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鸡迟发性神经病模型脑组织中蛋白激酶含量的改变
目的 用鸡建立迟发性神经病的动物模型,观察其脑组织中蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)、β-肌动蛋白(β-actin)含量的改变.方法 分为甲胺磷组、磷酸三甲苯酯组和对照组,甲胺磷组经口给予10 mg/(kg·d),连续给药14 d建立模型;磷酸三甲苯酯组经口给予磷酸三甲苯酯原油1 ml/(kg·d),连续给药7 d建立模型;对照组给予生理盐水.观察染毒组的中毒表现,染毒组和对照组母鸡于染毒后7、14、21和28 d处死,利用Western Blotting方法检测各组脑组织中PKA、PKC和β-actin含量的改变.结果 甲胺磷组动物大脑中PKC与对照组比较,在染毒后的7、14、2l和28d分别降低了24%(P<0.05)、28%(P<0.05)、30%(P<0.05)和62%(P<0.01),磷酸三甲苯酯组分别降低了64%(P<0.01)、58%(P<0.01)、58%(P<0.01)和43%(P<0.05).甲胺磷组β-actin含量在14 d升高了30%(P<0.05),磷酸三甲苯酯组在7 d降低了26%(P<0.01).结论 在本试验条件下,甲胺磷和磷酸三甲苯酯使脑组织中的PKC含量在OPIDN的进行阶段出现降低,提示PKC含量的降低可能是OPIDN的发病机制之一.
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氯丙烯对大鼠大脑神经元中β-actin的影响
目的研究骨架蛋白β-actin在氯丙烯引起的周围神经病中的作用.方法采用原代培养的大鼠大脑神经元,用相差显微镜观察细胞形态,同时用免疫组化方法分析测定细胞内β-actin含量的变化.结果氯丙烯使大脑神经元中β-actin含量显著下降,低剂量组降低52%,高剂量组降低85%(P＜0.01).结论提示氯丙烯急性中毒可导致大鼠大脑神经元中β-actin含量降低.
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淡色库蚊β-肌动蛋白基因克隆与序列分析
目的获取淡色库蚊β-肌动蛋白全长基因. 方法采用RACE法筛选淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系cDNA表达文库,获得β-肌动蛋白基因的5′和3′RACE序列,然后通过T/A克隆插入pGEM-T质粒载体,经过测序、拼接获取全长序列.用BLASTp软件将该基因推导的氨基酸序列与蛋白质公共数据库Swissprot比对、分析. 结果获得淡色库蚊β-肌动蛋白基因全长序列,总长度为1 290 bp,开放阅读框为1 132 bp,编码377个氨基酸(GenBank/NCBI AY100005).推导的氨基酸序列与公共数据库比对,发现与冈比亚按蚊和黑腹果蝇的β-肌动蛋白的同源性均为91%.蛋白质的理论分子质量为41.7 ku,等电点(PI)为5.4. 结论获得了淡色库蚊β-肌动蛋白基因全长序列,为蚊虫分子生物学的进一步研究奠定了基础.
关键词： 淡色库蚊 β-肌动蛋白 克隆 序列分析 cDNA快速末端扩增 -
氯丙烯对大鼠神经组织中β-肌动蛋白含量的影响
目的进一步探讨氯丙烯所致中毒性周围神经病的发病机制.方法 Wistar雄性大鼠sc氯丙烯3个月后,用Western印迹方法分别测定了氯丙烯亚慢性中毒后大鼠大脑、脊髓、坐骨神经沉淀和上清中骨架蛋白β-肌动蛋白含量的变化.结果①在大脑沉淀中,β-肌动蛋白含量在氯丙烯85 mg*kg-1组降低10%(P>0.05),170 mg*kg-1组降低13%(P<0.05);在大脑上清中,β-肌动蛋白含量在85 mg*kg-1组降低20%(P<0.01),170 mg*kg-1组无明显变化.②在脊髓沉淀中,氯丙烯85 mg*kg-1组β-肌动蛋白含量降低13%,170 mg*kg-1组降低12%,但均无显著性差异;上清中无显著变化.③坐骨神经沉淀中,在氯丙烯85和170 mg*kg-1组分别下降33%和39%(P<0.01);上清中,β-肌动蛋白没有显著性变化.结论首次发现氯丙烯可导致神经组织中β-肌动蛋白含量显著降低,β-肌动蛋白的改变可能与氯丙烯引起的中毒性外周神经病有关.
