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氯丙烯对大鼠大脑神经元中β-actin的影响
目的研究骨架蛋白β-actin在氯丙烯引起的周围神经病中的作用.方法采用原代培养的大鼠大脑神经元,用相差显微镜观察细胞形态,同时用免疫组化方法分析测定细胞内β-actin含量的变化.结果氯丙烯使大脑神经元中β-actin含量显著下降,低剂量组降低52%,高剂量组降低85%(P＜0.01).结论提示氯丙烯急性中毒可导致大鼠大脑神经元中β-actin含量降低.
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20例人早孕绒毛滋养细胞的体外培养
目的 建立快速、有效的绒毛滋养细胞体外培养的方法. 方法 采用0.25％胰酶和Ⅱ型胶原酶混合消化法消化绒毛组织,用胰蛋白酶消化传代体外培养,通过光镜对培养出的细胞进行形态评价；用细胞角蛋白和波形蛋白单克隆抗体检测细胞纯度. 结果 联合消化法的细胞生长迅速,接种6～8d可以传代,原代细胞生长时间明显缩短,所得细胞纯度达95％. 结论 联合消化法是一种较有效的人早孕绒毛滋养细胞培养方法.
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益心康对体外感染CVB3病毒心肌细胞凋亡相关因子caspase-3 mRNA和颗粒酶B、穿孔素表达的影响
目的 研究中药益心康对感染柯萨奇B3病毒(Coxsackie virus B,CVB3)新生乳鼠体外心肌细胞凋亡相关基因caspase-3 mRNA和颗粒酶B、穿孔素(PFP)表达的影响,探讨中药益心康治疗病毒性心肌炎的作用机制.方法 原代培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,建立体外感染CVB3的心肌细胞模型,将心肌细胞分为4组:正常对照组、病毒组、中药益心康组及利巴韦林组.用RT-PCR法检测凋亡相关因子caspase-3 mRNA的表达,ELISA法检测颗粒酶B、PFP的表达.结果 中药益心康组caspase-3 mRNA、PFP、颗粒酶B的相对表达量明显低于病毒组(P＜0.01)和利巴韦林组(P＜0.05).结论 中药益心康能降低大鼠心肌细胞caspase-3 mRNA、颗粒酶B、PFP表达,从而抑制CVB3感染大鼠心肌细胞凋亡.
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APP5肽对体外培养的大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响
目的 研究APP5肽对体外培养的大鼠胚胎海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响. 方法 1. 原代培养SD大鼠胚胎脑海马NSCs;2. 利用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞的特异性标记物微管相关蛋白2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(GalC)对培养的NSCs进行鉴定;3. 将培养的NSCs分为对照组、血清组、APP5肽反序列组和APP5肽组, 观察各组细胞形态的变化;4. 将培养的NSCs分为对照组、APP5肽反序列组和APP5肽组,利用细胞计数、干细胞克隆形成率、干细胞克隆形成大小以及四甲基偶氮唑盐(MTT)代谢率测定的方法 ,分析APP5肽对海马NSCs增殖的影响. 结果 1.海马神经干细胞呈神经球聚集生长,BrdU染色阳性;加入血清后神经球周围有细胞呈放射状向四周生长,并带有突起.染色呈MAP2、GFAP或GalC阳性;2. 海马NSCs加入APP5肽及其反序列后细胞形态与对照组相比没有明显改变;3.与对照组相比,加APP5肽后海马NSCs数量明显增加,克隆形成率和克隆形成的直径均有明显的增加, 并有统计学差异;4.与对照组相比,加入5肽后海马NSCs的MTT代谢率明显增加,有统计学差异,反序列组没有明显改变. 结论 APP5肽能促进海马NSCs增殖,但并不促进其分化.
