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柯萨奇病毒B组3型2B蛋白诱导细胞自噬及其基序鉴定
目的 探讨柯萨奇病毒B组3型(CVB3) woodruff病毒2B蛋白对细胞自噬的诱导作用,及其自噬相关基序的鉴定.方法 分别构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与CVB3 woodruff病毒2B蛋白及其9种截短蛋白的融合蛋白(EGFP-2B、EGFP-2B1-249、EGFP-2B1-201、EGFP-2B1-153、EGFP-2B1-105、EGFP-2B1-57、EGFP-2B106.201、EGFP-2B106-249、EGFP-2 B205-297、EGFP-2B106-201)真核表达载体,红色荧光蛋白(mCherry)与微管相关蛋白轻链3(LC3)的融合蛋白真核表达载体pmCherry-LC3;应用激光共聚焦与蛋白质免疫印迹(Western blot)检测病毒2B蛋白对宫颈癌细胞(HeLa) LC3表达的影响;荧光显微镜观察9种截短蛋白在HeLa细胞中的表达;Western blot检测pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249转染细胞后LC3的表达;观察自噬抑制剂3-甲基腺苷(3-MA)处理后,pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249诱导细胞自噬的情况.结果 CVB3攻击HeLa细胞后,mCherry-LC3呈现细胞核周点状聚集表达,Western blot检测出现清晰LC3-Ⅱ条带;pEGFP-2B与pmCherry-LC3共转染后也可见细胞核周围绿色荧光与红色荧光均成点状聚集并相互重叠,且LC3-Ⅱ条带明显;9种截短融合蛋白质粒分别转染HeLa细胞后,其中可见细胞核周围绿色荧光点状聚集的短截短蛋白为EGFP-2B106-249;pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249转染细胞后可检测出现清晰LC3-Ⅱ条带;3-MA处理后,pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249分别与pmCherry-LC3共转染的细胞均未见绿色和红色荧光的核周点状聚集.结论 CVB3 woodruff病毒2B蛋白可以诱导宿主细胞发生自噬,其中截短蛋白2B106-249是病毒蛋白2B诱导HeLa细胞发生自噬的功能基序.
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利用噬菌体肽库技术获得与人Fas结合的多肽基序
目的利用噬菌体随机肽库技术获得与人Fas胞外区结合的多肽及其多肽基序,观察多肽基序的生物学功能. 方法以人Fas胞外区与IgG Fc段的融合蛋白Fas.Fc为筛选配基,筛选噬菌体随机九肽库;微量淘洗与ELISA相结合鉴定阳性克隆,DNA测序和分析.化学合成多肽进行竞争性ELISA以及细胞增殖抑制实验. 结果经过4轮亲和筛选,微量淘洗鉴定,获得42个阳性克隆;固定ELISA实验显示筛选到的噬菌体短肽能与Fas.Fc特异性结合,并呈剂量依赖关系;随机选取13个阳性克隆进行DNA测序,其序列及出现几率分别为:PRKARVDTS(2/13)、YKKKSLQVQ(2/13)、YKKKSMLQA(2/13)、SRKKYDQYA(4/13)、YARKIKPTA(2/13)和ARKKTEGAG(1/13).经多重序列分析,获得多肽基序:*R/KKK****A.在ELISA和竞争性ELISA实验中,化学合成多肽EGEFYKKKSMLQADPAK (P3)可抑制Fas与抗人Fas单抗Apo-1的结合,且呈剂量效应关系;P3不能抑制Fas与FasL的结合.细胞增殖实验表明,多肽可抑制Jurkat细胞增殖,且随多肽剂量的增加而加强.多肽与单抗Apo-1联合作用对Jurkat细胞增殖的影响与单独使用P3没有明显差别. 结论通过噬菌体随机肽库技术获得与Fas结合的多肽及其多肽基序,它们可能模拟了抗Fas抗体Apo-1对Fas的结合位点,为基于Fas凋亡的多肽药物前体设计提供了实验依据和结构基础.