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应用荧光定量聚合酶链方法检测宫颈组织中人乳头瘤病毒16E6基因
目的建立荧光定量聚合酶链(FQ-PCR)方法检测宫颈细胞中人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6基因的方法.方法以220例新疆妇女宫颈不同病变组织DNA作为样本,人乳头瘤病毒16型(新疆株)E6基因(HPV16E6,AF327851)作为扩增的靶基因,同时以人β-肌动蛋白基因片段作为内参照,借助于设计的目的基因引物,两个特异的荧光探针,在筛选的FQ-PCR优化反应体系中,同时对两个基因片段进行扩增,得到HPV16E6的相对含量.结果对β-肌动蛋白阳性的宫颈不同病变组织中HPV16E6阳性率及其相对含量进行统计分析,新疆妇女宫颈脱落细胞标本96例中,HPV16E6阳性3例(3.3%);宫颈癌蜡块组织59例中HPV16E6阳性49例(83.0%);宫颈上皮内瘤变(CIN)蜡块组织65例中,HPV16E6阳性28例(75.7%);宫颈炎蜡块组织33例,HPV16E6阳性28例(93.3%).HPV16E6的相对含量随病情加重呈上升趋势,二者呈显著正相关,相关系数为O.83.结论建立的FQ-PCR检测宫颈不同病变组织内HPV16E6基因的方法,能反映单位细胞人乳头瘤病毒的复制情况,筛查宫颈癌患者,并可能应用于宫颈癌的风险评估和疗效观察.
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圆锥角膜蛋白异常表达的研究
圆锥角膜是一种角膜变性,主要表现为角膜中央或旁中央进行性变薄,呈圆锥状凸起,主要为上皮层,前弹力层,基质层结构性异常,从而导致不规则散光和高度近视,引起不同程度的视功能障碍.圆锥角膜厚度变薄主要是因为其基质层中层数减少及纤维细胞退化[1].另外也有报道圆锥角膜总层数改变以及胶原纤维分布的不均匀主要发生在圆锥角膜的中央[2].在圆锥角膜前弹力层观察到缺损及中断,这有可能是来自基质层的胶原束突入前弹力层导致的[3].后弹力层介于基质层和内皮层之间,是一薄细胞层,在圆锥角膜中除了发生细胞延伸及多形性改变外很少受到影响[4].
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海藻糖对低温保存皮肤组织中β-肌动蛋白的作用研究
目的 研究非渗透性低温保护剂海藻糖联合应用二甲基亚砜对低温保存皮肤组织中β-肌动蛋白的影响.方法 将新鲜成人皮肤分为5组,分别将海藻糖/二甲基亚砜、二甲基亚砜/丙二醇、二甲基亚砜/无血清角质细胞培养基、DMEM作为冷冻保护剂,液氮冻存14d后复温,采用免疫组织化学染色、Western-blot、RT-PCR等方法,比较各组皮肤组织中β-肌动蛋白的蛋白和基因表达变化.结果 0.5M 海藻糖/二甲基亚砜作为保护剂所冷冻的皮肤,复温后其β-肌动蛋白的蛋白和基因表达明显高于其他组.结论 海藻糖与二甲基亚砜联合应用能较好的保护皮肤组织中的β-肌动蛋白,整形外科在常规应用保护剂时可以在渗透性保护剂中加入海藻糖.
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肝组织中β-actin定量检测方法的建立
目的 构建检测肝组织中内参基因β-actin的标准品.方法 以成人外周血细胞的总RNA为模板、反转录合成cDNA,用该cDNA为模板PCR扩增人β-actin基因相应的cDNA目的片段,以pMD18-T为载体,构建形成重组质粒,电泳、鉴定测序后,用荧光定量PCR制作标准曲线.结果 外周血提取的总RNA完整性良好,构建的β-actin质粒经PCR扩增后得到1条 285 bp的清晰条带,测序结果与目的片段完全一致,且质粒的原始浓度为5.0×1013拷贝数/mL,倍比稀释至1.0×102拷贝数/mL均能得到良好的标准曲线(R2=0.999).结论 构建β-actin基因荧光定量PCR标准质粒成功.
