首页 > 文献资料
-
3-甲基腺嘌呤增强口腔鳞癌体外化疗药物敏感性的作用机制
目的:通过在口腔鳞癌Tca83细胞培养过程中加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA),观察顺铂(DDP)对口腔鳞癌Tca83细胞的杀伤作用,探讨3-MA增强口腔鳞癌化疗药物敏感性的作用机制.方法:将对数生长期口腔鳞癌Tca83细胞分为对照组、3-MA处理组、DDP处理组、3-MA+ DDP处理组和DDP+ 3-MA处理组,用MTT法检测细胞生存率,激光共聚焦显微镜检测自噬特异性蛋白LC3-Ⅱ的表达水平,Annexin VFITC流式细胞术检测细胞凋亡率.结果:Tca83细胞株对顺铂IC50值为5mg·L-1；MTT检测,DDP组细胞生存率显著低于对照组和DDP+3-MA组(P＜0.05),高于3-MA+ DDP组(P＜0.05)；细胞免疫荧光检测,3-MA组平均荧光强度显著低于其他4组(P＜0.05)；流式细胞术检测,DDP组细胞凋亡率显著低于3-MA+DDP组(P＜0.05),高于DDP+3-MA组(P＜0.05).结论:不同水平的自噬对口腔鳞癌细胞的作用不同,抑制细胞自身基础水平的自噬可增强DDP对Tca83细胞的杀伤作用,提示自噬抑制剂有望成为口腔鳞癌的化疗增敏剂.
-
3-甲基腺嘌呤对染矽尘大鼠肺组织胶原纤维mRNA表达的影响
[目的]探讨3-甲基腺嘌呤(3-MA)对染矽尘大鼠肺组织胶原纤维mRNA表达的影响. [方法]80只健康雄性大鼠建立矽肺模型,随机分为对照组和3-MA组,3-MA组腹腔注射1.5 mg/(kg·d)3-MA,隔天给药持续28d,染尘不同时间处死,HE染色观察大鼠肺组织病理组织学变化,测定肺组织中羟脯氨酸、Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维mRNA含量.[结果] HE染色显示,3-MA组每个时间点肺组织纤维化程度均比对照组轻,随着染尘时间延长肺组织纤维化有不同程度的改变.3-MA组大鼠7d(0.39±0.02)、14d(0.43±0.01)、28 d(0.36±0.02)、60 d(0.34±0.04)、90d(0.49±0.03)肺组织羟脯氨酸含量均低于同一时间点对照组大鼠(0.41±0.03,0.48±0.01,0.49±0.02,0.60±03.02,0.73 ±0.03)(P＜0.05),不同时间点羟脯氨酸含量差异有统计学意义(F=55.99,P＜0.05).3-MA组7d肺组织Ⅰ型胶原纤维mRNA含量(1.11±0.30)比对照组(0.83±0.13)高,除28d外其余各时间点(14d:0.70±0.23,60d:0.92±0.08,90d:1.38±0.37)均低于对照组(14d:1.06±0.16,60d:1.10±0.25,90d:2.06±0.66)(P＜0.05),不同时间点其差异有统计学意义(H=23.36,P＜0.05).3-MA组7d肺组织Ⅲ型胶原mRNA含量较高(0.77±0.19),在14d(0.44±0.26)、28 d(0.35±0.09)及60d(0.31±0.06)时呈现下降趋势,90d(1.44±0.31)时又再度升高,各时间点差异有统计学意义(H=28.77,P＜0.05),各时间点其含量均低于对照组(7d:0.83±0.13,14d:1.06±0.16,28d:0.98±0.11,60d:1.10±0.25,90d:2.06±0.67)(P＜ 0.05). [结论] 3-MA干预后,与对照组相比同一时间点及同一组不同时间大鼠肺组织胶原纤维mRNA表达不同,影响大鼠矽肺纤维化发生发展进程.
