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SEA组件174-201位氨基酸对大鼠黏蛋白rMuc3羧基端酶切的影响
目的 探讨大鼠黏蛋白3(rMuc3)羧基端SEA组件内174-201位氨基酸对LSKGSIVV基序酶切的影响.方法采用Clustal X 1.83软件对包含SEA组件的蛋白质进行比对,选择SEA组件后续79个氨基酸中保守的氨基酸残基,利用定点突变技术将这些保守残基突变为终止密码子,分别命名为p20t1、p20t2、p20t3、p20t4,并测序验证.将不同长度的突变体转染COS-7细胞,用N端V5标签抗体行Western blotting,检测各突变体的酶切情况.结果 rMuc3羧基端第174位丝氨酸(S)、第201位半胱氨酸(C)、第212位酪氨酸(Y)、第223位酪氨酸(Y)在多种含SEA组件的蛋白质中非常保守.Western blotting检测结果表明,含rMuc3羧基端的p20及突变体p20t2、p20t3、p20t4的表达产物在LSKGSIVV基序处均能发生酶切,均可检测到30kD的酶切后片段,但p20tl的表达产物在LSKGSIVV位点处不能发生蛋白酶切.结论 rMuc3羧基端第174位S至第201位C残基对LSKGSIVV基序酶切的发生至关重要,是SEA组件在LSKGSIVV基序发生蛋白酶切的另一必要条件.
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Muc3羧基端SEA组件完整性与蛋白酶切的关系
目的 探讨大鼠黏蛋白3(Muc3)羧基端SEA组件的完整性与蛋白酶切的关系.方法 对截断了的大鼠Muc3的羧基端(p20t和p20SEA)采用定点突变的方法在所要求的位点插入终止密码子,采用SDS/PAGE和Western blot方法检测蛋白表达,N-glycosidase F消化法对表达蛋白质行脱N型糖链.结果 Muc3完整的羧基端产物翻译后经蛋白酶切产生30kD的氨基端酶切片段和49kD的羧基端酶切片段,30kD的氨基端酶切片段经脱N型糖链后分子量变为22kD;含完整SEA组件但不含SEA组件后续氨基酸的截断大鼠Muc3羧基端用V5抗体可以检测到30kD的表达产物,脱N型糖链后分子量变为22kD;含不完整SEA组件的截断的大鼠Muc3羧基端用V5抗体可以检测到26～30kD的表达产物,脱N型糖链后分子量变为26kD.结论 Muc3完整的羧基端产物和SEA组件完整但不含SEA组件后续氨基酸的大鼠Muc3羧基端均在翻译后经历了蛋白酶切,但是SEA组件不完整的大鼠Muc3羧基端在翻译后未能出现蛋白酶切,提示SEA组件完整性是Muc3羧基端蛋白酶切反应发生的一个重要条件.
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Muc3羧基端内SEA组件的蛋白酶切与N糖基化关系的研究
目的 Muc3的羧基端在翻译后经历了蛋白酶切反应,探讨Muc3的羧基端蛋白酶切反应发生是否与其羧基端内的N型糖链有关.方法 截断了的Muc3的羧基端(含完整的SEA组件)(p20SEA)采用定点突变方法在所要求的位点插入终止密码子,所表达蛋白质的检测采用pulse/chase和免疫共沉淀方法或SDS/PAGE和Western印迹方法,所表达蛋白质的N型糖链合成抑制采用Tunicamycin处理转染的COS-1细胞.结果 p20表达产物(完整的Muc3羧基端产物)经历了翻译后蛋白酶切,产生30×103的氨基端酶切片段和49×103的羧基端酶切片段;Tunicamycin处理后主要的表达蛋白是60×103的全长的非糖基化产物,22×103的少量氨基端酶切片段和41×103的羧基端酶切片段;p20SEA表达产物(含完整的SEA组件但不含SEA组件后续氨基酸的截断Muc3羧基端)抑制N型糖链出现未酶切的36×103全长产物和22×103酶切的非N糖基化产物.结论 大鼠Muc3羧基端在抑制其N型糖链合成后出现Muc3的羧基端蛋白酶切的抑制.
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大鼠黏蛋白rMuc3酶切保守基序对其蛋白酶切的影响
目的 探讨大鼠黏蛋白rMuc3酶切保守基序LS1KGS2IV1V2中各氨基酸对其蛋白酶切的影响.方法 采用定点突变技术,设计相应突变引物,以p20为模板,基于PCR扩增得到突变体,并经测序验证.然后通过Western Blot检测各突变体的表达,并分析未酶切部分所占比例.结果 细胞裂解物经Western Blot免疫印迹实验,证实在55kd处存在未酶切的部分,在30kd处存在可被抗V5抗体检测的N端部分,经过Quantity one分析后发现,S2/A完全抑制了酶切的发生,G/A抑制了绝大部分的酶切(未酶切部分占79%),L/A、I/A、V1/A、V2/A均对酶切产生了不同程度的抑制,未酶切部分分别为22%、39%、14%和17%,而K/A和S2/A几乎对酶切没有影响,其未酶切部分分别为6%和3%,酶切效率与p20(未酶切部分占4%)几乎一样.结论 酶切保守基序LS1KGS2IV1V2中各氨基酸对其蛋白酶切的发生是很重要的,其机制可能是因为此保守基序位于β2和β3片层之间的环状区,其上的氨基酸对于维持黏蛋白的构象是必须的.在S1上可能有O型糖链的存在,并且去除此O型糖链不影响酶切保守基序LS1KGS2IV1V2的酶切.
