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3-甲基腺嘌呤对反复惊厥新生大鼠大脑皮层自噬相关蛋白Beclin1表达的影响
26,2.252,2.460 Pa<0.05).48.0 h惊厥组Beclin1的表达与对照组比较无显著差异(t=1.502 P>0.05),24.0 h和48.0 h 3-MA组Beclin1的表达与惊厥组比较亦无明显差异(t=1.542,1.285 Pa>0.05).结论 惊厥后Beclin1蛋白水平明显上调,表明白噬途径被激活,3-MA通过抑制Beclin1表达,参与自噬途径的调控.
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姜黄素对小鼠肾脏再灌注后细胞自噬及炎症反应的影响
目的 研究姜黄素对小鼠肾脏缺血再灌注后细胞自噬及炎症反应的影响.方法 选择健康、雄性的C57BL/6小鼠40只,随机数字表法平均分为4组.假手术组小鼠仅接受中线开腹、双侧肾蒂游离及关腹操作;再灌注组、姜黄素组及3-甲基腺嘌呤组小鼠均建立肾脏再灌注模型,并于肾脏缺血同时经尾静脉分别注射生理盐水、姜黄素(10 mg/kg)以及姜黄素(10 mg/kg)+自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(15 mg/kg).再灌注6、24 h检测各组血清肌、尿素氮水平,观察肾脏组织形态学变化;实时定量逆转录聚合酶链(RT-PCR)反应及蛋白印迹法检测肾脏组织内自噬相关分子兔抗小鼠微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beelin 1、RAS相关蛋白7(Rab7)、溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)的mRNA及蛋白表达,同时采用RT-PCR以及酶联免疫吸附实验检测肾组织及血清内白细胞介素6(IL-6)、IL-17、肿瘤坏死因子α(TNF-α)以及IL-10表达水平.结果 与再灌注组相比,姜黄素组小鼠再灌注6及24 h血清肌酐、尿素氮水平明显降低(P＜0.01),肾小管上皮细胞损伤情况明显改善(P＜0.01);肾脏组织内LC3、Beclin 1、Rab7以及LAMP2的mRNA及蛋白表达明显增加,肾脏组织及血清内炎症细胞因子IL-6、IL-17、TNF-α的表达降低,而IL-10的表达升高(P＜0.01).而与姜黄素组相比,3-甲基腺嘌呤组肾功能及肾组织损害加重,自噬相关分子表达减少,炎症细胞因子表达增强而抗炎症细胞因子表达降低(P＜0.01).结论 姜黄素对小鼠肾脏再灌注损伤的保护作用可能与促进再灌注后细胞自噬进而减轻炎症反应有关.
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3-甲基腺嘌呤联合化疗对食管癌原位移植瘤治疗作用及机制
目的 探讨3-甲基腺嘌呤(3-MA)联合紫杉醇及顺铂(TP方案)治疗食管癌原位移植瘤的效果以及作用机制.方法 60只食管癌原位移植瘤模型随机分为对照组、3-MA组、TP化疗组和联合治疗组.4组小鼠治疗30 d后,计算肿瘤体积;采用Western blot分析自噬底物p62和微管相关蛋白1轻链3(LC3)的变化,采用激酶反应分析VPS34激酶活性,采用原位缺口末端标记法(TUNEL)染色分析肿瘤细胞的凋亡,采用高效液相色谱法(HPLC)分析小鼠肿瘤细胞中化疗药物的浓度.结果 与对照组比较,TP化疗组和联合治疗组肿瘤生长明显减缓(P=0.002).与TP化疗组比较,联合治疗组小鼠肿瘤生长速度减缓更明显(P=0.010).与对照组比较,3-MA和联合治疗组小鼠肿瘤组织中p62蛋白明显积累(P=0.000).与对照组LC3-Ⅱ/β3-肌动蛋白(β-actin)比值比较,3-MA和联合治疗组小鼠肿瘤组织中LC3-Ⅱ/β-actin比值明显下降(P=0.000).与对照组比较,3-MA和联合治疗组小鼠肿瘤组织中VPS34激酶活性显著下调(P=0.000).与TP化疗组VPS34激酶活性比较,3-MA和联合治疗组小鼠肿瘤组织中VPS34激酶活性显著下调(P =0.000).与对照组比较,TP化疗组和联合治疗组小鼠肿瘤组织细胞凋亡水平显著增加(P=0.000).与TP化疗组比较,联合治疗组小鼠肿瘤细胞凋亡水平显著升高(P =0.000).结论 3-MA可显著抑制肿瘤细胞自噬,与化疗药物联合可显著提高药物利用率,进而显著提高抗肿瘤效果.