-
艾司西酞普兰对MPTP处理的PC12细胞的保护作用及机制
目的:探讨艾司西酞普兰(ESC)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)处理的PC12细胞的保护作用及其机制.方法:用不同浓度ESC或/和不同浓度MPTP处理PC12细胞,再用3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制;通过MTS检测细胞存活率,Hoechst 33258染色观察细胞凋亡,免疫印迹检测自噬标记物LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ和凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达.结果:经筛选得出,10 μmol/L ESC预处理PC12细胞1h,再加入1 000 μmol/L MPTP处理24 h,细胞存活率显著提高;Hoechst 33258染色显示细胞核固缩明显减少;ESC+MPTP组LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Bcl-2/Bax表达水平较MPTP组显著上升,但ESC+MPTP+3MA组LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Bcl-2/Bax表达水平均显著下降.结论:ESC对MPTP处理的PC12细胞有一定的神经保护作用,可能通过PI3K/Akt途径激发自噬作用,提高了Bcl-2的表达,抑制MPTP引发的细胞凋亡,从而发挥对其保护作用.
-
大鼠心肌细胞自噬H9C2/GFP-LC3稳定株的构建
目的:在大鼠心肌细胞H9C2(2-1)中建立表达绿色荧光蛋白融合微管相关蛋白3(GFP-LC3)的稳定细胞株,为研究心肌细胞自噬提供合适的细胞模型.方法:将表达增强的绿色荧光蛋白融合微管相关蛋白3的质粒(pEGFP-LC3)瞬时转染人胚肾-293T细胞(HEK-293T),通过荧光观察和免疫印迹对质粒进行鉴定;将质粒用同样的方法转染H9C2(2-1)细胞,G418筛选出稳定表达GFP-LC3的细胞株,通过观察荧光和免疫印迹检测GFP-LC3在H9C2中的表达;稳定细胞株在缺氧1h复氧0、6、12、48 h和60 h的模型中,荧光显微镜观察GFP在细胞质中的表达,免疫印迹检测内源性LC3的变化;确定荧光及内源性LC3的高表达时相,用3-甲基腺嘌呤(3MA)进行自噬抑制后观察荧光及内源性LC3蛋白表达情况.结果:荧光观察和免疫印迹检测到GFP-LC3在H9C2中的表达,成功建立了表达GFP-LC3的H9C2稳定株;筛选出荧光及内源性LC3的高表达时相为缺氧1h复氧48 h,在此模型中,GFP-LC3在细胞质中聚集成点状,内源性LC3表达显著升高,细胞经3MA处理后点状聚集减少,内源性LC3表达减弱.结论:成功建立了过表达GFP-LC3的H9C2稳定株,该细胞株为研究心肌细胞自噬奠定了基础.
-
二氧化硅致肺泡巨噬细胞自噬对其自身分泌肿瘤坏死因子-α和转化生长因子-β的影响
目的:研究自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对二氧化硅(SiO2)诱导的肺泡巨噬细胞自噬的激活,是否对自身分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和转化生长因子-β(TGF-β)产生影响.方法:收集SD雄性大鼠肺泡巨噬细胞灌洗液,将其随机分为对照组,SiO2刺激组(SiO2组),自噬抑制剂组(3-MA组).采用体外暴露肺泡巨噬细胞染尘法,染尘成功后12 h给予10 mmol/L 3-MA干预.分别于干预后6、18、24h和36 h用胰酶消化并收集体外培养的肺泡巨噬细胞.采用H-E染色观察肺泡巨噬细胞形态学改变;免疫细胞化学检测肺泡巨噬细胞中TNF-α和TGF-β的定位表达;免疫印迹检测肺泡巨噬细胞中TNF-α和TGF-β的蛋白定量.结果:SiO2组与对照组相比肺泡巨噬细胞体积增大,胞质丰富,部分细胞胞质内可见矽尘吞噬颗粒.3-MA组较SiO2组肺泡巨噬细胞形态改变减轻.与对照组相比,SiO2组各时间相肺泡巨噬细胞中TNF-α和TGF-β的蛋白表达显著升高,于SiO2刺激后6h开始升高,18h达高峰,24 h与36 h回落,但仍高于对照组水平.3-MA组可以显著下调SiO2组对应时间点肺泡巨噬细胞中TNF-α和TGF-β的表达.结论:自噬抑制剂3-MA抑制肺泡巨噬细胞自噬后可以下调肺泡巨噬细胞中TNF-α和TGF-β的表达及释放,进而促进炎症损伤的修复.
