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不同粒径SiO2颗粒诱导细胞自噬的研究
目的 探讨不同粒径二氧化硅(SiO2)颗粒诱导的细胞自噬,进一步阐明其机制.方法 以体外培养的支气管上皮细胞(BEAS-2B)为模型,随机分为对照组和SiO2(Si200,Nano-Si60,Nano-Si40)颗粒暴露组,暴露浓度为25 μg/ml.采用透射电子显微镜(TEM)观察SiO2粒径、形貌及分散性.细胞处理24 h后,MTT法测定细胞活力;透射电子显微镜观察SiO2颗粒摄取及细胞自噬超微结构;Western blot检测3-MA预处理后自噬标志蛋白LC3的表达.结果 电镜显示3种SiO2颗粒分布均匀,大小一致,颗粒呈球形,分散性好,未发生聚集.用Image J软件计算得到颗粒平均粒径分别为46.26 ±5.68 nm、61.51 ±7.82 nm和206.31 ±6.35 nm.与对照组相比,SiO2颗粒作用于BEAS-2B细胞后,细胞活力下降(P＜0.05);电子显微镜观察显示Nano-Si60和Nano-Si40处理组细胞内呈现出自噬泡累积,自噬泡内含有明显的高电子密度SiO2颗粒及被部分降解的细胞内物质并伴有不同程度的线粒体损伤;Western blot显示LC3蛋白水平在Nano-Si60和Nano-Si40处理组有明显变化,加入3-MA预处理后LC3表达受到抑制.结论 SiO2颗粒可降低支气管上皮细胞存活率,并具有剂量和粒径依赖趋势;纳米级SiO2颗能够诱导细胞发生自噬而微米级SiO2颗粒则不诱导细胞自噬;3-MA能够在一定程度上抑制SiO2颗粒诱导细胞自噬发生.
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3-甲基腺嘌呤预处理对大鼠多发性创伤后急性肺损伤的保护作用
目的:通过3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对多发性创伤模型大鼠进行预处理,探讨自噬在多发性创伤后急性肺损伤中的作用.方法:4月龄成年雄性SD大鼠45只,体重250～300 g,按照随机数字表随机分为3组:假手术组,对照组及3-MA组.假手术组仅在颅骨相应位置钻孔;3-MA组及对照组均采用液压打击器及自制骨折打击器制备股骨干骨折合并脑损伤模型,且分别于造模前1h给予10 mg/kg的3-MA或等量生理盐水.各组大鼠于术后48 h分别采用实时荧光定量PCR检测肺部LC-3Ⅱ及Beclin-1的表达;ELISA法检测肺部炎症因子TNF-d、IL-6的浓度;HE染色观察肺部的组织病理学改变.结果:术后48 h,对照组大鼠肺部LC-3Ⅱ及Beclin-1的mRNA水平明显高于假手术组(P＜0.01),而3-MA组上述基因的表达显著低于对照组(P＜0.01);术后48 h,对照组大鼠肺部的TNF-d及IL-6浓度明显高于假手术组,3-MA组上述因子的浓度显著低于对照组(P＜0.01).3-MA组大鼠肺组织病理评分显著低于对照组(P＜0.01).3-MA组大鼠肺组织病理评分显著低于对照组(P＜0.01).结论:自噬可以加重股骨干骨折合并脑损伤后的急性肺损伤,而采用其抑制剂3-MA进行预处理可以降低细胞自噬水平,进而减轻肺部的损害.