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α-平滑肌肌动蛋白和β-肌动蛋白在瘢痕组织中的表达
目的探讨α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和β-肌动蛋白(β-actin)对增生性瘢痕形成的可能作用.方法采用荧光定量PCR法检测10例增生性瘢痕和10例正常皮肤组织中α-SMA和β-actin的表达水平.结果增生性瘢痕组织中α-SMA和β-actin表达水平均高于正常皮肤组织,差异有统计学意义(P＜0.01).结论α-SMA和β-actin在瘢痕增生中起重要作用;由于β-actin在瘢痕组织和正常皮肤中的不恒定性,建议在瘢痕的mRNA定量研究中不作为内参照物.
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β-肌动蛋白在大鼠精子发生过程中的特殊表达
目的:寻找大鼠精子发生相关蛋白,研究β-肌动蛋白在大鼠睾丸组织的表达和分布.方法:用牛血清白蛋白梯度沉降(STAPUT)法从9日龄雄性SD大鼠睾丸中分离出A型精原细胞,从成年雄性大鼠睾丸中分离出粗线期精母细胞、圆形精子细胞;分别提取这3种细胞的总蛋白,进行双向电泳;对所得到的双向电泳图谱用ImageMaster2D Elite图像分析软件分析,找出差异蛋白,对挑选出的差异蛋白做质谱分析.进一步用β-肌动蛋白抗体做免疫组化的睾丸组织定位研究.结果:在双向电泳图谱中,β-肌动蛋白在A型精原细胞、粗线期精母细胞中表达量较高,在圆形精子细胞中则表达量极少.免疫组化研究发现:A型精原细胞、粗线期精母细胞有阳性颗粒反应,圆形精子细胞则无阳性颗粒反应;在接近成熟的精子细胞中,呈现极强的阳性颗粒反应,并且越接近排放期的精子细胞,阳性反应越强.在接近成熟的精子头部,阳性颗粒反应强.β-肌动蛋白主要在精原细胞和精母细胞的细胞质中表达;在接近成熟的精子细胞中主要表达在细胞核.结论:β-肌动蛋白在精子发生过程中有明显的阶段差异表达,推测其对精子发生起重要调节作用.
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不同年龄C57小鼠海马NGFmRNA含量的测定
采用异硫氰酸胍法从C57小鼠海马中分离总RNA,以肌动蛋白基因为内标用RT-PCR法测定不同年龄小鼠海马NGFmRNA含量的变化.C57小鼠海马NGFmRNA含量在6月龄和12月龄明显低于1月龄,而6月龄与12月龄无明显差异.
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间歇性甲状旁腺激素刺激的大鼠成骨细胞中β-肌动蛋白和波形蛋白表达上调
目的:探讨间歇性甲状旁腺激素(PTH)应用促成骨的可能机制.方法:大鼠成骨细胞(ROBs)分为两组培养:①对照组,在每个培养周期(24 h)中均不加PTH;②PTH间歇刺激组,仅在前6 h的培养液中加PTH.收集第3周期24 h末的细胞,应用双向凝胶电泳方法比较两组细胞的总蛋白,选择2个在间歇刺激组表达明显上调的蛋白质点进行基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析.结果:初步确定这2个蛋白分别为β-肌动蛋白(β-actin)和波形蛋白(vimentin),它们均属于细胞骨架蛋白.结论:在PTH间歇刺激组表达上调的β-肌动蛋白和波形蛋白可能参与了间歇性PTH应用的促成骨过程.
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晶状体上皮细胞mRNA定量分析中内部参照标准β-肌动蛋白RT-PCR反应条件的研究
目的探讨晶状体上皮细胞mRNA定量分析中内部参照标准β-肌动蛋白RT-PC反应条件.方法从培养的人晶状体上皮细胞中提取mRNA,应用设计的引物RT-PCR检测β-肌动蛋白,电泳分析53.2℃、53.9℃、55℃、56.2℃、57.4℃、58.6℃、59.8℃、62℃、62℃、62.7℃不同的退火温度的扩增产物.结果各退火温度条件下,β-actin扩增产物均形成长度为302bp片段,且未见非特异性扩增产物条带.退火温度为58.6℃时,β-actin扩增产物的条带清晰.结论采用本实验中所设计的引物联合58.6℃退火温度等实验条件所扩增的长度为302bp片段,清晰稳定,是晶状体上皮细胞mRNA定量分析中良好的内部参照标准.