-
自噬基因Beclin-1和微管相关蛋白LC3在大鼠阿霉素心肌病中的表达及其意义
目的 探讨自噬基因Beclin-1及微管相关蛋白LC3在大鼠阿霉素心肌病中的表达及其意义,初步证实自体吞噬(autophagy)参与了大鼠阿霉素心肌病的发病,并探讨其机制.方法 雄性SD大鼠45只,随机分为3组,阿霉索(ADR)组、阿霉素(ADR)+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组和对照组.建立大鼠阿霉素心肌病模型,电镜观察自噬体形态及数量,检测心肌组织中Beclin-1含量及LC3含量.结果 ADR组大鼠心肌组织自噬体的数甚较对照组及ADR+3-MA组增多;ADR组心肌组织中Beclin-1水平及LC3含量均较对照组及ADR+3-MA组增高.结论自噬性程序性细胞死亡参与了阿霉素心肌病的发病.
-
自噬的抑制影响长春新碱诱导的肝癌细胞自噬性凋亡
目的研究自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤 (3-methyladenine,3MA)对长春新碱(vincristine,VCR)诱导的肝癌细胞系HepG2细胞自噬性凋亡的影响.方法利用已建立的VCR诱导HepG2细胞自噬性凋亡之模型,采用monodansylcadaverin (MDC)染色及流式细胞术荧光强度测定方法对自噬进行定量研究,采用流式细胞术及DNA电泳检测细胞凋亡.结果 3MA可以特异性地阻止自噬泡形成,还可以部分地抑制HepG2细胞自噬性凋亡.结论自噬是VCR诱导的HepG2细胞自噬性凋亡所必需的.
关键词： 自吞噬作用/药物作用 凋亡 长春新碱 3-甲基腺嘌呤 -
3-甲基腺嘌呤对低氧状态下上皮性卵巢癌细胞自噬、迁移和侵袭的影响
目的·检测3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对低氧状态下上皮性卵巢癌细胞(epithelial ovarian carcinoma,EOC)自噬、迁移和侵袭的影响.方法·不同浓度的3-MA处理低氧环境下EOC细胞,Western blotting检测自噬相关蛋白LC3的表达,透射电子显微镜观察自噬体的生成,噻唑蓝比色法、黏附试验、Transwell迁移试验和Matrigel侵袭试验分别测定EOC细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭能力.结果·3-MA可以抑制低氧环境诱导的LC3-Ⅱ表达增加以及自噬体生成.低氧环境下,5.00 mmol/L的3-MA作用24 h可显著降低EOC细胞存活率(P=0.000);2.50 mmol/L的3-MA作用6h后,细胞的黏附能力显著降低(P=0.007);1.25 mmol/L和2.50 mmol/L的3-MA均可抑制低氧环境下EOC细胞的迁移和侵袭能力(均P＜0.01).结论·3-MA在抑制低氧状态下EOC细胞自噬的同时,具有抗细胞迁移和侵袭的作用.
-
法舒地尔对血管紧张素Ⅱ诱导的足细胞自噬的影响
目的:探讨Rho激酶抑制剂法舒地尔对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导人足细胞(AB 8/13)自噬的影响. 方法:体外培养人足细胞株,采用不同浓度的AngⅡ(10-8～10-6 mol/L)刺激人足细胞24h和固定浓度AngⅡ(10-7moVL)刺激不同时间(0h、6h、12h、24h、36h),以及特异性自噬阻断剂3-MA(5 mmol/L)和不同浓度(10-8～1O-6mol/L)法舒地尔进行干预.免疫荧光法和Westem印迹法检测自噬相关蛋白[微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、Beclin-1]的表达变化. 结果:AngⅡ可刺激足细胞LC3B、Beclin-1蛋白表达上调,且呈剂量、时间依赖性(P＜0.05),在浓度10-7mol/L AngⅡ和时间24h时达高峰.3-甲基腺嘌呤(3-MA)能明显降低AngⅡ引起的LC3B蛋白表达(P＜0.01).法舒地尔本身对足细胞自噬没有影响,但可以明显下调AngⅡ诱导的足细胞LC3B和Beclin-1蛋白表达(P＜0.05),10-7mol/L时效果明显. 结论:AngⅡ可诱导人足细胞自噬增强,3-MA和法舒地尔均可抑制此过程的发生,提示Rho激酶途径可能参与了AngⅡ诱导的足细胞自噬过程.
