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柯萨奇病毒B组3型2B蛋白诱导细胞自噬及其基序鉴定
目的 探讨柯萨奇病毒B组3型(CVB3) woodruff病毒2B蛋白对细胞自噬的诱导作用,及其自噬相关基序的鉴定.方法 分别构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与CVB3 woodruff病毒2B蛋白及其9种截短蛋白的融合蛋白(EGFP-2B、EGFP-2B1-249、EGFP-2B1-201、EGFP-2B1-153、EGFP-2B1-105、EGFP-2B1-57、EGFP-2B106.201、EGFP-2B106-249、EGFP-2 B205-297、EGFP-2B106-201)真核表达载体,红色荧光蛋白(mCherry)与微管相关蛋白轻链3(LC3)的融合蛋白真核表达载体pmCherry-LC3;应用激光共聚焦与蛋白质免疫印迹(Western blot)检测病毒2B蛋白对宫颈癌细胞(HeLa) LC3表达的影响;荧光显微镜观察9种截短蛋白在HeLa细胞中的表达;Western blot检测pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249转染细胞后LC3的表达;观察自噬抑制剂3-甲基腺苷(3-MA)处理后,pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249诱导细胞自噬的情况.结果 CVB3攻击HeLa细胞后,mCherry-LC3呈现细胞核周点状聚集表达,Western blot检测出现清晰LC3-Ⅱ条带;pEGFP-2B与pmCherry-LC3共转染后也可见细胞核周围绿色荧光与红色荧光均成点状聚集并相互重叠,且LC3-Ⅱ条带明显;9种截短融合蛋白质粒分别转染HeLa细胞后,其中可见细胞核周围绿色荧光点状聚集的短截短蛋白为EGFP-2B106-249;pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249转染细胞后可检测出现清晰LC3-Ⅱ条带;3-MA处理后,pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249分别与pmCherry-LC3共转染的细胞均未见绿色和红色荧光的核周点状聚集.结论 CVB3 woodruff病毒2B蛋白可以诱导宿主细胞发生自噬,其中截短蛋白2B106-249是病毒蛋白2B诱导HeLa细胞发生自噬的功能基序.
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推拿对失神经骨骼肌萎缩大鼠自噬相关因子Beclin-1、液泡分选蛋白34和微管相关蛋白轻链3的mRNA表达的影响
目的 探讨推拿延缓失神经骨骼肌萎缩的相关机制.方法 77只Sprague-Dawley雄性大鼠随机分为假手术组(n=7)、模型组(n=35)和推拿组(n=35).后两组通过暴露并切断胫神经的方法制备失神经骨骼肌萎缩大鼠模型.造模后第2天,推拿组术侧下肢进行推拿干预.分别在造模后0 d、7 d、14 d、21 d和28 d取材,测定术侧腓肠肌湿重比,HE染色测定腓肠肌肌纤维截面积和直径,逆转录实时定量聚合酶链反应检测术侧腓肠肌组织中自噬相关因子Beclin-1、液泡分选蛋白34(Vps34)和微管相关蛋白轻链3(LC3)的mRNA表达.结果 三组0 d时,腓肠肌湿重比、肌纤维截面积和直径,以及Beclin-1、Vps34和LC3的mRNA表达均无显著性差异(F<1.321,P>0.05).与假手术组比较,模型组和推拿组腓肠肌湿重比、肌纤维截面积和直径在不同时间下降(P<0.05),推拿组肌湿重比(除21 d)均高于模型组(P<0.05),推拿组肌纤维截面积和直径(除21 d)均大于模型组(P<0.05).与假手术组相比,模型组和推拿组术侧腓肠肌Beclin-1、Vps34、LC3 mRNA表达在不同时间升高(P<0.05),推拿组各项mRNA表达(除14 d)均高于模型组(P<0.05).组内比较,模型组和推拿组腓肠肌湿重比、肌纤维截面积和直径随时间呈进行性下降趋势(P<0.05);模型组Beclin-1、Vps34 mRNA表达在21 d后呈上升趋势(P<0.05),LC3 mRNA表达在21 d升高(P<0.05);推拿组Beclin-1 mRNA表达呈先上升后下降的趋势(P<0.05),Vps34和LC3 mRNA表达(除14 d)呈先上升后下降趋势(P<0.05).结论 推拿可能通过上调自噬相关因子Beclin-1、Vps34和LC3的mRNA表达,促进细胞自噬的激活,清除损伤细胞器和蛋白质,为肌纤维再生提供一定的合成底物和能量,从而减轻失神经骨骼肌萎缩的程度.