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新生大鼠心telocytes的形态学和蛋白标记
目的 探讨新生大鼠心telocytes(TCs)的形态学特征并验证其是否表达神经细胞、神经胶质细胞的特异性标记.方法 酶消化法培养新生大鼠原代细胞,免疫细胞化学、扫描电子显微镜鉴定TCs,免疫荧光技术检测TCs的神经细胞和神经胶质细胞的蛋白表达.新生大鼠大脑组织免疫组织化学染色作为阳性对照.结果 免疫组织化学检测显示波形蛋白(vimentin)表达阳性,免疫荧光检测vimentin和CD34共表达,但TCs内神经元特异性烯醇化酶(NSE)、GFAP、OX42、2'3'-环腺苷酸-3'-磷酸二酯酶(CNpase)表达阴性.扫描电子显微镜下TCs形态清晰典型,特征形态明显.结论 大鼠心TCs虽然具有与神经细胞类似的形态,但其并不具有神经细胞的特性.
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人早孕绒毛细胞滋养层细胞培养方法的改良
目的 探索一种简便高纯度的早孕滋养细胞的体外培养方法.方法 采用完整早孕绒毛通过胰蛋白酶联合胶原酶消化法分离,Percoll梯度分离法提纯体外培养,应用光镜HE染色和免疫细胞化学法检测细胞纯度.结果 CK-7表达阳性细胞数可以达到90％以上.结论 完整绒毛消化和Percoll纯化联合可在短期内获得高纯度、高产量的滋养细胞以供后期试验,方法更加简便.
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SD大鼠附睾尾部上皮原代细胞不同培养方法的研究
目的：为获得生长状态佳，精子少的附睾上皮原代培养细胞。方法采取两种方法，取SD大鼠附睾上皮组织，均以酶消化为主，制成细胞悬液，进行培养。结果方法一：制成的细胞悬液中有较多的精子存在，培养的细胞中成纤维细胞占较大比例；方法二：培养结果比较好，精子少或无，培养的细胞中绝大部分为上皮细胞，且生长速度较快。结论获得生长状态佳，精子少的附睾上皮原代培养细胞，为研究附睾上皮中与精子功能成熟和受精相关的关键分子功能提供了必要的基础和条件。
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胃癌与大肠癌原代细胞培养化疗药物敏感性的对比
对消化道肿瘤多药耐药性(MDR)的研究证实,胃癌与大肠癌中多种耐药因子均可高表达,但后者对化疗药物敏感性较差[1-3].本研究旨在对比研究胃癌和大肠癌对化疗药物敏感性的差异,以及肿瘤分化程度及耐药相关因子P-gp、GST-π、p53表达对这种变化的影响.
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宫颈癌相关成纤维细胞的分离与鉴定
目的 宫颈癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast,CAF)在宫颈癌的进展中起着重要作用,原代成纤维细胞培养与体内微环境更为接近.本研究旨在分离纯化并鉴定CAF,初步探讨CAF的生物学特性.方法 选择郑州大学第一附属医院妇科2015-01-04-03-27收治的患者6例.用胶原酶消化法分离宫颈正常成纤维细胞(normal fibroblast,NF)和CAF;显微镜下观察细胞形态;用CCK-8法绘制生长曲线;ELISA法检测细胞上清中人转化生长因子β1(transforminggrowth factor betal 1,TGF-β1)的分泌水平;免疫荧光法及蛋白质印迹法检测细胞标志物波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)和成纤维细胞活化蛋白α(fibroblast activation protein α,FAPα).结果 CAF大小、形状不一,密度接触抑制消失;NF大小、形状一致,存在密度接触抑制.CAF的生长速度快于NF,z=-2.160,P=0.031.CAF中TGF-β1的浓度为(449.93±19.99) ng/L,而NF中为(209.50±16.25) ng/L,二者差异有统计学意义,z=-2.611,P=0.008.CAF高表达α-SMA和FAPα,而NF不表达α-SMA和FAPα,两者均表达Vimentin.结论 成功分离纯化并鉴定CAF.CAF具有平滑肌和成纤维细胞双重特性,其增殖能力及细胞活性均强于NF.