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自噬对双去甲氧基姜黄素诱导肝癌HepG2细胞凋亡作用的影响
目的:探讨自噬对双去甲氧基姜黄素诱导肝癌HepG2细胞凋亡作用的影响.方法:以24 mg·L-1双去甲氧基姜黄素或联合5 mol·L-1自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤 (3-methyladenine, 3-MA) 对HepG2细胞作用24, 48 h, 以四甲基偶氮唑盐 (methye thiazolye telrazlium, MTT) 比色法检测细胞活力;以24 mg·L-1双去甲氧基姜黄素单用或联合3-MA对HepG2细胞作用48 h, Hoechst 33342染色倒置荧光显微镜观察细胞凋亡形态, 磷脂结合蛋白V/碘化丙啶 (Annxin V/propidium iodide, PI) 双染检测细胞凋亡率, 罗丹明123 (Rhodamine 123, Rh123) 染色检测线粒体膜电位, 蛋白免疫印迹法 (Western blot) 检测自噬相关蛋白Beclin-1, LC3, 半胱氨酸蛋白酶-3 (Caspase-3), 活化型Caspase-3 (cleaved Caspase-3), B淋巴细胞瘤-2 (Bcl-2), Bcl-2相关X蛋白 (Bax) 的活性表达.结果:与空白组比较, 双去甲氧基姜黄素可抑制HepG2细胞增殖, 诱导细胞凋亡, 降低线粒体膜电位, 使pro-Caspase-3, Bcl-2, LC3-Ⅰ蛋白表达降低 (P＜0.01), 升高cleaved Caspase-3, Bax, Beclin-1, LC3-Ⅱ蛋白的表达 (P＜0.01);3-MA可增强双去甲氧基姜黄素所诱导的HepG2细胞凋亡, 提高凋亡率 (P＜0.01), 增加其降低线粒体膜电位作用 (P＜0.01), 明显下调pro-Caspase-3, Bcl-2蛋白的表达 (P＜0.01), 并上调Beclin-1, LC3, cleaved Caspase-3蛋白的表达 (P＜0.01) .结论:双去甲氧基姜黄素可经线粒体机制诱导HepG2细胞凋亡, 并诱导细胞自噬, 自噬对凋亡有抑制作用.
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苦参碱诱导人白血病耐药细胞K562/IM自噬和凋亡的研究
目的 观察苦参碱对人白血病耐药细胞K562/IM自噬和凋亡的影响.方法 (1)苦参碱及伊马替尼对细胞增殖及自噬情况检测:分别设空白对照组、不同浓度(0.25、0.50、1.00、2.00、5.00 mg/mL)苦参碱组和(0.05、0.25、0.50、5.00、20.00 μmol/L)伊马替尼组,MTF检测K562细胞和K562/IM细胞抑制率.分别设置空白对照组、0.4 mg/mL苦参碱组和0.5 μmol/L伊马替尼组,免疫荧光激光共聚焦检测K562细胞和K562/IM细胞自噬现象,Western Blot检测细胞中自噬标志蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62的表达.(2)苦参碱联合3-甲基腺嘌呤(3-MA)或雷帕霉素(rapamycin,Rapa)诱导K562/IM细胞自噬及凋亡情况变化的检测:实验分6组,空白对照组、苦参碱组(0.4 mg/mL苦参碱处理)、3-MA组(5 mmol/L3-MA处理)、Rapa组(0.5 μmol/L Rapa处理)、苦参碱+3-MA组(0.4 mg/mL苦参碱+5 mmol/L3-MA处理)、苦参碱+ Rapa组(0.4 mg/mL苦参碱+0.5 iμmol/L Rapa处理),采用MTT检测细胞的抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡水平;Western Blot检测细胞自噬标志蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62及凋亡相关蛋白Caspase-3表达.结果 (1)苦参碱和伊马替尼作用K562、K562/IM细胞,细胞增殖受抑制明显(P＜0.05),LC3-Ⅱ/Ⅰ的聚集明显增加,Beclin-1及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达升高,P62蛋白表达减少(P＜0.05),以K562/IM细胞更明显(P＜0.05).(2)苦参碱组K562/IM细胞增殖抑制率(36.32±2.21)％,凋亡率(15.35±0.39)％.苦参碱+3-MA组K562/IM细胞增殖抑制率升高[(65.25±2.06)％,P＜0.01)],凋亡率升高[(21.70±0.48)％,P ＜0.05],同时Beclin-1及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达下降,P62蛋白表达增强,Caspase-3表达增强(P＜0.05);而苦参碱+Rapa组作用则相反.结论 苦参碱和伊马替尼均可抑制K562、K562/IM细胞增殖的同时可诱导自噬,以耐药K562/IM细胞株自噬明显.通过3-MA抑制自噬可增强苦参碱对细胞K562/IM作用的敏感性,而雷帕霉素减弱苦参碱作用.