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Numb在肿瘤中作用机制的研究现状
Numb在不对称分裂中对细胞分裂起关键调节作用.同时Numb也是参与肿瘤信号转导途径的重要成分,其在肿瘤中的作用机制正被逐步阐明[1-3].Numb可能是继p53基因后又一与肿瘤生物学行为密切相关的优势基因.本文就Numb基因结构功能以及在肿瘤中作用机制作一综述.一、Numb的结构和功能哺乳动物中Numb主要含有4个功能结构域:磷酸酪氨酸结构域(PTB)、富含脯氨酸结构域(PRR)、天冬酰胺-脯氨酸-苯丙氨酸(NPF)基序和天冬氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(DPF)基序.靠近Numb氨基端的PTB域能与多种蛋白相互作用,是Numb作用的关键部位.
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树鼩全基因组分泌蛋白的预测分析
目的：综合了解树鼩的分泌蛋白的信息。方法利用真核生物分泌蛋白预测流程 EuSecPred 2.0对树鼩的分泌蛋白进行全基因组预测，并对获得的分泌蛋白及所携带的信号肽进行系统分析。结果树鼩全基因组蛋白基因中鉴定获得279个分泌蛋白，占基因组全部编码基因的7.2％。对其功能和结构域进行注释分析，发现了以水解酶类、行使蛋白结合与离子结合功能蛋白质及初级代谢过程相关蛋白为主的分泌蛋白。氨基酸组成分析表明，树鼩分泌蛋白及其信号肽主要由疏水性氨基酸组成，信号肽剪切位点有部分亲水性氨基酸的存在。基序分析发现，分泌蛋白信号肽中未存在保守基序，而分泌蛋白内部存在GxHxCGG[FSV]L[IV][RAS][EP]D[WF] VLTAAHC、[KG]PPGV[YF]T[RK][VI][SC]x[YF][VL][DS]WIQx[TV][MI][RK]、[DT][SA][CF][QK] GDSGGPLVCNGV[LA]QG[IL]V、GY[HL][FL]CGG[SAT]L[ILV]S[EDP][CR]WV[LV][TS]AAHCF、N[IV][FI]FSP[LV]S[IV][SA][TA]ALAMLSLG[AT]xNDTLTQ[IL]L[EQ][GV]LGF[ND]LT[ES]T[SP]E 5种基序。结论在全基因组范围对树鼩分泌蛋白进行预测分析，有助于进一步研究树鼩机体功能调控机制及动物模型的开发。
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潜在的肺癌肿瘤抑制基因RBM5的研究进展
RBM5首先作为LUCA-15于1996年被克隆出来,曾被命名为LUCA-15、RBM5、H37等.RBM5蛋白是RNA结合基序蛋白家族成员;该家族是由HU-GO基因命名委员会正式命名的RRB/RBM/RNP新近发现的蛋白亚群,此类蛋白是RNA结合蛋白,与RNA的剪接、翻译和稳定性有关,尤其是其在凋亡调控中的重要作用已经引起了人们广泛关注.
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人类免疫缺陷病毒1型gp41结构与功能的研究进展
人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)通过其包膜糖蛋白(Env)介导侵入靶细胞.Env由受体特异性结合单位gp120和膜融合单位gp41组成.HIV-1的gp41分为3个功能区:膜外区、跨膜区和膜内区.膜外区是病毒感染时膜融合的主要结构基础；跨膜区通过疏水残基使Env锚定在脂质膜上；膜内区则表现多重功能,参与病毒的感染、复制、装配等过程.膜内区的功能由其特定的结构域或基序完成,包括3个慢病毒裂解肽(LLP-1、LLP-2、LLP-3)、含Tyr基序(Y712 XXL和Y802 W803)和双Leu基序(LL855/856)等.病毒诱导的融合过程中,包含Kennedy表位在内的膜内区发生拓扑学改变,表明gp41的3个功能区之间存在相互作用.这些进展对了解HIV-1的感染、复制和致病机制,开发新的抗病毒药物具有重要意义.