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蓝莓对肝纤维化大鼠肝组织自噬相关蛋白LC3和Beclin1表达的影响
目的:观察蓝莓对免疫性肝纤维化大鼠肝组织微管相关蛋白轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)及Beclin1表达的影响.方法:60只健康♂SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、蓝莓原浆高剂量组、蓝莓原浆中剂量组、蓝莓原浆低剂量组及复方鳖甲软肝片组.除正常对照组外,其余各组均采用腹腔注射无菌猪血清复制大鼠肝纤维化模型.造模同时各蓝莓组给予不同浓度蓝莓原浆(0.25mL/100g、0.5mL/100g、1.0mL/100g)灌胃,复方鳖甲软肝片组用复方鳖甲软肝片灌胃(0.054g/100g),1次/d.12wk处死大鼠,测定血清谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)含量,行肝组织病理学检查;Westem blot检测LC3-Ⅱ、Beclin1、Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)的蛋白水平;实时定量PCR(realtime quantitative PCR,qRT-PCR)检测LC3-Ⅱ、Beclinl的mRNA水平.结果:各组大鼠血清ALT、AST水平差异无统计学意义(均P＞0.05).与正常对照组比较,模型组肝纤维化程度明显(P＞0.05),LC3-Ⅱ、Beclin1的mRNA及蛋白表达、Col Ⅰ的蛋白表达明显增高(均P＜0.01).与模型组比较,蓝莓原浆高、中剂量组肝纤维化程度明显减轻(P＜0.05),胶原表达减少;LC3-Ⅱ、Beclin1的mRNA、蛋白表达及Col Ⅰ的蛋白表达明显降低(均P＜0.01).结论:猪血清所致的大鼠免疫性肝纤维化中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1升高,蓝莓对大鼠免疫性肝纤维化的干预作用可能与下调LC3和Beclin1的基因及蛋白表达,进而抑制自噬有关.
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系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中微管相关蛋白轻链3和溶酶体相关膜蛋白2基因表达及其临床意义
目的 检测系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中巨自噬标志性分子微管相关蛋白轻链3 (LC3)和分子伴侣介导的自噬(CMA)标志性分子溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)基因表达,探讨其与SLE发病的关系.方法 纳入2017年11月至2018年3月在川北医学院附属医院风湿免疫科诊治的88例SLE患者(SLE),采用密度梯度离心法分离外周血单个核白细胞(PBMCs);采用实时荧光定量PCR法测定患者PBMCs中LC3和LAMP-2在mRNA水平的表达量;采用SLE疾病活动指数(SLEDAI)评分判断疾病活动度,分析LC3和LAMP-2表达与SLE患者临床特点及病情活动度的相关性.同期纳入年龄匹配的40例健康体检者作为正常对照组.结果 正常对照组受检者PBMCs中LC3 mRNA和LAMP-2 mRNA相对表达量分别为1.021±0.551和1.015±0.667,SLE组患者分别为0.783±0.435和2.402±2.233,组间比较差异均有统计学意义(P=0.020、0.000).SLE患者PBMCs中LAMP-2 mRNA表达水平与SLEDAI呈明显正相关(rs=0.312,P=0.003),LC3mRNA表达水平与SLEDAI无明显相关性(rs=-0.175,P=0.103).LAMP-2 mRNA表达量升高患者肾脏损害发生率明显高于非升高患者(40.7％ vs.16.3％),LC3 mRNA表达量降低患者的血液系统受累率明显高于无LC3 mRNA表达降低患者(65.2％vs.32.3％),差异均有统计学意义(P=0.013、0.006).不同LC3 mRNA和LAMP-2 mRNA表达水平组实验室检查指标和治疗效果的患者分布差异均无统计学意义(均P＞0.05).结论 SLE患者LC3 mRNA表达水平下调,LAMP-2 mRNA表达水平上调,提示SLE患者存在巨自噬功能不足.SLE患者CMA功能增强,并且与肾脏和血液系统受累有关.