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细胞自噬水平在大鼠缺血/再灌注肺组织内变化及其作用
目的 探讨大鼠肺缺血再灌注后肺组织内自噬水平的变化和自噬在肺缺血再灌注损伤中的作用.方法 大鼠分为假手术组和缺血1 h再灌注0、2、6 和24 h组,免疫印迹法检测自噬标志蛋白LC3-Ⅱ的表达,电子显微镜观察细胞内自噬体.自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)和安慰剂分别预处理假手术组和缺血再灌注2 h组大鼠,HE染色和血气分析检测肺组织损伤程度.结果 LC3-Ⅱ/Actin比值在缺血1h时即有升高,再灌注2～6h达高峰(P＜0.01),再灌注24 h恢复至接近假手术组水平.主要在Ⅰ型肺泡上皮细胞和血管内皮细胞内观察到自噬体.3-MA预处理降低肺组织损伤评分,升高血氧分压,减轻肺缺血再灌注损伤(P＜0.05).结果证实,肺缺血及再灌注诱发肺组织呼吸膜细胞自噬激活,3-MA预处理通过抑制自噬改善肺缺血再灌注损伤.结论 细胞自噬可能是肺缺血再灌注病理生理过程中加重损伤的因素.
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3-甲基腺嘌呤对顺铂诱导HeLa细胞凋亡的影响
目的 采用自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制自噬,观察其对顺铂(DDP)诱导HeLa细胞凋亡的影响,探讨自噬在DDP诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡中的作用.方法 用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)观察3-MA对DDP抑制HeLa细胞生长情况的影响;倒置相差显微镜观察细胞形态变化;间接免疫荧光法检测自噬标志蛋白LC3和p62的变化;Hoechst荧光染色检测细胞凋亡.结果 MTT法显示,3-MA与DDP联合应用导致HeLa细胞生长抑制率增加;光镜结果显示,3-MA与DDP联合应用加剧了HeLa细胞收缩变圆,促进死亡;间接免疫荧光法检测到3-MA与DDP联合应用减弱了DDP诱导的HeLa细胞LC3聚集及其与p62的共定位;Hoechst荧光染色检测到3-MA与DDP联合应用增加HeLa细胞凋亡率.结论 3-MA抑制自噬能够促进DDP诱导HeLa细胞发生凋亡.