关键词： 3-甲基腺嘌呤 紫杉醇及顺铂联合化疗方案 自噬 食管癌 耐药 -
3-甲基腺嘌呤促进吡柔比星诱导膀胱癌BIU-87细胞凋亡及机制
目的 探讨3-甲基腺嘌呤(3-MA)自噬抑制剂联合吡柔比星(THP)对膀胱癌BIU-87细胞杀伤作用及机制.方法 膀胱癌BIU-87细胞分为对照组、3-MA(10 mmol/L)组、THP(5 mg/L)组、3-MA(10 mmol/L)+ THP(5 mg/L)组.噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测各组细胞中自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅱ、Beclin-1以及凋亡蛋白半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3和Caspase-9的表达.结果 药物作用24h后,各组细胞增殖率分别为(86.64±3.09)％、(63.70±5.62)％、(58.43±3.89)％、(37.55±4.17)％,其中3-MA+THP组细胞增殖下降明显(P ＜0.05);3-MA与THP联合应用后,自噬蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1的表达明显减弱,而凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达在各组中强(P＜0.05).结论 3-MA抑制膀胱癌BIU-87细胞对化疗药物保护性自噬反应,增加膀胱癌细胞对THP细胞毒杀伤作用的敏感性.
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自噬在蛋白酶体抑制剂诱导的食管鳞癌细胞死亡中的作用
目的 观察自噬在蛋白酶体抑制剂MG132诱导的食管鳞癌细胞死亡中的作用.方法 用20 μmol/L MG132和(或)5 mmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理人食管鳞癌EC9706细胞,膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙锭(PI)双染色流式细胞术检测细胞凋亡率；吖啶橙(AO)染色荧光显微镜观察细胞酸性自噬泡的变化；Western blot法检测自噬相关蛋白Beclin-1及凋亡相关蛋白半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-9的表达.结果 流式细胞仪检测示MG132、3-MA及MG132+ 3-MA组细胞凋亡率为(57.37±0.81)％、(9.43±0.15)％、(79.40±0.92)％.MG132组经吖啶橙染色后,细胞内酸性自噬泡明显增加,呈明亮的红色荧光,而加入3-MA联合作用后,则上述现象被抑制.Western blot结果示对照组、MG132、3-MA及MG132+ 3-MA组Beclin-1和Caspase-9相对灰度值分别为0.57 ±0.01、0.90 ±0.03、0.49 ±0.14、0.65±0.01和0.61±0.05、0.88±0.02、0.70 ±0.01、0.98±0.02.结论 MG132可以诱导食管鳞癌细胞凋亡,并可激活其自噬；3-MA可能通过上调Caspase-9的表达增强MG132对食管癌细胞的杀伤作用.
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新生鼠缺氧缺血性脑损伤后自噬水平变化及其与细胞凋亡的关系
目的 研究新生鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后自噬水平的变化规律,通过对Caspase-3的检测探讨自噬水平变化对细胞凋亡的影响.方法 将实验动物分为假手术组、模型组、3-甲基腺嘌呤组及雷帕霉素组,采用Rice法建立HIBD模型,3-甲基腺嘌呤组及雷帕霉素组于造模后0.5 h腹腔注射3-甲基腺嘌呤及雷帕霉素.应用免疫组织荧光化学法检测损伤侧大脑海马及皮层组织自噬相关蛋白Beclin 1的表达,Western-blot法检测Beclin 1表达变化规律,免疫组织化学法检测各组Caspase-3的表达.结果 免疫组织荧光化学检测结果显示,缺氧缺血性脑损伤后能激活自噬现象发生.Western-blot检测结果显示,HIBD后2 h Beclin 1蛋白表达开始增加,24 h达到高峰,持续到168 h.免疫组织化学检测结果显示,3-甲基腺嘌呤组时间点Caspase-3阳性表达显著升高,雷帕霉素组Caspase-3阳性表达显著下降.结论 新生大鼠HIBD模型能激活自噬现象发生,自噬水平增高可抑制细胞凋亡,自噬水平降低可增加细胞凋亡.