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β抑制蛋白2及微管相关蛋白轻链3在大鼠肾脏缺血再灌注损伤中的改变及意义
目的 探讨β抑制蛋白2(β-arrestin2)及微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)在急性肾脏缺血再灌注损伤中的表达及与肾脏损害程度的相关性.方法 选用生后3~4周的雄性SD大鼠,随机分为正常组、假手术组、急性缺血再灌注损伤组.通过右侧肾脏切除,无创动脉夹夹闭左侧肾动脉45 min之后松开动脉夹,恢复肾脏血流,建立肾脏急性缺血再灌注损伤模型.并在恢复肾脏血流后12、24、36、48、72、96 h取肾脏及血液样本.采用免疫组织化学方法及West-ern blot方法检测各组肾组织中β-arrestin2及LC3蛋白的表达水平,检测各组的肾功能,并对各组肾脏病理学进行评分.结果 与正常组及假手术组相比,缺血再灌注损伤组血肌酐及肾脏病理学评分均有显著升高,其中肾脏损伤程度以缺血再灌注损伤后24 h为明显;β-arrestin2及LC3蛋白在正常组及假手术组肾脏中的表达较少,在缺血再灌注损伤后的肾脏中表达显著升高,其中以缺血再灌注损伤后12 h时表达上调为显著;β-arrestin2及LC3的表达改变先于肾脏病理改变,并且与肾脏损害程度呈正相关(r=0.821,P<0.05;r=0.913,P<0.05).结论 在肾脏急性缺血再灌注损伤时,β-arrestin2可能作为一个上游调控蛋白,通过对自噬的调节参与急性肾损伤的病理过程.
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自噬在肿瘤耐药中的作用研究进展
自噬是一种通过溶酶体途径分解代谢细胞内组分的过程。在细胞应激状态下，细胞通过自噬清除线粒体等损坏的细胞器和蛋白。在肿瘤发生发展的早期和晚期，自噬发挥的作用是不同的：肿瘤发生早期，自噬降低肿瘤原发性基因不稳定性和蛋白聚集，以及激发抗肿瘤性免疫应答；在成熟的肿瘤中，细胞通过自噬对营养不足以及细胞过度增殖所致的代谢应激产生抵抗。自噬不仅促进肿瘤细胞存活，在特殊条件下，也可导致肿瘤细胞自噬性细胞死亡。自噬性细胞死亡可增加发生凋亡的肿瘤细胞对辐射治疗的敏感性。因此，肿瘤发生及肿瘤治疗中自噬的作用是双向的，需要更加深入的研究阐明自噬在肿瘤中发挥作用的详细机制。本文对自噬在肿瘤细胞化疗耐药中发挥作用的研究进展进行综述。
关键词： 自噬 肿瘤代谢性重编程 人雷帕霉素受体Ⅰ型家族 微管相关蛋白轻链3 肿瘤多药耐药 -
西罗莫司对鱼藤酮诱导PC12细胞凋亡的抑制作用
目的 观察西罗莫司干预鱼藤酮诱导PC12细胞凋亡的作用,以探讨西罗莫司用于治疗帕金森病的可能性及机制.方法 PC12细胞处理分为正常对照组、鱼藤酮50 nmol·L-1组和西罗莫司25,50,100和200 μg·L-1组.PCI2细胞加入西罗莫司25,50,100和200 μg·L-1预处理12 h后,再加入鱼藤酮50nmol·L-1作用24 h.采用4',6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)免疫荧光实验检测细胞凋亡形态变化;Annexin V-FTTC/PI染色法检测细胞凋亡率;罗丹明123检测线粒体膜电位;吖啶橙荧光染色法检测自吞噬体形成;Westem印迹法检测胱天蛋白酶3和微管相关蛋白轻链3(LC3)表达.结果 与鱼藤酮模型组比较,西罗莫司50,100和200 μg·L-1组细胞凋亡率分别降低了20.6%,35.4%和40.2%(P
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多发性硬化和视神经脊髓炎患者外周血单个核细胞中Beclin 1与LC3的表达及其意义
目的 检测自噬相关蛋白Beclin 1和LC3在多发性硬化(MS)和视神经脊髓炎(NMO)患者急性期治疗前、后及复发型急性期间外周血单个核细胞(PBMC)中的表达水平并探讨其意义.方法 所有研究对象均为2012年10月至2014年4月在苏州大学附属第一医院住院、门诊患者及健康体检者,采用密度-梯度离心法分离MS、NMO急性期患者(治疗前、后)与正常对照组的外周血中PBMC,应用Western印迹技术检测Beclin 1和LC3的表达水平.同时,分别随访复发缓解型MS(RRMS)和复发型NMO(RNMO)患者,对比两次急性期Beclin 1和LC3的表达变化情况.结果 (1)与对照组相比,急性期MS和NMO患者外周血PBMC中Beclin 1的表达降低,LC3表达增高(P＜0.01).(2)MS、NMO患者经过治疗后对比治疗前Beclin 1表达明显增高,LC3表达则明显降低(P＜0.01).(3)然而随访发现RRMS和RNMO患者复发期较前次发作期Beclin 1的表达水平降低与LC3的表达增高均更加显著(P＜0.01).结论 急性期MS和NMO患者外周血PBMC中自噬水平增高,经治疗后自噬水平下降;然而在RRMS和RNMO患者复发期自噬水平进一步增高.这表明自噬水平的高低可能与MS和NMO的发生及复发相关.