关键词： 人类免疫缺陷病毒1型 gp41 功能区 膜内区 基序 -
APPL1与胰岛素抵抗
Adaptor protein containing PH domain,PTB domain and leucine zipper motif 1(APPL1)是一种具有多个功能结构域的细胞内转接蛋白,包含PH结构域、PTB结构域以及亮氨酸拉链基序.研究发现,APPL1可与多个蛋白结合,参与细胞内多条信号转导通路,与前列腺癌、结肠癌、神经系统相关疾病以及排卵等过程有关.
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分化抑制因子在神经系统肿瘤中的调控作用
分化抑制因子(inhibitor of DNA binding and/or differentiation,Id)是1990 年Robert Benezra 等人首先从鼠红白血病(murine erythro leukemia,MEL)细胞cDNA 文库中克隆出来[1]的一种基因,其表达产物Id 蛋白属于螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH)转录因子家族成员.大部分HLH 蛋白有一个与之相邻的强碱性区域,为HLH 蛋白与DNA 结合所必需,能与E2 框基序(CANNTG)或相关N2 框基序(CACNAG)结合,含有此区的HLH 蛋白称为碱性HLH (basic helix-loop-helix,bHLH)蛋白,大部分bHLH 蛋白参与细胞命运和细胞分化过程的基因调控.Id 蛋白因缺乏与DNA 结合的碱性结构域,故Id 蛋白与bHLH 结合形成的异二聚体不能与DNA 结合,对bHLH 转录因子活性起负调节,从而抑制细胞分化,被称为分化抑制因子.
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钙调素的分子识别研究进展
钙调素(CaM),作为细胞内Ca2+信号传导途径中的主要信号转导分子,普遍存在于真核细胞中,介导调控由Ca2+引起的一系列生理生化反应,参与并调节细胞的增生、分化、运动等基本代谢过程.对CaM的结构及分子识别机制的研究,有助于更好地理解细胞信号传导、蛋白质相互作用的分子机制,对新药开发和临床治疗具有重要的指导意义.本文作者就近几年来有关CaM结构及分子识别机制的研究现状作一概述.
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HPV18E7抗原HLA-A2限制性CTL表位的初步筛选
目的:初步筛选人乳头瘤病毒18型E7抗原的HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位,为表位免疫原性鉴定提供靶肽.方法:采用超基序、多项式和量化基序方案相结合的方法,对靶抗原HPV18E7的HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞表位进行预测,并应用固相合成法合成多肽,经RP-HPLC纯化及纯度分析,用质谱进行定性鉴定.结果:分别预测出5条、1条和6条九肽表位,综合三种预测方案确定其中1条为候选合成表位,合成肽的纯度大于95%,经质谱分析合成肽的分子量测定值与理论值相符.结论:超基序、多项式和量化基序方案联合应用提高预测效率,避免了在研究HPV18E7抗原表位时盲目合成多肽;所合成的多肽为高纯度靶肽,为后继的抗原表位的免疫原性的鉴定奠定了实验基础.
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ZO-1不同功能片段在胃癌中表达及意义
目的 探讨ZO-1不同功能结构域表达变化与胃癌侵袭转移的关系.方法 制作模拟胃癌侵袭转移的组织芯片,并行免疫组化染色检测ZO-1(α-pan)、ZO-1(α+)和ZO-1(ZU5)在胃癌不同进展位点的表达.结果 胃腺癌组织中ZO-1 (α-pan)、ZO-1(α+)和ZO-1(ZU5)出现胞膜异位至胞质的迷离表达或不表达,并随着胃癌的侵袭,迷离表达程度加剧,当胃癌转移至淋巴结时迷离表达程度反而降低.并发现胃腺癌的迷离表达程度与组织学类型相关.结论 ZO-1(α-pan)、ZO-1(α+)和ZO-1(ZU5)胞膜异位至胞质的迷离表达或不表达,提示ZO-1的PDZ3、GUK、SH3结构域、α基序和ZU5结构域可能参与胃癌的侵袭转移及组织学结构的维持,这些结构域异常表达可能是ZO-1参与上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)或间质-上皮转化(mesenchymal-epithelial transition,MET)发生的机制之一.