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转化生长因子-β1对大鼠脑膜间皮细胞结缔组织因子表达的影响
目的 观察转化生长因子-β1(TGF-β1)对大鼠软脑膜间皮细胞(RLMCs)结缔组织生长因子( CTCF)表达的影响.方法 体外培养RLMCs,并将其分为4组:(1)0组(正常对照组):用无血清培养基(FSM)培养细胞;(2)1组:用含TGF-β11 ng/ml培养细胞;(3)2组:用含TGF-β1 2 ng/ml培养细胞;(4)3组:用含TGF-β14 ng/ml培养细胞;各组分别在TCF-β1刺激6、12及24 b后,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定CTCF mRNA水平;蛋白免疫印迹(Westem blot)测定CTCF蛋白表达.数据以平均值±标准差(-χ±s)表示,各个浓度点组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较采用小显著法(LSD)检验,以P<0.05有统计学意义.结果 在6、12及24 h分别以TCF-β1 1ng/mL、2 ng/mL、4 ng/mL处理,CTGF mRNA表达水平与对照组比较,差异有显著性(F6h=46.549、F12h= 287.098、F24h=109.202,P均<0.001),呈剂量依赖性,以TGF-β1处理12 h组CTGF mRNA表达差异明显.western blotting:正常对照组RLMCs细胞和不同浓度的TGF-β1刺激后均表达CTGF蛋白,在TGF-β1刺激6、12及24 h后,各组均随着浓度的增加而增加,差异有显著性(F6h= 52.988、F12h= 95.331、F24h=157.107,P均<0.001),呈剂量依赖性,以TGF-β1处理6h组CTGF蛋白表达差异明显.结论 TGF-β1能诱导RLMCs中CTGF通路激活.TGF-β1刺激RLMCs中CTGF mRNA和蛋白的表达,而且随浓度增加而显著.CTGF可能作为神经系统疾病中抑制脑膜纤维化的靶点而进一步研究.
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大鼠星形胶质细胞无血清培养方法的研究
目的 探索应用无血清培养基进行大鼠星形胶质细胞原代培养及传代培养的方法.方法 取出生24 h内Wistar大鼠大脑皮质组织,机械吹打分散为单细胞后在无血清培养基中进行原代培养.细胞传代时分别使用乙二胺四乙酸(EDTA)-胰酶或胰酶作为消化液,浓度为0.2 mg/ml或1 mg/ml的大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)终止消化作用,按照1∶2或1∶3的比例传代.显微镜下观察细胞生长状态,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)细胞免疫荧光染色方法鉴定细胞表型,MTF法检测传代细胞增殖情况.结果 细胞悬液静置15 min后更换新的无血清培养基培养,7d后显微镜下可见细胞生长良好,折光性强,胞体小而突起长;细胞免疫荧光染色鉴定显示＞95％的细胞为GFAP阳性细胞.与应用SBTI终止胰酶反应时未进行离心比较,低温、低速离心(4℃、3 000 ×g)3 min后,传代细胞可在无血清培养基中生长正常并增殖.MTT检测结果显示,EDTA-胰酶消化效果优于胰酶(A值分别为0.290±0.007、0.270±0.006,P＜0.010);使用浓度为0.2 mg/ml或1 mg/ml的SBTI终止消化(A值分别为0.290 ±0.013、0.290±0.017,P=0.820)及以1∶2或1∶3比例传代(A值分别为0.340±0.070、0.320 ±0.030,P =0.770),传代星形胶质细胞数量的差异均无统计学意义.结论 本研究建立无血清培养基进行大鼠星形胶质细胞原代及传代培养的方法,为避免血清干扰更好地开展体外星形胶质细胞功能的研究提供了新的细胞模型.
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改良酶消化法在人脑胶质瘤细胞快速原代培养中的应用
目的 建立一种人脑胶质瘤细胞原代培养的改良酶消化法.方法 基于文献并结合实际工作中经验,改良既往文献报道的酶消化法,对32例不同级别的胶质瘤进行消化后行原代细胞培养,通过倒置相差显微镜观察肿瘤细胞的形态学特点,传代时采用差速贴壁法对原代细胞进行纯化.采用细胞免疫荧光法对原代细胞进行鉴定,通过细胞增殖实验(CCK-8法)绘制生长曲线,研究体外培养细胞的增殖情况.结果 采用改良的酶消化法成功培养28例,失败4例,成功率为87.5％.培养成功的细胞贴壁生长,细胞状态稳定,形态各异,生长状态良好,并可传代.细胞免疫荧光检测显示胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达阳性,证明培养的细胞为胶质瘤细胞;细胞增殖实验显示细胞在体外增殖活跃,肿瘤病理级别越高,细胞增殖能力越强.结论 改良的酶消化法用于人脑胶质瘤细胞原代培养具有简单、高效、成功率高等优点.