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Decorin基因过表达对HEK293T细胞微管相关蛋白LC3和自噬基因beclin1表达的影响
目的:构建人核心蛋白聚糖(DCN)重组质粒,研究其对微管相关蛋白LC3和自噬基因beclin1表达的影响.方法:从人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)提取总RNA,经RT-PCR获得decorin的全长cDNA,克隆至T-载体pUM-T并测序,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,再次测序正确后以磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK293T细胞,利用RT-PCR、Western Blot方法检测空载体组和重组质粒转染组微管相关蛋白LC3和自噬基因beclin1转录水平及翻译水平的表达.结果:经DNA测序证实人DCN cDNA片段正确插入真核表达载体中.Western Blot结果显示经磷酸钙共沉淀法转染的HEK 293T细胞中目的基因高表达.RT-PCR和Western Blot结果显示,与空载体组相比,重组质粒转染组LC3转录水平显著降低,beclin1和LC3-Ⅱ的翻译水平均显著降低.结论:成功构建人DCN重组质粒,其在HEK 293T中过表达可以显著降低微管相关蛋白LC3和自噬基因beclin1表达,为进一步研究DCN与自噬的相互作用奠定了基础.
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化痰通络方对急性脑梗死大鼠rt-PA溶栓后神经细胞自噬途径中 Beclin1与 LC3蛋白表达的影响
[目的]观察化痰通络方对急性脑梗死大鼠重组组织纤溶酶原激活剂( rt-PA )溶栓后神经细胞自噬途径中自噬相关蛋白（Beclin1）及微管相关蛋白轻链3（LC3）蛋白表达的影响。[方法]选择160只健康SD大鼠，随机分为假手术组、模型组、rt-PA组、化痰通络方联合rt-PA组（简称中药组），每组采用6 h、1 d、3 d和7 d 4个时相。采用自身栓子法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型（MCAO），rt-PA组与中药组分别给予尾静脉注入rt-PA（浓度为5.67 mg/kg）及联合化痰通络中药（浓度为7.2 g/kg）干预，每日2次。于相应时间点采用Western blot检测各组大鼠大脑皮质梗死区组织中Beclin1及LC3蛋白的表达。[结果] Western blot结果显示：与假手术组相比，模型组在4个时相中Beclin1和LC3蛋白的相对丰度值均明显增高（P﹤0.05）；采用rt-PA和rt-PA联合化痰通络法干预后，4个时相内Beclin1与LC3蛋白的相对丰度值均明显下降（P﹤0.05）；且rt-PA联合化痰通络组下降更加显著，与rt-PA组比较差异有统计学意义（P﹤0.05）。[结论]化痰通络方可通过降低神经细胞自噬途径中Beclin1与LC3蛋白的表达，部分抑制神经细胞的过度自噬，进而保护神经细胞损伤，从而更好的防治急性脑梗死溶栓后缺血再灌注的发生与发展。
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微管相关蛋白轻链3和beclin-1在子宫内膜异位症中的表达及意义
目的:研究自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(LC-3)和beclin-1在子宫内膜异位症患者异位内膜组织中的表达情况,探讨其与临床分期的关系.方法:采用免疫组织化学及免疫印迹检测80例子宫内膜异位症患者(研究组)及20例正常子宫内膜(对照组)组织中LC-3和beclin-1蛋白的定位及定量情况.结果:研究组异位内膜组织中LC-3和beclin-1的表达较对照组显著下调,并且随着r-AFS期别程度的增加,LC-3和beclin-1蛋白表达呈逐渐下降趋势.结论:LC-3和beclin-1在子宫内膜异位症中处于低表达状态,且与子宫内膜异位症的发生发展及严重程度呈负相关.