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CTL表位预测的方法学进展
CD8+αβT细胞在机体抗感染和抗肿瘤免疫中发挥着极为重要的作用.现已知,CD8+αβT细胞所识别的靶抗原需先经抗原递呈途径以"抗原肽-MHC Ⅰ类分子"复合物的形式呈现于抗原递呈细胞(Antigen presenting cells,APCs)或靶细胞表面方可被表达有相应αβTCR(T cell receptor)的CD8+T细胞所识别,相应的与MHCⅠ类分子结合的抗原肽即为CTL表位(Cytotoxic Tlymphocyte epitopes).
关键词： GTL 表位 预测方法 MHCⅠ类分子 基序 人工神经网络(ANNs) -
大鼠黏蛋白rMuc3酶切保守基序对其蛋白酶切的影响
目的 探讨大鼠黏蛋白rMuc3酶切保守基序LS1KGS2IV1V2中各氨基酸对其蛋白酶切的影响.方法 采用定点突变技术,设计相应突变引物,以p20为模板,基于PCR扩增得到突变体,并经测序验证.然后通过Western Blot检测各突变体的表达,并分析未酶切部分所占比例.结果 细胞裂解物经Western Blot免疫印迹实验,证实在55kd处存在未酶切的部分,在30kd处存在可被抗V5抗体检测的N端部分,经过Quantity one分析后发现,S2/A完全抑制了酶切的发生,G/A抑制了绝大部分的酶切(未酶切部分占79%),L/A、I/A、V1/A、V2/A均对酶切产生了不同程度的抑制,未酶切部分分别为22%、39%、14%和17%,而K/A和S2/A几乎对酶切没有影响,其未酶切部分分别为6%和3%,酶切效率与p20(未酶切部分占4%)几乎一样.结论 酶切保守基序LS1KGS2IV1V2中各氨基酸对其蛋白酶切的发生是很重要的,其机制可能是因为此保守基序位于β2和β3片层之间的环状区,其上的氨基酸对于维持黏蛋白的构象是必须的.在S1上可能有O型糖链的存在,并且去除此O型糖链不影响酶切保守基序LS1KGS2IV1V2的酶切.
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转录因子FoxO1在神经元凋亡中的作用
Firkhead转录因子(Fox蛋自家族)是2000年才正式统一命名的一个新的转录因子家族,自20世纪90年代首次在果蝇中发现该基因以来,其家族已先后发现100多个Fox基因,该家族的共同特征是具有一个长110个氨基酸的保守的DNA结合结构域,称为Fox(Forkhead box)结构域,含有一个螺旋-转角-螺旋基序,有3个α螺旋和2个大环形成的翼状(winged)结构[1].Fox家族又分为17个亚家族,即FoxA～Q,其中FoxO亚家族主要通过调控转录和信号转导途径在动物细胞凋亡、细胞周期停滞、DNA损伤修复及糖代谢等方面发挥重要作用[2].
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生物信息学方法在CTL表位预测中的应用
细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic Tlymphocyte,CTL)在机体抗感染免疫和肿瘤免疫中发挥重要作用.引起有效CTL免疫应答的,并非完整的蛋白质抗原分子,而是抗原来源的特异性CTL表位.因此,对CTL表位作出高效、准确地预测,进而通过实验方法鉴定,是基于表位的疫苗设计以及发展特异性CTL免疫应答检测技术的关键.近年来,随着生物信息学的迅猛发展,一系列该领域的新成果被应用于CTL表位预测.通过建立新的算法和编写相应程序,大大提高了CTL表位鉴定的效率,加快了基于表位的新药研发进程.
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Peptaibols类抗菌肽结构与作用机制研究进展
Peptaibols是一类富含非蛋白质氨基酸,具有广谱抗菌活性的离子通道类抗菌肽.对其结构及作用机制做了简要介绍,并对其穿膜三维构象、新的作用模型以及利用分子动力学模拟技术进行的结构与功能研究等方面进行了综述.
关键词： peptaibols 抗菌肽 离子通道 基序 分子动力学模拟 -
CpG ODN序列结构特征对免疫活性影响的研究进展
CpG ODN(CpG oligonucleotide,CpG 寡脱氧核苷酸)是人工合成的含有非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的寡脱氧核苷酸(ODN),可模拟细菌DNA刺激多种哺乳动物包括人的免疫细胞.