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辐射诱导大鼠脑损伤后星形胶质细胞活性及其自噬的变化
目的:探究辐射诱导大鼠脑损伤后星型胶质细胞活性及其自噬的相关变化.方法:取36只体质量为180～200 g的Sprague-Dawley大鼠,进行4 d的Morris水迷宫训练后,随机分为假手术(sham)组、模型(model)组及3-甲基腺嘌呤(3-MA)组,其中model组及3-MA组大鼠经腹腔麻醉后给予单次全脑X线照射,剂量为20 Gy.照射完成后,model组侧脑室注射5μL NaCl,3-MA组侧脑室注射600 nmol 3-MA,饲养8周,用Morris水迷宫进行学习和记忆能力测评后,断头取脑,HE染色观察海马区病理变化.用GFAP的免疫组化和Western blot检测星形胶质细胞活性;用GFAP及LC3的双重荧光染色评定星形胶质细胞自噬的变化;Western blot法测定cleaved caspase-3蛋白水平的变化,TUNEL检测同侧海马区细胞凋亡情况;ELISA法检测肿瘤坏死因子 α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)水平以评估海马区炎症反应.结果:辐射可抑制星形胶质细胞活性,激活星形胶质细胞自噬,加重脑组织损伤.3-MA可促进星形胶质细胞的活化,促进脑组织损伤的修复.结论:大鼠放射性脑损伤后海马区损伤明显,星形胶质细胞数量明显减少,3-MA可显著缓解受损程度.该发现可能会为放射性脑损伤的治疗提供新途径.
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3-甲基腺嘌呤联合曲古霉素A抑制三阴性乳腺癌细胞生长
目的: 探讨自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(TSA)对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231生长的影响及其可能的分子机制.方法: MTT法检测TSA对MDA-MB-231细胞活力的抑制作用;划痕实验检测细胞迁移能力的变化;Western blot检测细胞自噬相关蛋白的变化;MTT法检测3-MA联合TSA对细胞活力的影响.结果: TSA可有效抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长,并呈剂量和时间依赖性;TSA抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力,并诱导细胞发生自噬;3-MA可有效抑制TSA诱导的乳腺癌细胞自噬,并进一步抑制细胞活力,差异有统计学意义.结论: 3-MA可明显增加TSA对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长抑制作用.
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自噬对肾大部切除大鼠肾小管上皮细胞程序性坏死的影响
目的：探讨自噬是否参与肾大部切除（ SNx）大鼠肾小管上皮细胞的过度死亡，及其与程序性坏死的关系。方法：48只雄性SD大鼠随机分为control组（6只）和SNx组（42只），分别行假手术和SNx。将24只SNx大鼠分为0、4、8和12周组；其余SNx大鼠分为SNx＋vehicle组、SNx＋necrostatin－1（ Nec－1）组和SNx＋3－甲基腺嘌呤（3－MA）组，每组6只。检测0、4、8和12周组大鼠肾组织RIP1、RIP3、LC3和beclin－1的mRNA和蛋白表达水平；用Nec－1和3－MA干预SNx大鼠，Western blot法检测LC3－Ⅰ、LC3－Ⅱ和beclin－1的蛋白水平，透射电镜和TUNEL染色判定Nec－1和3－MA对SNx大鼠肾小管上皮细胞死亡的影响，并观察Nec－1和3－MA对SNx大鼠肾组织的病理变化、活性氧簇（ROS）、血尿素氮（BUN）和血肌酐（SCr）含量的影响。