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激活自噬减轻心肺复苏后Wistar大鼠脑损伤
目的 观察自噬(autophagy)在心肺复苏(CPR)后Wistar大鼠脑损伤中的作用.方法 实验一:36只健康成年雄性Wistar大鼠通过体外交流电刺激诱发心室颤动(VF),VF (0)前和ROSC后1、2、4、8、12 h取大脑皮层观察beclin-1和LC3Ⅱ的表达.实验二:60只Wistar大鼠随机(随机数字法)分为对照组(control)、自噬激活剂雷帕霉素组(Rapamycine)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤组(3-MA).VF前1h分别向腹腔内注入生理盐水或雷帕霉素1 mg/kg或3-甲基腺嘌呤30 mg/kg.ROSC后2、4h取大脑皮层,用电镜和Western blot方法观察神经元自噬的激活,免疫荧光观察LC3颗粒的形成;24、48、72 h进行NDS评分;72h后取大脑皮层行HE染色和TUNEL染色计数顶叶皮层存活神经元细胞数和凋亡神经元细胞数.beclin-1、LC3Ⅱ表达和神经元计数用单因素方差分析,NDS比较用秩合检验.结果 实验一中28只Wistar大鼠复苏成功.ROSC后2、4h自噬基因beclin-1和LC3Ⅱ的表达明显低于VF前(P＜0.05),而ROSC后8、12h的表达与VF前差异无统计学意义.Rapamycine组动物ROSC后2、4h大脑皮层beclin-1的表达和LC3Ⅱ的转换明显高于Control组和3-MA组,P＜0.05.ROSC后2、4 h Rapamycine组自噬泡数量明显多于Control组和3-MA组;ROSC后4 h Rapamycine组LC3颗粒数也明显多于Control组和3-MA组.ROSC后72 h Rapamycine组动物大脑皮层存活的神经元细胞数多于Control组和3-MA组(P＜0.05);凋亡神经元细胞数Rapamycine组少于Control组和3-MA组(P＜0.05).ROSC后24、48、72 h Rapamycine组的NDS评分优于control组和3-MA组(P＜0.05).结论 ROSC后早期大脑皮层神经元beclin-1和LC3-Ⅱ表达下降,通过雷帕霉素促进beclin-1和LC3-Ⅱ表达可以保护神经元细胞和改善神经功能.
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3-甲基腺嘌呤调控自噬对大鼠内皮祖细胞促进静脉血栓再通的影响
目的 观察自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)调控大鼠骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)自噬,探讨其对静脉血栓再通的影响.方法 密度梯度法取大鼠骨髓EPCs,体外诱导分化并鉴定.建立大鼠静脉血栓模型.实验分为4组:单纯生理盐水组(对照组,A组)、单纯3-MA组(5 mmol/L 3-MA,B组)、单纯EPCs组(C组)和3-MA联合EPCs组(5 mmol/L 3-MA作用于EPCs 24h,D组),每组各20只大鼠.在血栓形成后的10天经大鼠尾静脉注入各组试剂,再过14天取标本.苏木精-伊红染色(HE)及vWF免疫组化染色观察血栓机化再通情况,并在镜下计数各组毛细血管数目,取其平均值.结果 (1)D组经HE及免疫组化染色观察发现新生血管多,与其余各组比较差异均有统计学意义(P＜ 0.05)；(2)C组分别与A组和B组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；(3)A组与B组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 5 mmol/L 3-MA调控自噬后的EPCs经大鼠尾静脉注射可促进大鼠静脉血栓再通,且比单纯注射EPCs效果更好.
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3-甲基腺嘌呤对大鼠内皮祖细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响
目的 观察3-甲基腺嘌呤(3-methlyadenine,3-MA)对大鼠骨髓源性内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)增殖、凋亡及细胞周期的影响.方法 密度梯度法取大鼠骨髓EPCs,体外诱导分化并鉴定.实验分对照及不同浓度(1.25、2.5、5、10 mmol/L)3-MA组.四氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法测细胞增殖,流式细胞仪测凋亡率及细胞周期.结果 (1)5 mmol/L组促EPCs增殖;10 mmol/L组抑制EPCs增殖,差异有统计学意义(P＜0.05).其余两组对EPCs增殖无明显影响,差异无统计学意义(P＞0.05).(2)10 mmol/L组促EPCs凋亡,差异有统计学意义(P＜0.05).其余各组对EPCs凋亡率无明显影响,与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).(3)5、10 mmol/L组影响细胞周期,5 mmoL/L组G0/G1期细胞减少、S和G2/M期增加;10 mmol/L组发生S期阻滞,G2/M细胞减少;差异有统计学意义(P＜0.05).结论 3-MA对EPCs增殖及凋亡的影响与其浓度有关,当浓度为10 mmol/L时抑制增殖并促进凋亡.
