与生物学效应的关系.方法:采用重叠PCR方法将wt TNF-α 31位精氨酸(R)密码子(CGC)定点突变替换成亮氨酸(L)密码子(CTC),构建R31L TNF-α-pcDNA3.0重组质粒,经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,采用脂质体转染法将其瞬时转染COS-7细胞进行表达,通过MTT法检测R31L TNF-α突变体的胞毒效应.结果:酶切、PCR及测序鉴定证实目的基因R31L TNF-α正确连接到pcDNA3.0的多克隆位点;TNF-α 31位突变可增强sTNF-α的胞毒效应,突变体的CC50值是野生型的1/10,而对mTNF-α的生物学效应无明显影响.结论:本实验成功地构建了R31L TNF-α-pcDNA3.0重组质粒,且在真核细胞COS-7中获得表达;TNF-α 31位置换成亮氨酸后,主要增强其分泌型分子的胞毒效应,而对其膜分子无作用.