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改良人牙龈上皮细胞原代培养方法
目的：建立稳定的人牙龈上皮细胞的原代培养方法，为牙周组织的细胞学研究提供可靠的细胞来源，对原有的原代培养方法进行了改良，期望达到培养成功率高、原代培养时间短且操作简便的效果。方法：选择行“冠延长术”的牙周相对健康者9人，取冠延长术切除的领圈牙龈组织进行牙龈上皮细胞的原代培养，培养方法包括改良酶消化法和组织块法。改良酶消化法使用2．5 g／L DispaseⅡ酶（Ⅱ型分离酶）浸泡组织块过夜，将上皮与结缔组织分离，再用0．025％（质量分数）不含 EDTA（乙二胺四乙酸）的胰蛋白酶静置消化上皮碎片10 min，不弃去上皮碎片直接离心并重悬细胞，不仅降低了酶的消化浓度，减少了消化时间，还简化了重悬细胞的过程；组织块法相对以往方法并无改良。观察两种方法所培养原代细胞的生长过程，在培养成功后对细胞进行免疫细胞化学染色鉴定，并比较两种方法的成功率和培养时间。结果：改良后的酶消化法能够比较快地培养出细胞特征明确的人牙龈上皮细胞，成功率达88．9％，且细胞成片状生长，10～14 d 后可传代，传至3代后细胞形态逐渐不规则直至凋亡，而组织块法原代培养成功率虽然相同，但时间更长，17～22 d 后才可传代。经免疫细胞化学染色，角蛋白染色阳性。结论：改良酶消化法能够快速培养出原代人牙龈上皮细胞并传代，可作为细胞学研究的稳定细胞来源。
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小鼠肝肿瘤细胞原位灌注分离培养方法的建立
目的 建立一种有效分离小鼠肝肿瘤细胞的原代培养方法,为肝癌发生发展的机制研究提供有效的实验手段.方法 以9月龄H-ras12V转基因肝癌小鼠为实验材料,采用传统的小鼠肝细胞原代培养的灌注分离法,并对其进行改进,即在灌注的同时,用剪刀剪去肿瘤表面阻塞的血管和组织,疏通灌注液流,达到有效消化肿瘤组织的目的.对用此改良灌注法分离的肝肿瘤细胞和肿瘤周围组织细胞进行成活率计数,并进行后续的原代细胞培养,观察第3、5、7天的细胞生长状态和形态特征.结果 通过对传统的灌注分离肝细胞法进行改良,分离的肝肿瘤细胞成活率由未改良前的10％提升到40％.原代培养的结果表明,分离的肝肿瘤细胞与肝肿瘤周围的正常肝细胞的形态和随时间延长的凋亡变化状态没有显著差异.结论 改良的灌注法能够有效的分离小鼠肝肿瘤细胞,并显著提高其存活率和细胞质量,可用于后续的原代细胞培养并开展相关的实验.另外,本文对改良灌注法的详细叙述也为相关的科研工作者提供了切实可行的操作规程.
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阿霉素对大鼠原代心肌细胞凋亡的影响
目的 探讨阿霉素对大鼠原代心肌细胞凋亡的影响,并探讨其作用机理.方法 取培养72 h原代心肌细胞,随机分为空白对照组(C组)和阿霉素处理组(D组),空白对照组(C组)不给予任何药物、阿霉素组(D组)用1μmol/L阿霉素处理24 h.对原代心肌细胞的存活率进行6次测定,取平均值;采用免疫荧光法对心肌纯度进行检测;采用吸光光度法对两组的MTT值进行检测;采用ELISA法对两组的心肌肌钙蛋白(cTnⅠ)和氨基末端B型利钠肽前体(NTproBNP)的含量进行测定.结果 原代心肌细胞6次测定的平均成活率为95.38％,免疫荧光法鉴定心肌纯度为82.25％.与C组相比,D组MTT值显著降低,cTnⅠ值和NT-proBNP值显著升高,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 阿霉素能够导致大鼠原代心肌细胞发生凋亡,具有明显的心脏毒性.