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3-甲基腺嘌呤诱发HeLa细胞自噬及抑制辐照细胞自噬的双重作用
目的 了解PI3K抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对电离辐射后细胞自噬的影响,初步探讨作用机制.方法 细胞增殖-毒性试剂盒CCK-8检测不同浓度3-MA处理及60Co γ射线4Gy照射或联合3-MA作用的HeLa细胞细胞生长变化和毒性,Annexin Ⅴ-FITC/PI双标记检测细胞凋亡,Western blot检测自噬相关蛋白SQSTM 1/p62表达,Lipofectamine 2000介导转染GFP-LC3质粒,共聚焦显微镜检测自噬体形成.结果 3mmol/L以上浓度3-MA作用24h对HeLa细胞增殖有明显的抑制作用,作用更长时间产生致死毒性效应.无论是5mmol/L 3-MA单独作用还是单独4Gy照射,均能诱发HeLa细胞自噬.但3-MA与(射线辐照联合作用时,HeLa细胞自噬受到抑制,细胞凋亡显著增加.结论 PI3K抑制剂3-MA既诱发细胞自噬又能抑制电离辐射诱发细胞自噬,以在不同的条件下两种方式影响细胞存活.
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肺组织细胞自噬在内毒素诱导的急性肺损伤中发挥保护作用
目的 探讨在内毒素(lipopolysaccharide,LPS)诱导的急性肺损伤(acute lung injury,ALI)中肺组织细胞自噬是否发挥保护作用.方法 24只小鼠随机分为3组,每组8只.对照组(C):腹腔注射生理盐水;LPS组(L):腹腔注射LPS(30mg/kg);LPS+自噬拮抗剂组(L+3MA):在注射LPS前30min,腹腔注射3-MA(15mg/kg).结果 肺组织细胞自噬被抑制后(p62水平增高,LC3Ⅱ/Ⅰ水平及电镜每高倍镜视野的自噬小均数下降,差异有统计学意义(P＜0.05)),肺损伤加重,即TNF-α、IL-6、肺泡灌洗液中总蛋白及肺泡灌洗液中IgM浓度明显升高,差异有统计学意(P＜0.05).结论 肺组织细胞自噬在内毒素诱导的急性肺损伤中发挥保护作用.
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自噬调控剂研究进展
自噬是一种高度保守的经溶酶体介导的对细胞内蛋白质和细胞器降解、维持细胞内环境自身稳定的过程，广泛存在于真核细胞中，它与细胞的正常生长发育进程以及炎症、肿瘤等多种疾病的发生发展有着密切的联系。多数情况下，自噬对细胞或机体是作为一种保护机制，但有时也可以导致细胞的死亡。近几年来，自噬成为生物学领域研究中的一个新热点，而自噬调控剂的研发也应运而生。自噬调控剂通过不同的机制发挥作用，有望通过对其的深入研究为相关疾病的预防和诊治提供新方法。
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自噬在5-氟尿嘧啶抑制胆囊癌GBC-SD细胞生长中的作用
目的 通过抑制胆囊癌GBC-SD细胞自噬的方法检测自噬在化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)抑制GBC-SD细胞生长过程中的作用,探讨胆囊癌对化疗药物不敏感的可能机制及自噬抑制剂作为胆囊癌辅助治疗药物的价值.方法 通过不同自嗜抑制剂[氯喹(CQ)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)]预处理或沉默自噬相关基因5和7后,对比GBC-SD细胞在5-FU作用下增殖率、活性抑制率、凋亡率及细胞周期各时相变化.采用免疫印迹法检测5-FU处理后GBC-SD细胞中LC3-Ⅱ、p62表达水平.采用透射电镜检测空白处理组,5-FU处理组细胞中自噬小泡数量.通过荧光显微镜观察转染GFP-LC3质粒的GBC-SD细胞中的绿色荧光点.流式细胞仪检测CQ预处理12 h后,5-FU诱导下细胞凋亡率.结果 药物处理或基因沉默方法抑制自噬均能增加5-FU对GBC-SD细胞的毒性作用,导致细胞凋亡增加及G0/G1期阻滞.5-FU对GBC-SD细胞增殖及细胞活性的抑制率与其作用时间及浓度呈正比,其中10 μmol/L浓度下5-FU对GBC-SD细胞的抑制率可达30%左右,对比CQ、3-MA或5-FU单独处理组,分别使用100 μmol/L CQ 或5 mmol/L 3-MA预处理GBC-SD细胞12 h后,5-FU作用下GBC-SD细胞的增殖率显著下降,且该趋势差异有统计学意义,免疫印迹结果显示5-FU处理可增强GBC-SD细胞中LC3-Ⅱ表达水平,下调p62表达水平.透射电镜检测结果显示对比空白处理组,5-FU处理组细胞中自噬小泡数量明显增多.荧光显微镜观察转染GFP-LC3质粒的GBC-SD细胞,发现5-FU处理组中绿色荧光点明显增多.流式细胞仪检测发现,CQ预处理12 h后,5-FU诱导下细胞凋亡率由34.3%上升至46.2%.结论 5-FU处理可诱导GBC-SD细胞发生自噬,通过抑制自噬可增强5-FU对该细胞的化疗效果.