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术前应用去甲斑蝥素诱导自噬减轻肝切除患者术后肝功能损伤
目的 探讨肝切除患者术前应用去甲斑蝥素对机体自噬水平的影响及对肝切除患者术后肝功能损伤改善的作用.方法 采用前瞻性研究方法,选择2017年1月至2018年1月需行肝切除术的肝细胞肝静脉滴注癌患者共60例,按随机数字表法分为对照组、实验组1、实验组2,各20例.对照组仅行常规肝切除术;实验组患者术前给予注射用去甲斑蝥酸钠静脉滴注(每日20 mg,连续1周为实验组1,隔日20 mg,连续1周为实验组2).术后监测患者肝功能水平;行Western blotting检测患者肝脏组织自噬蛋白-微管相关蛋白轻链3(LC3)-Ⅰ、LC3-Ⅱ及凋亡相关分子(Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9)蛋白表达的变化;比较患者平均住院时间.结果 (1)肝功能:术后对照组患者肝功能损害严重.实验组患者的肝功能[丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、总胆红素(TB)、直接胆红素(DB)]水平较对照组患者术后水平降低(P均＜0.05),且实验组2低于实验组1(P均＜0.05).(2)三组患者肝脏标本中LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ蛋白均有一定程度的表达,对照组患者肝组织中LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ蛋白少量表达,且对照组二者相对表达量明显少于实验组1、2(P均＜0.05);而实验组1、2间比较,二者相对表达量相近(P均＞0.05).(3)三组中Caspase-8蛋白相对表达量无明显差异(P＞0.05);Caspase-3及Caspase-9蛋白在对照组相对表达水平明显低于实验组1、2(P均＜0.05);且在实验组2明显低于实验组1(P均＜0.05).(4)平均住院日:实验组1、2和对照组的平均住院日分别为(15.3±2.7)d、(14.1±1.7)d和(19.5±3.8)d,实验组1和2分别短于对照组(P均＜0.05),两实验组间无统计学差异(P＞0.05).结论 术前应用去甲斑蝥素可以诱导机体自噬蛋白的表达,在一定程度上可以减轻肝切除患者术后肝缺血再灌注的损伤及肝细胞凋亡,且术前间隔使用注射用去甲斑蝥酸钠对肝功能损伤缓解的效果更加明显,拟可为临床减轻肝切除术后患者肝功能损伤提供新思路.
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微管相关蛋白轻链3及自噬基因Beclin-1在低氧性肺动脉高压大鼠模型肺组织中的表达
目的 探讨微管相关蛋白轻链3(LC3)及自噬基因Beclin-1在低氧性肺动脉高压大鼠肺组织中的表达及其意义.方法 成年雄性SD大鼠30只,随机均分为低氧组和常氧组.建立低氧性肺动脉高压模型,采用蛋白质免疫印记法分别检测两组大鼠肺组织中LC3含量及Beclin-1蛋白的表达.结果 低氧组肺组织中LC3及Beclin-l蛋白含量较对照组显著增高(P＜0.05).结论 低氧性肺动脉高压大鼠的自噬途径被激活,可能参与了低氧性肺动脉高压的发病过程.
关键词： 低氧性肺动脉高压 Beclin-1基因 微管相关蛋白轻链3 自体吞噬 -
自噬基因Beclin1和微管相关蛋白轻链3与胃癌的关系研究
目的 研究胃部非癌组织、胃部癌旁组织与胃部癌组织中自噬基因Beclin1和微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, MAPLC3)基因的表达含量,确定Beclin1和MAPLC3表达含量与胃癌之间的联系.方法 使用实时逆转录-聚合酶链反应(Real-Time reverse transcription polymerase chain reaction, Real-Time RT-PCR)检测胃部非癌组织、胃部癌旁组织与胃部癌组织中Beclin1以及MAPLC3基因的 mRNA表达含量.使用蛋白质印迹法(Western blot)方法检测胃部非癌组织、胃部癌旁组织与胃部癌组织中Beclin1以及MAPLC3基因的蛋白表达含量.结果 与胃部非癌组织相比,胃部癌旁组织Beclin1以及MAPLC3的mRNA含量显著降低(P<0.01),胃部癌组织中Beclin1以及MAPLC3的mRNA含量也显著降低(P<0.01);与胃部癌旁组织相比,胃部癌组织中Beclin1以及MAPLC3的mRNA含量也显著降低(P<0.05).与胃部非癌组织相比,胃部癌旁组织Beclin1以及MAPLC3的蛋白含量显著降低(P<0.05),胃部癌组织中Beclin1以及MAPLC3的蛋白含量也显著降低(P<0.01);与胃部癌旁组织相比,胃部癌组织中Beclin1以及MAPLC3的蛋白含量也显著降低(P<0.05).结论 自噬相关基因Beclin1以及MAPLC3的mRNA和蛋白水平在胃癌组织中表达降低,这提示自噬相关基因与胃癌的发生、发展密切相关.