-
中波紫外线诱导人皮肤成纤维细胞自噬对凋亡影响的初步研究
[目的]探讨不同剂量中波紫外线(UVB)照射人皮肤成纤维细胞诱导的自噬对细胞凋亡活性的影响.[方法]人皮肤成纤维细胞来自于23岁健康男性环切术后包皮的原代培养,连续传代培养后取第3～ 10代的细胞进行实验.通过单丹酰戊二胺(MDC)染色和免疫荧光标记微管相关蛋白1轻链3(LC3)的方法,确定不同剂量3-甲基腺嘌呤(3-MA)对自噬的抑制作用.UVB照射后立即加入0.5 mmol/L 3-MA孵育细胞4h作为自噬的抑制方法.Hoechst和碘化丙啶(PI)染色结合Annexin V-异硫氰酸荧光索(FITC)和PI标记细胞后流式细胞仪检测作为细胞凋亡的定性和定量方法.[结果]0.5 mmol/L 3-MA能明显抑制人皮肤成纤维细胞自噬活性(饥饿诱导组自噬细胞阳性百分数为63.037％±5.876％,3-MA孵育后下降至34.425％±5.183％).空白对照组、30、50、100mJ/cm2UVB照射组标记LC3绿色荧光信号逐渐增强,照射后立即对上述4组加入3-MA孵育4h则LC3蛋白表达差异不明显.0.5 mmol/L 3-MA对细胞活性影响小.50 mJ/cm2 UVB照射下加入3-MA孵育较未加3-MA孵育细胞强Hoechst和强PI双染细胞增多；100 mJ/cm2 UVB照射后加3-MA孵育较未加3-MA孵育细胞强Hoechst和强PI双染细胞减少.Annexin V -FITC和PI标记细胞后流式细胞仪分析显示,在50 mJ/cm2 UVB照射下,抑制自噬的细胞中晚期凋亡水平[( 10.933±0.839)％]较未抑制细胞[(7.267±0.473)％]上升,两者之间差异具有统计学意义(t=5.20,P＜ 0.05)；而在100mJ/cm2UVB照射下,抑制自噬的细胞中晚期凋亡水平[(7.100±0.781)％]较未抑制细胞[( 10.133±0.681)％]下降,两者之间差异具有统计学意义(t=6.29,P＜ 0.05).[结论]50 mJ/cm2 UVB照射诱导人皮肤成纤维细胞自噬通过抑制凋亡对细胞起到保护作用,而在100 mJ/cm2 UVB照射下发生的较高水平自噬可能诱导了自噬性细胞死亡.
-
西罗莫司和3-甲基腺嘌呤对人皮肤成纤维细胞自噬水平及分泌基质金属蛋白酶1、3影响的研究
目的 研究西罗莫司和3-甲基腺嘌呤(3-MA)对人皮肤成纤维细胞自噬水平及分泌基质金属蛋白酶i(MMP-1)、MMP-3的影响.方法 取健康男性环切术后的包皮进行人皮肤成纤维细胞的原代培养,分别用浓度为20、50、100、250 nmol/L的西罗莫司和浓度为0.5、2.0、5.0、10.0 mmol/L的3-MA进行处理,并设立空白对照,然后测定各组细胞自噬体的水平,并用ELISA法测定各组细胞分泌MMP-1和MMP-3的量.结果 0、20、50、100、250 nmol/L西罗莫司各组自噬阳性细胞百分比分别为59.075％±6.884％、76.350％±5.226％、85.063％±6.002％、86.288％±5.558％、96.825％±1.500％,除50 nmol/L组与100 nmol/L组差异无统计学意义(P＞0.05)外,其余各组间差异均有统计学意义(P＜0.01).0、0.5、2.0、5.0、10.0 mmol/L 3-MA各组的自噬阳性细胞百分比分别是63.037％±5.876％、34.425％±5.183％、19.700％±3.028％、12.900％±3.334％、7.775％±2.293％,各组间差异均有统计学意义(P＜0.01).而250 nmol/L西罗莫司组和10.0 mmol/L 3-MA组MMP-1及MMP-3的水平明显上升,与对照组之间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 西罗莫司可以明显上调人皮肤成纤维细胞自噬水平,低浓度时对MMP的影响尚不明确,高浓度时使MMP的分泌增加；而3-MA则抑制自噬的水平,使MMP的分泌增加,并与其浓度有一定相关性.