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自噬调节剂对莱菔硫烷诱导Caco-2细胞自噬效应及UGT1A1表达的影响
目的 观察以人结肠腺癌细胞Caco-2为模型,探讨3-甲基腺嘌呤(3-MA)及雷帕霉素(Rapa)对莱菔硫烷(SFN)诱导细胞自噬及葡萄糖醛酸转移酶1A1 (UGT1A1)的影响.方法 采用Western印迹法测定微管相关蛋白1轻链3(LC3)和UGT1A1,采用免疫荧光法观察LC3的胞内分布及核因子E2 P45相关因子2(Nrf2)的核内转位,实时荧光定量PCR法测定UGT1A1、人孕烷X受体(hPXR)的mRNA表达.结果 SFN对LC3-Ⅱ蛋白的诱导呈浓度和时间依赖性,3-MA及Rapa可分别减弱或增强LC3-Ⅱ蛋白的表达；与对照组相比,Rapa、SFN及SFN+Rapa可诱导UGT1A1 mRNA的表达增强(分别为对照组的2.4倍、4.12倍、2.41倍,均P＜0.01),且诱导UGT1A1蛋白的表达增强；对照组未见明显的Nrf2核内荧光标记,而含有SFN的处理组中可见强烈的Nrf2核内荧光标记,且SFN+Rapa更为明显；与对照组相比,Rapa及SFN+Rapa的hPXR mRNA表达增强(分别为对照组的1.82倍、1.4倍,均P＜0.01).结论 3-MA和Rapa可分别减弱或增强SFN对Caco-2细胞自噬效应的诱导；Rapa可进一步增强SFN对UGT1A1的诱导；Rapa联合SFN可能通过同时激活Nrf2和hPXR增强了对UGT1A1的诱导.