关键词： 晶状体上皮 mRNA β-肌动蛋白 逆转录-聚合酶链反应 -
死后脾组织mRNA降解程度与死亡时间的关系
目的 探讨小白鼠死后脾组织GAPDH mRNA和β-actin mRNA降解情况与死亡时间(PMI)的关系.方法 24只NIH小白鼠断颈处死,置于25℃温控系统内,利用两步法RT-PCR技术和核酸蛋白测定仪定量cDNA方法检测小白鼠脾GAPDH mRNA和β-actin mRNA在死后即刻至72 h降解情况.结果 在25℃温控系统内的小白鼠死后即刻至48 h脾组织均可检测到GAPDH mRNA和β-actin mRNA,且其扩增产物呈规律性下降趋势.结论 小白鼠死亡后脾组织GAPDH mRNA和β-actin mRNA降解程度与PMI负相关,可为PMI推断提供一种新的观测指标.
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形态异常的人单核细胞株THP-1中β-肌动蛋白mRNA的表达
目的 探讨形态异常的人单核细胞株THP-1中β-肌动蛋白(β-actin)mRNA表达的特点.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测THP-1细胞和形态异常的THP-1细胞中β-actin mRNA的表达.结果 RT-PCR产物长度为256 bp和580 bp的β-actin片段在传代5次以内的THP-1细胞中均有表达,但RT-PCR产物长度为256 bp β-actin片段在传代20次以上、形态异常的THP-1细胞中未见表达.结论 传代次数较多、形态异常的THP-1细胞中β-actin的基因可能发生了变异.
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淫羊藿苷对小鼠破骨细胞β-肌动蛋白、抗酒石酸酸性磷酸酶、核因子-κB受体活化因子mRNA表达的影响
目的 观察淫羊藿苷对体外培养小鼠破骨细胞β-肌动蛋白、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、核因子-κB受体活化因子(RANK)mRNA表达的影响.方法 用浓度分别为25、30 μg/L、1×10-8 mol/L的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)、1,25(OH)2VitD3体外诱导培养小鼠骨髓源性破骨细胞,分别加入0、1×10-5 mol/L的淫羊藿苷,培养48 h后,抽提总RNA,采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测破骨细胞中β肌动蛋白、TRAP、RANK mRNA表达的变化.结果 与空白对照组比较,1×10-5 mol/L的淫羊藿苷可明显下调β-肌动蛋白、RANK mRNA的表达(P值均＜0.05),但对TRAP mRNA的表达无明显影响(P＞0.05).结论 淫羊藿可以通过下调β-肌动蛋白、RANK基因表达,从而抑制破骨细胞的分化形成及骨吸收.
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小鸡和豚鼠耳蜗毛细胞β-肌动蛋白分布比较
目的:比较小鸡基底乳头和豚鼠耳蜗毛细胞β-肌动蛋白(β-actin)分布的特点.方法:应用免疫组织化学方法观察小鸡和豚鼠耳蜗中β-actin免疫反应活性.结果:鸡基底乳头高、矮毛细胞的静纤毛,盖膜根部附着处缘上皮细胞胞浆,豚鼠耳蜗三排外毛细胞胞浆,内、外支柱细胞胞浆和指状突β-actm免疫反应阳性.结论:小鸡和豚鼠耳蜗毛细胞具有相同结构蛋白β-actin,但两种动物之间存在明显的分布差异.
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排除β-肌动蛋白假基因对反转录聚合酶链反应的干扰
目的 筛选合适的β-肌动蛋白(β-actin)引物以排除RNA样本中残存的DNA对人类基因表达分析的干扰.方法 利用EMBL、PSEUDOGENE等生物信息数据库,寻找β-actin的假基因.同时自行设计和从国内外文献中筛选了众多β-actin引物.选用其中具有代表性的5对跨过内含子的引物,分别将基因组DNA、未经逆转录的RNA、cDNA作为模板,对这5对引物进行聚合酶链反应(PCR)扩增.结果 生物信息学分析发现β-actin有37个假基因并且发现绝大多数的研究者所使用的引物都存在假基因干扰问题.当分别用DNA和cDNA作为模板时,5对引物中的1对跨过内含子的引物能扩增出大小不同的条带.结论 使用该对引物能有效发现和排除RNA样本中所残存的DNA的干扰,令人类基因表达分析得出更准确的结果.