结果： SNx术后8周大鼠肾组织RIP1、RIP3、LC3和beclin－1的mRNA和蛋白水平达高值（ P＜0．01）；Nec－1和3－MA干预SNx大鼠的LC3－Ⅱ／Ⅰ和beclin－1蛋白水平、发生程序性坏死的肾小管上皮细胞及TUNEL阳性细胞数量均显著降低（P＜0．01）。另外，Nec－1减低SNx大鼠肾组织的ROS含量，但3－MA无此作用。结论：自噬参与了SNx大鼠肾小管上皮细胞过度死亡；抑制自噬可减轻SNx大鼠肾小管上皮细胞程序性坏死及其肾损伤。
关键词： 肾大部切除 程序性坏死 自噬 necrostatin-1 3-甲基腺嘌呤 -
饥饿诱导肿瘤细胞自噬对细胞周期的影响
背景与目的:无血清饥饿方法可以诱发细胞自噬,同时也可以引起细胞周期阻滞.虽然研究者们对细胞自噬与细胞周期已经进行了深入的研究,但是对于两者之间的关系还是知之甚少.本研究旨在通过研究细胞周期素(Cyclin)在饥饿诱导的细胞发生自噬时表达的变化,来探讨自噬对细胞周期的影响.方法:对照组:d-Hanks液代替培养基饥饿诱导处于对数生长期的HeLa细胞,收获饥饿0、3、6、12 h的细胞.实验组:用d-Hanks液开始饥饿的同时加入3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA),收获饥饿0、3、6、12 h的细胞,用流式细胞术和Western blot法检测细胞周期素和特异性标记自噬的兔抗人微管相关蛋白1轻链3 Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC-3).结果:饥饿3 h对照组HeLa细胞中有LE-3表达,并随饥饿时间延长而逐渐增加.Cyclin E、Cyclin D3在饥饿3 h开始减少,在饥饿6 h降低至低水平,而Cyclin A、Cyclin B1在饥饿6 h开始下降.实验组HeLa细胞在饥饿3 h时LC-3的表达水平较低,随饥饿时间的延长LC-3表达基本不变化,Cyclin D3、Cyclin E、Cyclin A、Cyclin B1表达的下降速度也较对照组减慢.结论:自噬参与饥饿诱导的Cyclin降解的水解过程,Cyclin D3、Cyclin E水解比Cyclin A、Cyclin B1出现早,降解速度快.
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新生期反复惊厥对海马Beclin-1急性期表达的影响及干预
目的 研究新生期大鼠反复惊厥后海马中Beclin-1急性期的表达及3-甲基腺嘌呤(3-MA)的干预作用.方法 生后6d的SD大鼠108只按照随机数字表法分成3组,每组36只,惊厥组每日吸入三氟乙醚诱导惊厥发作5次,每次间隔30 min,连续9 d;对照组同样操作但不吸入三氟乙醚;3-MA组惊厥前腹腔注射3-MA(总量2μL),然后以同样方法吸入三氟乙醚诱导惊厥,方法同惊厥组.3组大鼠于后一次惊厥后1.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h断头取腩,每组每个时间点分别为6只大鼠.采用Western blot分别检测3组大鼠大脑海马中Beclin-1的表达.结果 与对照组同一时间点相比,惊厥组海马组织中Beclin-1的表达明显增多,差异均有统计学意义(P<0.05).与惊厥组同一时间点相比,3-MA组Beclin-1的表达明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 惊厥后自噬途径被激活,3-MA参与了自噬途径的涮控.