-
3-甲基腺嘌呤对人耐药大肠癌SW480细胞增殖及自噬活性的影响
目的:研究自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对耐5-氟尿嘧啶(5-Fu)结肠癌SW480细胞增殖及自噬活性的影响,探讨自噬抑制剂在逆转结直肠癌耐药中的作用.方法:浓度递增筛选法诱导耐5-Fu(100 μg/L)的SW480细胞株,用10 μmol/L浓度的3-MA处理后,再用5-Fu(浓度200 μμg/L)作用24 h.采用CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率,丹酰戊二胺(MDC)染色和电镜检测细胞自噬活性变化.结果:3-MA对耐药细胞自噬活性的抑制率达89.7％,增殖抑制率为9.6％,凋亡率为5.7％,与对照组比较差异具有统计学意义(P＜ 0.05).经3-MA处理后,5-Fu对耐药SW480细胞增殖抑制率达71.6％±2.9％,凋亡率达36.6％±2.9％,而单用5-Fu细胞增殖抑制率仅为23.6％±2.9％,凋亡率仅为10.3％±2.5％,3-MA预处理后5-Fu对耐药细胞的增殖抑制率及凋亡率均明显增强(P＜ 0.05),自噬泡数量显著减少,自噬活性明显降低(P＜o.05).结论:3-MA单用时仅有较弱的抗肿瘤作用,与5-FU联用时耐药细胞的增殖及自噬活性被显著抑制,增强了SW480耐药细胞对5-Fu的敏感性,提高了化疗效果.
-
3-甲基腺嘌呤对EPCs超微结构和LC3-Ⅱ蛋白表达的影响研究
目的 探索3-甲基腺嘌呤(3-MA)对大鼠骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)超微结构和自噬体膜型(LC3-Ⅱ)蛋白表达的影响.方法 采用密度梯度法取大鼠骨髓EPCs,体外诱导分化并鉴定;分成对照组和4个3-MA浓度组(分别加入1.25、2.5、5、10mmol/L 3-MA).采用单丹(磺)酰戊二胺(MDC)荧光染色和透射电镜观察3-MA给药后EPCs自噬的发生.Western blot检测3-MA给药后EPCs内LC3-Ⅱ蛋白表达的变化.结果 MDC荧光染色和透射电镜均观察到5、10 mmol/L组EPCs超微结构明显区别于正常及死亡细胞,是典型的凋亡形态图.Western blot检测3-MA给药24h后EPCsLC3-Ⅱ蛋白表达降低;与对照组比较,5、10 mmol/L组LC3-Ⅱ蛋白表达明显降低(P＜0.05).结论 5、10mmol/L的3-MA对EPCs超微结构和LC3-Ⅱ蛋白表达均有影响,推测浓度≥5mmol/L的3-MA能抑制EPCs的自噬.
-
幽门螺杆菌对胃黏膜上皮细胞自噬和凋亡的影响
目的：探讨幽门螺杆菌(Hp)对胃黏膜上皮细胞(GES-1)自噬和凋亡的影响。方法：Hp与GES-1体外共培养，同时设立雷帕霉素(RAPA)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)干预组及空白对照组，于2、4、6、12及24 h终止感染，通过免疫蛋白印迹、荧光染色、透射电镜、流式细胞术及细胞内活菌计数等方法观察Hp对GES-1自噬和凋亡的影响。结果：Hp+GES-1组在2 h出现自噬标志蛋白LC3-Ⅱ表达及细胞内荧光自噬颗粒，透射电镜观察到细胞内出现双层或多层膜包裹的自噬小体样结构，细胞自噬在4 h达高峰，感染中后期逐渐减弱并消失；RAPA+Hp+GES-1组细胞自噬程度进一步增强，细胞凋亡率及细胞内活菌数均降低(P<0.05~P<0.01)；3-MA+Hp+GES-1组细胞自噬强度显著降低，而其细胞凋亡率和细胞内活菌数均明显升高(P <0.01)。结论：Hp可在感染早期诱导GES-1自噬；RAPA和3-MA可增强或降低自噬发生程度，从而减轻或促进细胞损伤。
-
低氧微环境下自噬对顺铂处理的肺腺癌A549细胞增殖活性的影响
目的 观察在低氧环境下自噬对人肺腺癌A549 细胞化疗敏感性的影响.方法 常规低氧培养人肺腺癌A549 细胞,分为低氧对照组及低氧+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组,分别采用透视电子显微镜观察不同时间点细胞自噬体的变化,West-ern blot 检测自噬标记蛋白微管相关蛋白1 轻链3(LC3)蛋白表达,分析LC3II/LC3I 比值变化.随后每组再给予顺铂(DDP)处理后,采用MTT 比色法检测细胞增殖活性.结果 低氧状态下,A549 细胞自噬体形成增加,LC3II/LC3I 蛋白比值表达升高,加入自噬抑制剂3-MA 后,自噬体数量、LCII/LCI 比值较单纯低氧组均下降.予顺铂处理后,低氧+3-MA 组细胞增殖活性较低氧组下降.结论 在低氧环境中,A549 细胞保护性自噬增强,抑制自噬可增强A549 细胞对顺铂化疗的敏感性.