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膜性肾病组织中足细胞自噬体数量、自噬相关蛋白表达变化及其意义
目的 观察特发性膜性肾病(IMN)和继发性膜性肾病(SMN)病灶组织中足细胞自噬体数量、自噬相关蛋白表达变化,探讨足细胞自噬与膜性肾病的关系.方法 收集92例IMN患者(IMN组)、22例SMN患者(SMN组)的病肾组织标本,及30例因外伤、输尿管肿瘤等其他原因行肾切除手术者(对照组)的正常肾组织标本.观察各组肾组织病理变化、足细胞结构,计算足细胞自噬体数量;分析足细胞自噬体数量与膜性肾病临床病理参数的关系;采用Western blotting法检测各组肾组织中的自噬蛋白Beclin-1、微管相关蛋白轻链3(LC3).结果 IMN组、SMN组、对照组足细胞自噬体数量分别为(2.63±0.94)、(2.58±0.52)、(3.22±0.86)个,IMN组和SMN组足细胞自噬体数量较对照组减少(P均<0.05).IMN组、SMN组中,临床分期为Ⅱ期、24 h尿蛋白量(24 h UP)≥3.5 g/L、血清白蛋白(Alb)≥30 g/L、估算肾小球滤过率(eGFR)≥60 mL/(min·1.73 m2)的患者足细胞自噬体数量分别少于临床分期为Ⅰ期、24 h UP<3.5 g/L、Alb<30 g/L、eGFR<60 mL/(min·1.73 m2)的患者(P均<0.05).IMN组和SMN组足细胞自噬体数量与24 h UP、eGFR、血肌酐、尿素氮均无相关性(P均>0.05).IMN组和SMN组肾组织中LC3、Beclin-1相对表达量均低于对照组(P均<0.05).结论 IMN、SMN患者病肾组织中足细胞自噬体数量减少,自噬相关蛋白表达降低;自噬可能与膜性肾病患者足细胞损伤过程密切相关,随着病情进展,足细胞自噬活性下降.
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厄洛替尼联合氯喹对EGFR野生型非小细胞肺癌增殖、凋亡及自噬相关蛋白表达的影响
目的 观察厄洛替尼联合氯喹对表皮生长因子受体(EGFR)野生型非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、凋亡及自噬相关蛋白表达的影响.方法 体外培养K-RAS野生型EGFR野生型NSCLC细胞Spc-A1和K-RAS突变型EGFR野生型NSCLC细胞A549,将其分别分为4组,A、B、C组分别加入厄洛替尼、氯喹、厄洛替尼+氯喹各0.1 mL,D组加入等量培养基.培养72 h,采用MTT法观察细胞增殖情况,并计算厄洛替尼、氯喹的联合指数(CI);培养48 h,采用Hoechst33258染色法观察细胞凋亡情况,Western blotting法检测细胞中的自噬微管相关蛋白轻链3(LC3).结果 A、B、C组细胞存活率均较D组降低(P均<0.05),C组细胞存活率较A、B组降低(P均<0.05),厄洛替尼、氯喹两药联用的CI<1.Spc-A1细胞A、B、C组细胞凋亡率分别为21.1％、12.1％、48.9％,高于D组的8.3％(P均<0.05),A549细胞A、B、C组细胞凋亡率分别为19.3％、13.4％、51.5％,高于D组的10.2％(P均<0.05),两种细胞的C组细胞凋亡率均高于A、B组(P均<0.05);A、B、C组细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅰ表达减少而LC3-Ⅱ表达增多(P均<0.05),C组较A、B组细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅰ表达减少而LC3-Ⅱ表达增多(P均<0.05).结论 氯喹可增敏厄洛替尼对EGFR野生型NSCLC细胞增殖的抑制作用,且增敏不受K-RAS基因表型限制;其机制可能与氯喹阻断细胞自噬和促进细胞凋亡有关.