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小鼠急性心肌梗死后 IL-1β和 IL-6的动态变化及3甲基腺嘌呤的影响
目的：：探讨小鼠急性心肌梗死( AMI)后炎症因子IL-1β和IL-6的动态变化及3-甲基腺嘌呤对心肌炎症因子IL-1β和IL-6释放的影响。方法：雄性C57BL/6小鼠随机分成四组：假手术组、AMI 1 d组、AMI 7 d组、AMI 21 d组,用超声心动仪检测心功能变化,用荧光定量PCR法、ELISA法和免疫组化法测量血清和心肌组织中炎症因子 IL-1β和 IL-6的变化,用免疫蛋白印迹方法检测心肌组织 IL-1β转换酶caspase-1蛋白的变化情况。在AMI 后给予3-甲基腺嘌呤7 d,用超声心动仪检测心功能变,用ELISA法和免疫组化法测量心肌组织中炎症因子IL-1β和IL-6的变化情况。结果：小鼠冠状动脉左前降支结扎术后7、21 d心功能显著下降。小鼠AMI 后炎症因子IL-1β和IL-6的mRNA水平表达增加,在血清和心肌组织中蛋白含量增加( P<0.05)。小鼠AMI后心肌中caspase-1蛋白表达增加( P<0.05)。3-甲基腺嘌呤加重小鼠AMI 7 d后心脏功能下降(P<0.05),并促进炎症因子IL-1β和IL-6的释放(P<0.05)。结论：小鼠心肌损伤过程中炎症因子IL-1β和IL-6表达增加,其机制可能跟AMI 后caspase-1的增加有关；3-甲基腺嘌呤加重AMI 后心功能的下降,其机制可能与促进炎症因子释放有关。
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3-methyladenine抑制自噬诱导胰腺癌细胞SW1990失巢凋亡
[目的]探讨3-methyladenine(3-MA)对人胰腺癌SW1990细胞增殖、迁移及失巢凋亡的影响作用及其机制.[方法]以胰腺癌细胞SW1990及永生化胰腺导管上皮细胞H6C7为研究对象,设3-MA处理组及PBS对照组,采用软琼脂克隆培养法及Poly-HEMA悬浮培养法筛选抵抗失巢凋亡的细胞.Annexin V-FITC/PI双染和TUNEL试剂盒法检测细胞凋亡；免疫荧光法及透射电镜检测细胞自噬；CCK-8法检测细胞增殖；Transwell小室检测细胞迁移能力.[结果]永生化胰腺导管上皮细胞H6C7处理组及对照组均无集落形成,胰腺癌细胞SW1990处理组形成(2.3±2.63)个集落,对照组形成(9±3)个,与H6C7相比,SW1990具有较强的抵抗失巢凋亡的能力(P＜0.05).3-MA可抑制胰腺癌SW1990细胞自噬(P＜0.05)并抑制其增殖及迁移能力(P＜0.01)且诱导失巢凋亡(P＜ 0.01).[结论]3-MA可诱导胰腺癌细胞SW1990失巢凋亡,其机制可能与细胞自噬受抑有关.
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抗肿瘤药物诱导NK/T细胞淋巴瘤细胞株凋亡的研究
目的 探讨不同化疗方案对NK/T细胞淋巴瘤细胞株(SNK6)的抑制率,并对其可能的相关机制进行研究.方法 应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞仪检测、琼脂糖凝胶电泳检测等方法,研究不同化疗药物对SNK6细胞的诱导凋亡作用;蛋白印迹法检测自噬蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ表达,流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 作用肿瘤细胞48 h的各药物的抑制率与24 h所得的抑制率相比,差异有统计学意义(P＜0.05);作用72 h的各药物抑制率与作用48 h相比,差异无统计学意义(P＞0.05).4组化疗方案抑制率由高到低为:长春瑞滨+表柔比星、多西他赛+表柔比星、多西他赛+多柔比星、长春瑞滨+多柔比星;从实验组细胞中提取的DNA经电泳,紫外灯下可见“梯状带”.进行蛋白印迹法及流式细胞仪检测,抗肿瘤药物联合自噬抑制剂使自噬蛋白下调,细胞凋亡与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 长春瑞滨联合表柔比星诱导SNK6细胞凋亡作用佳,3-MA抑制SNK6细胞对化疗药物保护性自噬反应,增加SNK6细胞对抗肿瘤药物细胞毒杀伤作用的敏感性.