关键词： 莱菔硫烷 3-甲基腺嘌呤 雷帕霉素 细胞自噬 葡萄糖醛酸转移酶1A1 -
自噬抑制剂对乙醇诱导的肝星状细胞活化作用的影响
目的：观察自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）对乙醇诱导的肝星状细胞（HSC）活化作用，并探讨其作用机制。方法体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6，设立空白对照组、阳性对照组（乙醇刺激组）、低剂量组（5 mmol/L 3-MA+100 mmol/L乙醇）、高剂量组（10 mmol/L 3-MA+100 mmol/L乙醇）。RT-PCR分析各组HSC活化标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及Ⅰ型胶原基因表达，Western blot法检测各组HSC中自噬水平标志蛋白LC3Ⅱ、α-SMA、Ⅰ型胶原表达；MTT法检测3-MA对乙醇诱导的HSC增殖的影响。结果与空白对照组比较，阳性对照组中α-SMA、Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达及LC3Ⅱ表达量明显增加（P＜0.05），高剂量组却显著减少（P＜0.01）；与阳性对照组比较，低剂量组和高剂量组中α-SMA、Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达及LC3Ⅱ表达量逐渐减少（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组中α-SMA、Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达及LC3Ⅱ表达减少（P＜0.05）。与阳性对照组比较，加入3-MA处理后的HSC增殖显著减少（P＜0.05）。结论3-MA可抑制乙醇诱导的HSC-T6细胞中LC3Ⅱ蛋白的表达、α-SMA、Ⅰ型胶原mRNA及蛋白的表达，抑制HSC增殖，且高剂量的作用更明显。
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自噬与骨髓间充质干细胞放射损伤的关系
背景：骨髓间充质干细胞在造血干细胞致死放射剂量下却能够存活，并且仍能维持典型的干细胞特性，促进放射后的造血恢复，而自噬是细胞在应激状态下重要的适应性调控机制，可能参与骨髓间充质干细胞的放射耐受。目的：探索放射诱导的自噬与人骨髓间充质干细胞在放射损伤过程中的关系。方法：取体外培养的处于对数生长期的第3代骨髓间充质干细胞，随机分为对照组、3-甲基腺嘌呤组、雷帕霉素组、照射组、照射联合3-甲基腺嘌呤组和照射联合雷帕霉素组，3-甲基腺嘌呤组和雷帕霉素组细胞分别使用5 mmol/L自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤和200 nmol/L自噬激活剂雷帕霉素干预12 h，照射组细胞接受单剂量6 Gy X射线照射2 h，照射联合3-甲基腺嘌呤组和照射联合雷帕霉素组分别在接受相应药物干预12 h后，接受6GyX射线照射2h。结果与结论：对照组中自噬泡阳性细胞及凋亡细胞所占比例均较低；照射组中自噬泡阳性细胞及凋亡细胞比例较对照组均明显升高，且可见较高比例的自噬+凋亡细胞；应用3-甲基腺嘌呤后，自噬泡阳性细胞比例明显下降，凋亡细胞比例明显升高，但自噬+凋亡细胞比例与照射组相比无显著差异；而给予雷帕霉素后发现自噬泡阳性细胞显著高于照射组，但凋亡细胞比例与照射组相比无明显差异，并且未观察到自噬+凋亡细胞。对照组与3-甲基腺嘌呤组微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ蛋白表达水平均很低；雷帕霉素组与照射组微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ蛋白表达水平较对照组均明显升高，但照射组低于雷帕霉素组；照射联合3-甲基腺嘌呤组微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ蛋白表达明显低于照射组，但仍高于对照组，照射联合雷帕霉素组微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ蛋白表达较照射组和雷帕霉素处理组均明显升高。提示自噬可能对骨髓间充质干细胞具有放射保护作用。
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3-甲基腺嘌呤对急进高原缺氧大鼠肠上皮细胞损伤的自噬影响研究