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APP5肽模拟物P165对体外培养大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响
目的 研究一种小分子多肽─APP5肽的模拟物P165对体外培养的大鼠胚胎海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖和分化的影响,以期能找到一种可代替神经营养因子的小分子物质,能够促进NSCs的增殖或分化,为将来的临床应用提供理论依据.方法 (1)原代培养SD大鼠胚胎脑海马NSCs; (2)利用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞的特异性标记物微管相关蛋白2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、2,3-环核苷酸-3磷酸二酯酶(CNPase)对培养的NSCs进行鉴定;(3)将培养的NSCs分为对照组、血清组、APP5肽反序列组和P165组, 观察各组细胞形态的变化;(4)将培养的NSCs分为对照组、APP5肽反序列组和P165组,利用细胞计数,测定干细胞克隆形成率、干细胞克隆形成大小的方法分析P165对海马NSCs增殖的影响.结果 (1)海马神经干细胞呈神经球聚集生长,BrdU染色阳性;加入血清后神经球周围有细胞呈放射状向四周生长,并带有突起.染色呈MAP2、GFAP或CNPase阳性; (2)海马NSCs加入P165及其反序列后细胞形态上与对照组相比没有明显改变;(3)与对照组相比,加P165后海马NSCs数量明显增加,克隆形成率和克隆形成的直径均有明显的增加, 并有统计学差异.结论 P165能够促进海马NSCs的增殖,但并不促进其分化.
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脊柱侧凸研究进展
1特发性脊柱侧凸的病因学特发性脊柱侧凸的发病原因仍然不明,尽管近年来一些文章强调基因的相关性.不断报道的青春期特发性脊柱侧凸褪黑素的作用仍在争论之中,与以前在鸡的模型诱发脊柱侧凸不同,Cheung等报道在猿猴松果体切除后不会导致发育性脊柱侧凸.同时Moreau等报道青春期特发性脊柱侧凸患者成骨细胞褪黑素信号转导功能障碍,这一理论的基础是这些病人的骨骼肌组织原代细胞培养.Ogilvie等的一项尤他州100个家庭研究表明至少有一个基因与发育性青春期特发性脊柱侧凸有关.有趣的是两个候选基因聚合胶原和Ⅰ型胶原蛋白α-2分别被Merola等和Cheung等发现.Lowe等注意到患者血清血小板钙调蛋白持续升高预示着脊柱侧凸会有进行性发展.
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人Ⅱ型肺泡上皮细胞的分离培养及表型维持研究
目的 建立人Ⅱ型肺泡上皮细胞(ATⅡ)分离、纯化、原代培养及鉴定的方法,探索体外培养的表型维持情况.方法 取手术切除的边缘肺组织,用胰酶、弹性蛋白酶联合法消化分离人ATⅡ细胞粗悬液,经过滤、差速贴壁、密度梯度分离、磁珠分选纯化.用肺表面活性蛋白C前体(pro-SP-C)免疫荧光、溶酶体绿色荧光染料(GreendND-26)荧光探针染色以及透射电镜鉴定人ATⅡ细胞;用pro-SP-C免疫荧光法和GreenDND-26荧光探针染色法评估细胞纯度;锥虫蓝染色法评估细胞活性;并运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测体外培养过程中肺表面活性蛋白(SP-A、SP-B、SP-C、SP-D)的表达情况.结果 人ATⅡ细胞产量为(5～10)×105/g;锥虫蓝染色细胞活性为(93±2)％;pro-SP-C免疫荧光、GreendND-26荧光探针鉴定、评估细胞纯度一致,为98％左右,透射电镜下观察ATⅡ细胞特有的板层小体结构清晰可见.SP-A、SP-C表达持续时间在24d左右(SP-A 16d:0.52±0.03,20d:0.35±0.02,24d:0.26±0.01,28d:0.10±0.08;SP-C 16d:0.68±0.16,20d:0.31±0.04,24d:0.18±0.06,28d:0.14±0.09),SP-B、SP-D表达持续时间可在28d左右(SP-B 16d:1.05±0.17,20d:0.76±0.35,24d:0.55±0.15,28d:0.36±0.19;SP-D 16d:0.52±0.19,20d:0.33±0.12,24d:0.31±0.04,28d:0.23±0.02).结论 成功建立了一种分离、纯化及鉴定人ATⅡ细胞的方法,此方法能较持久维持ATⅡ细胞表型.