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自噬对低氧微环境中人肺腺癌A549细胞放疗敏感性的影响
背景与目的 已有的研究证明低氧可诱导肿瘤细胞自噬发生,自噬水平与肿瘤放疗敏感性相关,因而调控自噬信号通路是增强放疗敏感性极具潜力的治疗策略.本研究旨在探讨联合应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)下调低氧环境中人肺腺癌A549细胞的自噬水平后对其放疗敏感性的影响.方法 实验设低氧对照组及低氧+3-MA(自噬抑制剂)组,分别采用电镜检测自噬体变化,Western blot检测自噬标记蛋白-微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)蛋白表达,分析LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值变化随后每组再给予直线加速器(0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10 Gy)照射后采用MTT法检测细胞增殖活性.结果 与低氧对照组相比,低氧+3-MA组自噬体数量、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均下降.给予照射后,与低氧对照组比较,低氧+3-MA组细胞增殖活性下降.结论 在低氧环境中,A549细胞保护性自噬增加,抑制自噬可增强A549细胞的放疗敏感性.
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自噬抑制剂3-MA对结直肠癌细胞 Jagged-1蛋白表达及其增殖的影响
目的：：探索自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine 3-MA)对结直肠腺癌细胞Jagged-1蛋白表达及其增殖活性的影响。方法：实验分为对照组和3-MA药物组(5 mmol/L)，利用CCK-8法检测细胞活性；用Annexin/PI双染法检测细胞凋亡率；采用免疫组化和Western blot检测Jagged-1蛋白在两组中的表达差异。结果： Western blot及免疫组化结果表明：3-MA作用后，与对照组比较，结直肠腺癌细胞内Jagged-1蛋白的表达显著被抑制( P<0．05)；3-MA作用后，结直肠腺癌细胞增殖率为(85．23%±5．61%)，与对照组增值率比较具有显著差异(P<0．05)；3-MA作用后，结直肠腺癌细胞凋亡率为(11%± 4．3%)，与对照组凋亡率(4．5%±2．1%)比较差异具有统计学意义(P<0．05)。结论：3-MA可能通过抑制结直肠腺癌细胞中Jagged-1蛋白表达和结直肠腺癌细胞增殖、促进凋亡，从而发挥抗肿瘤生物学作用。
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胶质瘤干祖细胞分化与自噬的相关性研究
目的 观察胶质瘤干祖细胞(GSPCs)诱导分化前后自噬活性的变化,探讨GSPCs分化与自噬的相关性.方法 于干细胞培养基和诱导分化培养基培养GSPCs,分别采用微管相关蛋白轻链3(LC3)免疫荧光染色、透射电镜及Western blot检测GSPCs分化前后自噬活性的变化.GSPCs诱导分化时,加入3-甲基腺嘌呤(3-MA)自噬抑制剂,观察其对GSPCs分化的影响,并采用自噬激活剂雷帕霉素(RPM)行进一步检测.结果 GSPCs分化前,自噬活性低;诱导其分化后,自噬活性增高.加入自噬抑制剂3-MA可抑制GSPCs贴壁分化;Western blot检测示,加入3-MA的GSPCs中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、微管相关蛋白-2(MAP-2)及beclin-1表达量显著低于未加3-MA的GSPCs.GSPCs在含血清条件下培养时,适当浓度的RPM可促进其贴壁分化.结论 GSPCs分化与其自噬活性密切相关.增强GSPCs自噬活性可促进分化,抑制其自噬活性可抑制分化.
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自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤对肝星状细胞增殖活化的影响
目的 观察自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖活化的影响,并探讨其作用机制.方法 体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6,设立空白对照组和3-MA低剂量组(2.5 mmol/L)、中剂量组(5 mmol/L)、高剂量组(10 mmol/L).RT-PCR分析不同浓度3-MA对HSC活化标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及Ⅰ型胶原蛋白基因表达的影响,Western blot法检测不同浓度3-MA对HSC中自噬水平标志蛋白LC3Ⅱ、α-SMA以及Ⅰ型胶原蛋白表达水平的影响；MTT法检测3-MA对HSC增殖的影响,流式细胞术分析3-MA对HSC细胞周期的影响.结果 低、中、高剂量3-MA作用于HSC后,HSC-T6细胞自噬水平随3-MA浓度升高逐渐下降,α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白mRNA相对表达量均明显低于对照组(P＜0.05),LC3Ⅱ、α-SMA以及Ⅰ型胶原蛋白相对表达量均明显低于对照组(P＜0.05).与对照组相比,低、中、高剂量时3-MA对HSC增殖的影响均显著下降(P＜0.05),G2期比例与对照组比较均明显增加(P＜0.05).结论 3-MA可下调大鼠HSC-T6细胞LC3Ⅱ的表达,抑制α-SMA及Ⅰ型胶原蛋白mRNA及蛋白的表达,使HSC-T6细胞周期停滞于G2期,抑制HSC增殖活化.