目的：探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对急进高原缺氧大鼠肠上皮细胞自噬水平及损伤程度的影响。方法将50只Wistar大鼠随机分成5组( A~E组),在低氧氧舱环境下建立急进高原缺氧大鼠肠上皮细胞损伤模型,用3-MA进行处理,肉眼观察各组大鼠的行为学改变,HE染色分析大鼠肠组织的损伤程度,免疫组织化学检测自噬相关蛋白LC-3、Beclin-1的表达情况,RT-PCR方法检测LC-3、Beclin-1 mRNA的表达情况。结果3-MA作用于缺氧大鼠肠上皮细胞后,肠组织的病理性损伤明显加重,自噬相关蛋白LC-3、Beclin-1及其相关mRNA表达也显著降低,细胞自噬水平下降。结论3-MA可能通过降低细胞自噬水平加重急进高原缺氧肠上皮细胞损伤,细胞自噬可能是急进高原缺氧肠上皮细胞损伤过程中的重要保护因素之一。
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3－甲基腺嘌呤对喜树碱诱导的宫颈癌Hela细胞凋亡的影响
目的：本研究探讨自噬抑制剂3－甲基腺嘌呤（3－methyladenine，3－MA）对喜树碱（Camptothecin，CPT）诱导的Hela细胞凋亡的影响。方法：用四甲基偶氮唑盐比色法（ MTT方法）检测CPT对Hela细胞作用的佳药物浓度和时间，以及不同药物对Hela细胞增殖活性的影响；用免疫印迹及免疫荧光检测不同药物作用于Hela细胞后，Hela细胞自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3（microtubule－associated protein 1 light chain 3，LC3）、p62及凋亡相关蛋白的变化；DAPI核染色观察细胞凋亡。结果：CPT作用于Hela细胞后，Hela细胞增殖活性明显下降，并且可诱导自噬现象的发生。 CPT和3－MA联合作用较单独CPT作用Hela细胞的增殖活性降低，细胞自噬水平下降，凋亡率明显升高。结论：CPT在诱导Hela细胞凋亡的同时可诱导自噬，通过3－MA抑制自噬可增强Hela细胞对CPT作用的敏感性。
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自噬抑制剂3-MA对乳胞素抑制胃癌BGC-823细胞增殖的影响及其机制
目的 探讨联合应用自噬抑制剂3-Methyladenine(3-MA)和蛋白酶体抑制剂乳胞素(Lactacystin,LAC)对胃癌细胞系BGC-823增殖的影响及其机制.方法 体外培养BGC-823细胞,MTT法检测BGC-823细胞增殖率,Western印迹检测线粒体凋亡相关蛋白Cytochrome C以及内质网凋亡相关蛋白caspase-4表达水平.结果 与对照组相比,蛋白酶体抑制剂LAC可以引起明显的BGC细胞增殖率的下降,联合应用3-MA可以增加其引起的细胞增殖率的下降,Western印迹结果显示LAC可以上调线粒体凋亡相关蛋白CytochromeC以及内质网凋亡相关蛋白caspase-4表达水平,联合应用3-MA和LAC可以进一步引起表达水平的升高.结论 自噬抑制剂3-MA可以增加LAC引起的细胞凋亡,通过线粒体和内质网凋亡信号通路.
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自噬对口腔鳞状细胞癌 CAL-27和 KB 细胞放疗敏感性的影响及其机制
目的：利用自噬抑制剂联合放射疗法作用于口腔鳞状细胞癌 CAL-27和 KB 细胞，探讨自噬对口腔癌放射治疗敏感性的影响及其作用机制。方法：选择人口腔鳞状细胞癌 CAL-27和 KB 细胞，分为对照组、氯喹（CQ）组、3-甲基腺嘌呤（3-MA）组、放射组（IR 组）及联合放射组（CQ＋ IR 组和3-MA＋ IR 组）。应用MTT 法检测细胞生存率，采用免疫荧光法激光共聚焦显微镜观察 CAL-27细胞自噬水平（即 LC3Ⅱ免疫荧光强度），Western blotting 法检测自噬相关蛋白 LC3和 beclin-1表达水平，AnnexinV／PI 双染色流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：与 IR 组比较，联合放射组细胞生存率明显降低（P ＜0.05）。IR 组细胞自噬水平明显高于对照组、CQ 组、3-MA 组和联合放射组（P ＜0.05）。IR 组 LC3和 beclin-1蛋白表达水平明显高于对照组和联合放射组（P ＜0.05）。与对照组比较，IR 组和联合放射组细胞凋亡率明显升高（P ＜0.05）；与 IR 组比较，联合放射组细胞凋亡率也明显升高（P ＜0.05）。结论：放射疗法可以诱导口腔鳞状细胞癌细胞自噬水平升高。自噬抑制剂可以通过对口腔鳞状细胞癌细胞的增殖抑制及促凋亡作用，提高其对放射治疗的敏感性。