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聚集蛋白聚糖和层黏连蛋白对PC12细胞突起生长及β-肌动蛋白表达的影响
目的 研究细胞外基质成分聚集蛋白聚糖与层黏连蛋白对PC12细胞突起生长形态的影响及细胞骨架中β-肌动蛋白表达的影响,为进一步探索细胞外基质对神经元轴突细胞骨架的影响机制奠定基础.方法 建立PC12细胞培养体系,分别在培养基中加入150 μg/ml聚集蛋白聚糖和50 μg/ml层黏连蛋白(分别为聚集蛋白聚糖组和层黏连蛋白组),设立空白培养基为对照组.体外培养5d后,通过细胞免疫荧光染色观察3组PC12细胞的形态并测量细胞突起的长度、宽度及面积.采用PCR和Western blot的方法测定PC12细胞骨架中β-肌动蛋白的RNA和蛋白表达情况. 结果 聚集蛋白聚糖组PC12细胞突起较为扁短,宽度为(3.65±0.35)μm,大于层黏连蛋白组[(1.00±0.65) μm] (P＜ 0.05),但略大于对照组[(2.26±0.49)μm] (P＞0.05),层黏连蛋白组的宽度小于对照组,但差异没有统计学意义(P＞0.05);层黏连蛋白组PC12细胞突起纤细而长,长度[(48.75±2.72)μm]大于聚集蛋白聚糖组[(17.21±2.75)μm]和对照组[(22.29±5.32)μm](P＜0.05);聚集蛋白聚糖组的长度小于对照组,但差异没有统计学意义(P＞0.05);聚集蛋白聚糖组、层黏连蛋白组和对照组PC12细胞突起面积分别为(39.71 ± 8.00) μm2、(60.42±8.51)μm2和(49.75 ± 8.20) μm2,组间差异没有统计学意义(P＞0.05).聚集蛋白聚糖组β-肌动蛋白RNA表达低于对照组(P＜0.01),层黏连蛋白组高于另外两组(P＜0.01).聚集蛋白聚糖组β-肌动蛋白的蛋白表达低于对照组(P＜0.01);层黏连蛋白组高于另外两组(P＜0.05). 结论 聚集蛋白聚糖对PC12细胞突起轴向生长和β-肌动蛋白的表达具有一定抑制作用,但不一定抑制其非轴向生长潜能;而层黏连蛋白对PC12细胞突起的轴向生长和β-肌动蛋白的表达具有促进作用.
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异欧前胡素对体外人表皮黑素细胞酪氨酸酶和β-肌动蛋白表达的调节作用
目的:研究异欧前胡素对体外培养的人表皮黑素细胞酪氨酸酶和 β-actin蛋白表达的影响.方法:体外分离、纯化培养人表皮黑素细胞,随机分为对照组和异欧前胡素实验组.对照组用M-254培养基培养,实验组加入含25μmol/L异欧前胡素的M-254培养基,培养48 h.倒置显微镜下观察人表皮黑素细胞形态,NaOH裂解法检测黑素含量的变化,采用实时荧光定量PCR方法、Western blot方法、免疫荧光法检测酪氨酸酶和β-actin在黑素细胞中的表达及其变化.结果:异欧前胡素作用48 h后,与对照组黑素细胞比较,实验组黑素细胞的树状突起变长,黑素含量减少(P<0.01);实时荧光定量PCR、Western blot和免疫荧光法检测结果表明,与对照组相比,实验组黑素细胞酪氨酸酶mRNA及其蛋白的表达降低(P均<0.05),β-actin mRNA及其蛋白的表达增加(P均<0.05).结论:25μmol/L异欧前胡素抑制体外培养人表皮黑素细胞酪氨酸酶mRNA及其蛋白的表达,促进β-actin mRNA及其蛋白的表达,从而降低体外人表皮黑素细胞黑素的含量.