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3-甲基腺嘌呤对蛋白酶体抑制剂MG132抗卵巢癌A2870细胞作用的影响
目的:研究PI3K通路自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对蛋白酶体抑制剂MG132抗卵巢癌A2870细胞作用的影响.方法:不同浓度MG132处理A2870细胞后,MTT法及Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞的生存率及凋亡改变,吖啶橙(AO)染色和Western-Blot法检测酸性自噬泡的形成及自噬特异性蛋白LC3的变化.3-MA联合MG132处理A2870细胞,MTT法检测细胞的生存率,AO染色和Western blot法检测自噬的改变.结果:MG132可诱导A2870卵巢癌细胞发生增殖抑制及凋亡,同时,酸性自噬泡形成及LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化增强.而3-MA联合MG132明显降低A2870细胞的生存率,但不改变MG132诱导的A2870细胞的自噬水平.结论:3-MA对MG132抗A2870卵巢癌细胞的增强作用与自噬无关.MG132诱导A2870细胞发生的自噬与PI3K通路无关.
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细胞自噬调控大鼠严重烧伤后骨骼肌消耗的机制
目的 探讨细胞自噬调控大鼠严重烧伤后骨骼肌消耗的机制. 方法 取72只SD大鼠,采用随机数字表法分为假伤组、单纯烧伤组、烧伤+磷酸盐缓冲液(PBS)组及烧伤+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组,每组18只.单纯烧伤组、烧伤+PBS组及烧伤+3-MA组大鼠造成30％体表总面积Ⅲ度烫伤(以下称烧伤),假伤组大鼠模拟致假伤.伤后即刻,液体复苏后,烧伤+ PBS组大鼠腹腔注射1 mL PBS,烧伤+3-MA组大鼠腹腔注射1 mL 3-MA(125 g/L).伤后3、7d,称取大鼠右后肢胫骨前肌质量和体质量,计算右后肢胫骨前肌质量百分比;免疫荧光法观察胫骨前肌中微管相关蛋白1(MAP1)轻链3A、Beclin-1的蛋白表达;蛋白质印迹法检测胫骨前肌中Beclin-1及MAP1轻链3A蛋白表达,并计算MAP1轻链3A-Ⅱ/轻链3A-Ⅰ比值.对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、t检验及Bonferroni校正. 结果 伤后3、7d,单纯烧伤组大鼠右后肢胫骨前肌质量百分比分别为(0.148±0.009)％、(0.134 ±0.018)％,明显低于假伤组的(0.203±0.009)％、(0.181±0.015)％(t=10.585、4.913,P＜0.01);烧伤+3-MA组大鼠右后肢胫骨前肌质量百分比分别为(0.187±0.004)％、(0.192±0.009)％,明显高于烧伤+PBS组的(0.162±0.005)％、(0.167±0.005)％(t=9.564、5.948,P＜0.01).伤后3、7d,单纯烧伤组大鼠胫骨前肌中Beclin-1、MAP1轻链3A蛋白表达量明显高于假伤组,烧伤+3-MA组大鼠胫骨前肌中Beclin-1、MAP1轻链3A蛋白表达量明显低于烧伤+ PBS组;单纯烧伤组大鼠胫骨前肌中MAP1轻链3A-Ⅱ/轻链3A-Ⅰ比值明显高于假伤组(t=3.461、3.353,P＜0.05),烧伤+3-MA组大鼠胫骨前肌中MAPI轻链3A-Ⅱ/轻链3A-Ⅰ比值明显低于烧伤+ PBS组(t=3.129、3.977,P＜0.05). 结论 严重烧伤诱导的细胞自噬参与大鼠骨骼肌消耗进程,抑制细胞自噬可能会有助于缓解烧伤导致的大鼠骨骼肌消耗.