-
3-甲基腺嘌呤对顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡影响的研究
目的:探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对顺铂(DDP)诱导的卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响.方法:体外培养卵巢癌SKOV3细胞,用PI3K/Akt通路抑制剂3-MA预处理SKOV3细胞3h,再用DDP作用48h,经Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测凋亡率,TUNEL法检测凋亡指数(AI),Western blot检测凋亡蛋白caspase3,caspase9的表达.结果:3-MA预处理后,DDP诱导的卵巢癌SKOV3细胞凋亡率为(37.04±7.15)％,凋亡指数为58.0±5.20,而单用DDP组凋亡率为(10.46±0.65)％,凋亡指数为26.0±3.46.3-MA预处理后,DDP诱导的SKOV3细胞凋亡率和凋亡指数均较单用DDP组明显提高(P＜0.05).caspase3,caspase9蛋白的表达也明显增强.结论:3-MA可上调caspase3,caspase9蛋白的表达,通过内源性途经增强DDP促卵巢癌细胞SKOV3的凋亡活性.
关键词： 卵巢肿瘤 3-甲基腺嘌呤 细胞凋亡 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 -
花生四烯酸对TNF-α/放线菌素D诱导内皮细胞凋亡的影响及作用机制
目的 探讨花生四烯酸对TNF-α/放线菌素D(ActD)诱导内皮细胞凋亡的影响及作用机制.方法 将体外培养的人脐静脉内皮细胞随机分成空白组、模型组、环氧二十碳四烯酸(EET)组及EET+3-甲基腺嘌呤(3MA)组.空白组常规培养;后三组均加入TNF-α(10 ng/mL)和放线菌素D(ActD,5 ng/mL)诱导凋亡,EET组同时加入14,15-EET(100 nmol/L),EET+3MA组同时加入14,15-EET(100 nmol/L)、3MA(2 mmol/L).各组培养24 h时采用流式细胞仪检测细胞凋亡率;采用Western blotting法检测微管相关蛋白轻链3-Ⅰ(LC3-Ⅰ)及微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ),计算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ;采用ELISA法检测Caspase-8、Caspase-9活性.结果 空白组、EET组及EET+3MA组细胞凋亡率均较模型组减少(P均<0.01),EET+3MA组细胞凋亡率较EET组增加(P<0.05).EET组及EET+3MA组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ较模型组、空白组增加(P<0.05或<0.01);EET+3MA组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ较EET组降低(P<0.01).模型组、EET组、EET+3MA组Caspase-8、Caspase-9活性均较空白组升高,模型组均较EET+3MA组、EET组升高,EET +3MA组较 EET 组升高,组间比较 P <0.05或 <0.01.结论 花生四烯酸可抑制TNF-α/ActD诱导的内皮细胞凋亡;通过抑制Caspase-8、Caspase-9活性诱导自噬可能是其作用机制.
-
3MA对Ce6-PDT诱导结肠癌SW620细胞凋亡及自噬的影响
目的 探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3MA)对Ce6-PDT诱导结肠癌SW620细胞凋亡及自噬的影响.方法 取对数生长期SW620细胞,分为空白对照组、单纯光照组、Ce6-PDT组和3MA-Ce6-PDT组,Ce6-PDT组加入不同浓度Ce6(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μg/mL),3MA-Ce6-PDT组给予1.0μg/mL的Ce6+5 mmol/mL的3MA.采用MTT法测算细胞存活率;AnnexinV-PE/7-ADD染色及罗丹明123联合流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞线粒体膜电位变化;吖啶橙染色联合荧光显微镜观察细胞自噬体形成;蛋白免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(Bcl-2)及自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表达.结果 Ce6-PDT组细胞存活率与Ce6浓度浓度呈负相关(r=-0.820,P<0.01),细胞凋亡率与Ce6浓度呈正相关(r=0.845,P<0.01).选取细胞存活率和细胞凋亡率约为50%时Ce6浓度1μg/mL为后续给药浓度.在Ce6浓度达到1μg/mL时,线粒体膜电位随Ce6浓度增加而降低(P<0.01).空白对照组和单纯光照组几乎没有亮红色荧光产生,Ce6-PDT组中有大量亮红色荧光出现,3MA-Ce6-PDT组中出现亮红色荧光的数量较Ce6-PDT组减少.与Ce6-PDT组相比,3MA-Ce6-PDT组细胞存活率降低、细胞凋亡率升高、自噬相关蛋白表达降低、凋亡相关蛋白表达增加(P均<0.05).结论 Ce6-PDT可引起结肠癌SW620细胞发生凋亡和自噬,3MA会促进Ce6-PDT诱导的结肠癌细胞SW620凋亡.