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多发性骨髓瘤患者成骨细胞培养及调控
目的 研究多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓来源成骨细胞的增殖分化和成骨潜能,比较蛋白酶体抑制剂硼替佐米及MM患者血清对成骨细胞的影响.方法 以20例MM患者和10名健康正常人为研究对象,采用骨髓培养法从骨髓中培养并纯化出成骨细胞,进行成骨细胞计数;成骨细胞传代培养4周后,行VonKossa's钙染色,进行成骨细胞钙结节计数;在MM患者组及正常对照组成骨细胞中分别加入硼替佐米及MM患者血清,对比其细胞生物学特性的变化.采用流式细胞术检测MM患者成骨细胞抗体CD34、CD138、CD45的表达,采用ELISA法测定血清IL-7水平,采用RT-PCR法检测各组培养细胞中骨形成蛋白2(BMP2)的表达.结果 ①成骨细胞计数(单位为×104/ml):MM患者组(6.3±1.5)较正常对照组(8.2±2.6)减少(P＜0.05);MM患者组中,加硼替佐米组(8.9±2.1)较不加硼替佐米组(7.8±3.0)明显增多(P＜0.05),但加入MM血清与否差异无统计学意义[(5.9±1.6)对(6.3±1.5),P＞0.05];正常对照组中,加入MM血清组(7.4±1.1)较不加MM血清组(8.2±2.6)有所减少(P＜0.05).②成骨细胞钙结节计数:MM患者组中,加硼替佐米组(8.8±1.9)多于不加硼替佐米组(6.1±1.6)(P＜0.05),但少于正常对照组(15.8±2.2)(P＜0.05).③各组成骨细胞均不表达CD138、CD45、CD34.④MM患者组血清IL-7水平(2.07±0.71)高于正常对照组(1.62±0.15)(P＜0.05).⑤加硼替佐米MM患者组及正常对照组均可表达BMP2 mRNA,不加硼替佐米的MM患者组BMP2 mRNA无明显表达.结论 骨髓培养法可用于体外培养MM患者成骨细胞.与正常对照者比较,MM患者成骨细胞的增殖分化及成骨能力明显减弱.硼替佐米有促进成骨细胞增殖分化及成骨的能力;MM患者血清可抑制成骨细胞的增殖分化.
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γH2AX预测肺癌患者化疗敏感性的研究
目的:探讨应用磷酸化组蛋白(γH2AX)预测肺癌患者对顺铂、卡铂、吉西他滨、阿霉素等化疗药物敏感性的可行性和可靠性.方法:原代培养肺癌患者肿瘤细胞,分别予不同浓度的化疗药作用后,采用流式细胞术(FCM)、免疫细胞化学法(ICC)、MTT比色法,比较并分析各不同浓度药物作用下肿瘤细胞中γH2AX灶点数、γH2AX阳性细胞百分数及细胞增殖抑制率的差异.结果:在同种药物不同浓度作用下,肿瘤细胞内γH2AX灶点数、γH2AX阳性细胞百分数及细胞增殖抑制率之间的差异具有统计学意义(P 均<0.05),并相互之间具有相关性(P 均<0.05),不同药物之间γH2AX的表达差异有统计学意义(P 均<0.05),并与细胞增殖抑制率间具有相关性(P 均<0.05).结论:肿瘤细胞内γH2AX的表达能在一定程度上预测其对化疗药物的敏感性并对指导肿瘤患者的个体化治疗有重要意义.