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花生四烯酸对TNF-α/放线菌素D诱导内皮细胞凋亡的影响及作用机制
目的 探讨花生四烯酸对TNF-α/放线菌素D(ActD)诱导内皮细胞凋亡的影响及作用机制.方法 将体外培养的人脐静脉内皮细胞随机分成空白组、模型组、环氧二十碳四烯酸(EET)组及EET+3-甲基腺嘌呤(3MA)组.空白组常规培养;后三组均加入TNF-α(10 ng/mL)和放线菌素D(ActD,5 ng/mL)诱导凋亡,EET组同时加入14,15-EET(100 nmol/L),EET+3MA组同时加入14,15-EET(100 nmol/L)、3MA(2 mmol/L).各组培养24 h时采用流式细胞仪检测细胞凋亡率;采用Western blotting法检测微管相关蛋白轻链3-Ⅰ(LC3-Ⅰ)及微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ),计算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ;采用ELISA法检测Caspase-8、Caspase-9活性.结果 空白组、EET组及EET+3MA组细胞凋亡率均较模型组减少(P均<0.01),EET+3MA组细胞凋亡率较EET组增加(P<0.05).EET组及EET+3MA组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ较模型组、空白组增加(P<0.05或<0.01);EET+3MA组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ较EET组降低(P<0.01).模型组、EET组、EET+3MA组Caspase-8、Caspase-9活性均较空白组升高,模型组均较EET+3MA组、EET组升高,EET +3MA组较 EET 组升高,组间比较 P <0.05或 <0.01.结论 花生四烯酸可抑制TNF-α/ActD诱导的内皮细胞凋亡;通过抑制Caspase-8、Caspase-9活性诱导自噬可能是其作用机制.
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褪黑素对小鼠肝癌细胞自噬功能的影响及机制
目的 探讨褪黑素对小鼠肝癌细胞自噬信号通路的影响及作用机制.方法 BALB/c小鼠30只,随机分为对照组、10 mg/kg褪黑素组、20 mg/kg褪黑素组各10只,3组均皮下注射接种小鼠肝癌H22细胞株,接种剂量为1×106细胞/100 μL,10 mg/kg褪黑素组、20 mg/kg褪黑素组分别腹腔注射10、20 mg/kg褪黑素0.2 mL,1次/d,连续14d,对照组注射等量生理盐水;腹腔注射后14 d处死小鼠,取出肿瘤组织,电镜下观察自噬液泡总数,荧光显微镜下计算微管相关蛋白轻链3(microtubule associated protein light chain 3,LC3)-Ⅱ阳性细胞占总细胞数的百分率,Western blot法检测LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及Beclin-1、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt(phosphorylated Akt,P-Akt)和哺乳动物雷帕霉素蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、磷酸化mTOR (phosphorylated mTOR,P-mTOR)表达水平.结果 腹腔注射后14 d,10、20 mg/kg褪黑素组自噬液泡总数[(9.00±2.00)、(11.00±2.00)个]、LC3-Ⅱ阳性细胞百分率[(33.33±10.41)％、(39.67±8.52)％]均高于对照组[(3.00±1.00)个、(10.76±9.17)％],20 mg/kg褪黑素组高于10 mg/kg褪黑素组(P＜0.05);腹腔注射后14 d,10、20 mg/kg褪黑素组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值(51.75±10.82、46.32±8.24)、Beclin-1水平(82.74±16.52、81.63±18.07)均高于对照组(3.45±1.76、17.33±8.62),10 mg/kg褪黑素组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值高于20mg/kg褪黑素组(P＜0.05),Beclin-1水平与20 mg/kg褪黑素组比较差异无统计学意义(P＞0.05);10、20 mg/kg褪黑素组P-Akt/Akt (38.29±7.88、46.57±9.96)、P-mTOR/mTOR值(28.77±8.16、37.84±6.76)均低于对照组(112.46±8.95、108.85±6.74),10 mg/kg褪黑素组低于20mg/kg褪黑素组(P＜0.05).结论 褪黑素可通过上调Beclin-1表达,抑制Akt、mTOR的磷酸化来抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路活化,进而促进细胞自噬.