-
细胞自噬在儿童急性B淋巴细胞白血病化疗抵抗中的作用
目的 以长春新碱(VCR)处理的人急性B淋巴细胞白血病细胞(BLCs)为模型,研究细胞自噬在儿童急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)化疗中的作用.方法 将BLCs随机分为对照组、药物组、阻断组和联合组,分别加入等体积的PBS、1μg/mL的VCR、10 mmol/L的细胞自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)、1μg/mL的VCR+10 mmol/L的3-MA处理48 h,采用WST-1法测算细胞增殖抑制率,免疫印迹法检测自噬相关蛋白轻链3β(LC3β).结果 处理细胞48 h后,药物组、阻断组和联合组细胞增殖抑制率分别为9.7%±3.3%、63.4%±9.1%、80.6%±8.3%;各组间两两比较,P均<0.01.对照组、药物组、阻断组和联合组LC3β蛋白表达量分别为0.02±0.01、0.31±0.05、0.01±0.01、0.02±0.01,药物组高于其他组(P均<0.01),其余各组间比较无统计学意义.结论 细胞自噬可在ALL化疗过程中活化导致化疗抵抗.
-
雷帕霉素和3-甲基腺嘌呤对帕金森病小鼠运动行为及黑质自噬相关蛋白LC3的影响
目的 探讨自噬诱导剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对C57BL/6帕金森病(PD)模型小鼠运动行为及自噬相关蛋白LC3的影响.方法 取40只C57BL/6雄性小鼠随机分为实验组和正常对照组,实验组又分为MPTP模型组、雷帕霉素组、3-MA组,每组10只.实验组采用MPTP腹腔注射建立PD模型,正常对照组给予等量生理盐水腹腔注射.雷帕霉素组和3-MA组在MPTP注射的同时分别予雷帕霉素、3-MA腹腔注射.各组小鼠在后1次MPTP或生理盐水注射后1d、7d、14 d分别进行行为学测试,后1次行为学测试后处死小鼠取中脑黑质脑组织,Western Blot检测自噬相关蛋白LC3的表达.结果 与MPTP模型组比较,雷帕霉素组小鼠的爬杆时间明显缩短[(14.89±1.14)s vs(16.24±1.39)s,P＜0.05;(15.18±1.36)s vs(17.93±1.11)s,P＜0.01],悬挂分值增加[(1.7±0.5)分vs (1.2±0.4)分,P＜0.05;(1.5±0.5)分 vs(1.1±0.3)分,P＜0.05],旷场实验的总距离[(5875.3±1148.9) cm vs(5061.5±773.1) cm,P＜0.05;(5753.2±1106.7) cm vs(4669.3±969.1) cm,P＜0.01]及平均速度[(19.29±2.35) cm/s vs(16.47±3.01) cm/s,P＜0.05;(18.71±2.71) cm/s vs(15.80±2.50) cm/s,P＜0.01]均增加,LC3-Ⅱ蛋白表达增加,而3-MA组小鼠的爬杆时间延长[(19.92±1.61)svs(17.93±1.11)s,P＜0.05],旷场实验总距离[(3879.7±575.0)cm vs(4669.3±969.1)cm),P＜0.05]及平均速度[(13.34±1.87) cm/s vs(15.80±2.50) cm/s,P＜0.05]减少,LC3-Ⅱ蛋白表达减少.结论 自噬诱导剂雷帕霉素可改善PD小鼠的行为学症状,增加黑质自噬相关蛋白LC3的表达,而自噬抑制剂3-MA则会加重PD小鼠的行为学障碍,减少黑质LC3的表达,调节自噬的药物可能是PD防治的新方向.