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三氧化二砷诱导的视网膜母细胞瘤SO-Rb50细胞自噬的研究
背景 细胞的自噬是肿瘤细胞非凋亡形式的死亡过程,研究证实三氧化二砷(As2O3)可诱导肿瘤细胞凋亡,但As2O3是否可致SO-Rb50细胞发生自噬的研究鲜有报道. 目的 探讨As2O3体外诱导SO-Rb50细胞自噬的作用. 方法 用浓度为0.5、1.0、2.0、4.0tμmol/L的As2O3培养液及不含As2O3的未处理组处理SO-Rb50细胞系48 h,采用MTT法测定各As2O3浓度组SO-Rb50细胞的吸光度(A570)值.构建自噬标志物磷酸化绿色荧光蛋白(pGFP)-LC3体外转染SO-Rb50细胞,并分为新鲜RPMI-1640培养组(未处理组)、As2O3RPMI-1640培养组(As2O3处理组)和rapamycin培养组(阳性对照组),于48 h后行激光共焦显微镜检测细胞自噬；用自噬特异性染料单丹磺酰戊二胺(MDC)行荧光染色检测SO-Rb50细胞的自噬,并用透射电子显微镜检测SO-Rb50细胞的自噬表现,采用流式细胞仪定量检测不同浓度As2O3处理组自噬泡阳性细胞百分比. 结果 未处理组和0.5、1.0、2.0、4.0 μmol As2O3作用48 h后SO-Rb50细胞的A570值分别为2.194±0.066、1.841 ±0.213、1.035±0.046、0.374±0.042和0.167±0.019,总体比较差异有统计学意义(F=547.636,P＜0.05),其中各浓度As2O3组A570值均明显低于未处理组,差异均有统计学意义(均P=0.000).As2O3处理组和阳性对照组可见GFP-LC3融合蛋白呈点状聚集在相应的自噬泡,未处理组GFP-LC3呈弥散分布.透射电子显微镜检查可见未处理组SO-Rb50细胞超微结构正常,As2O3处理组和阳性对照组见大量双层膜状结构及自噬溶酶体.未处理组48 h见极少量MDC阳性荧光颗粒,As2O3处理组及阳性对照组48 h可见明显的MDC阳性荧光颗粒,聚集在细胞质相应的自噬发生区.流式细胞术检测发现未处理组和0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/L As2O3及rapamycin作用48 h后自噬泡阳性的SO-Rb50细胞百分比分别为0、15.6％、42.7％、57.9％、79.5％和89.0％,随As2O3浓度的增加MDC阳性细胞百分比递增. 结论 As2O3抑制SO-Rb50细胞的生长和增生,并致SO-Rb50细胞发生自噬；SO-Rb50细胞经As2O3处理后,自噬的发生早于细胞核的改变,早中期自噬程度呈明显的As2O3浓度依赖性.
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自噬相关基因Beclin1和微管相关蛋白轻链3在胃癌组织中的表达及临床意义
目的 检测自噬相关基因Beelin 1和微管相关蛋白轻链3(LC3)在胃癌组织中的表达,探讨其与胃癌临床病理参数及患者预后的关系.方法 应用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法分别检测96例胃癌石蜡组织和癌旁组织中Beclin 1和LC3的蛋白表达水平.应用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和Western blot检测27例新鲜胃癌组织和相应癌旁组织中mRNA和蛋白的表达.结果 新鲜胃癌组织中Beclin l mRNA(ΔCt:5.90±1.52)及蛋白(1.060±0.112)的表达水平较癌旁组织(ΔCt:7.50±1.22;0.964±0.130)高,两者之间差异有统计学意义(=4.87,t=4.643,P＜0.05).新鲜胃癌组织中LC3 mRNA(ΔCt:5.00±1.34)及蛋白(1.115±0.111)的表达水平较癌旁组织(ΔCt:6.62±1.51;1.002±0.134)高,两者之间差异有统计学意义(t=5.90,t=5.653,P＜ 0.05).在胃癌石蜡组织中,Beclin l蛋白和LC3表达阳性率(67.7％、64.6％)均高于癌旁组织(45.8％、40.6％),差异有统计学意义(P＜0.01).Beclin 1蛋白和LC3均与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移以及临床分期有关(P＜0.05).Beclin 1和LC3蛋白阳性表达患者的5年生存率明显低于阴性表达者(P＜0.01).结论 Beclin 1和LC3蛋白表达增高与胃癌的发生、发展相关,提示其发挥着癌基因的作用.
