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一起诺沃克病毒引起的急性胃肠炎爆发的分子流行病学研究
目的 查明2005年深圳市一起急性胃肠炎的病原体,为制定控制疾病流行策略及指导临床合理用药提供依据.方法 收集该次腹泻患者及相关人员的粪便标本15份,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和实时荧光PCR方法检测诺沃克病毒核糖核酸(RNA).结果 15份标本中,RT-PCR及实时荧光PCR方法均检测出10例诺沃克病毒阳性,阳性率为56.7%;2种方法的符合率为100%.同时对其中的10份RT-PCR阳性标本进行脱氧核糖核酸(DNA)序列测定,并进行同源性分析和进化分析.结论 该次群体性胃肠炎是由诺沃克病毒G2型感染引起;10份阳性标本中9株的核苷酸同源性为100%,另外1株与其他9株的同源性为99.8%;本次流行的毒株(05-53-61及05-63)与日本东京的SaitamaU201及SaitamaU18亲缘关系较近,核苷酸同源性分别为96%及95%,而与1997年深圳本地株97-11及97-30亲缘关系则较远,核苷酸同源性分别为76.4%及76.7%.
关键词： 诺沃克病毒 胃肠炎 逆转录-聚合酶链反应 荧光逆转录-聚合酶链反应 同源性分析 -
健康男性和弱精子症患者精液精子中GP130的表达
目的观察在正常和活动力低下的人精液精子中白细胞介素-6(IL-6)及其受体(IL-6R)和GP130的表达差异.方法收集活动力正常的人精液精子和A、B级精子低于20%的弱精子症患者的精液精子,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学的方法检测IL-6及其受体和GP130的表达水平. 结果与活动力正常的精液精子比较,GP130在活动力低下患者精液精子的表达显著降低(P＜0.01),本实验未检测到IL-6和IL-6R在人精液精子的表达.结论精液精子GP130的表达减少与人精子活动力低下相关,提示GP130表达减少可能是精子活动力低下的原因之一.
关键词： 弱精子症 白细胞介素-6 GP130 逆转录-聚合酶链反应 免疫细胞化学 -
细胞色素P450芳香化酶在大鼠多囊卵巢中的表达及意义
目的 检测细胞色素P450芳香化酶(P450 arom)在大鼠多囊卵巢颗粒细胞中的表达水平,探讨P450 arom与多囊卵巢综合征(PCOS)的关系. 方法 应用半定逆转录-聚合酶链反应(RT-PcR)检测PCOS实验组及正常对照组大鼠卵巢组织中P450 arom基因(CYP19)的表达;采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法对大鼠卵巢组织中P450 arom进行检测. 结果 实验组和对照组卵巢组织中CYPl9基因,相对表达强度分别为(0.138±0.072)和(0.759±0.236),差别有显著性意义(P<0.01);实验组中原始卵泡、初级卵泡和成熟卵泡比较,P450 arom蛋白表达下降(P<0.05).对照组间初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡比较,arom蛋白表达有显著性差异(P<0.05). 结论 P450 arom mRNA在PCOS大鼠卵巢组织中呈低表达P450 atom蛋白在PCOS大鼠卵巢初级卵泡和成熟卵泡中表达下降;PCOS的发生可能与P450 arom在mRNA和蛋白水平的表达下调有关.
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XW630对大鼠成骨细胞雌激素受体mRNA表达的调控研究
目的:探讨抗骨质疏松新化合物XW630促进成骨作用的机理.方法:从SD大鼠颅骨中分离培养成骨细胞,首次采用具有较高灵敏度的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术直接从大鼠成骨细胞中检测雌激素受体mRNA的表达.结果:XW630具有促进成骨细胞ERmRNA表达的作用,且呈时间依赖性.在相同浓度(106mol/L)条件下,XW630作用强于四环素加哌嗪雌酮及单纯雌酚酮(P<0.05).结论:XW630能有效地促进成骨细胞ERmRNA的表达,并可能通过ER在骨代谢中起作用.
关键词： 雌激素受体mRNA 细胞培养 引物 逆转录-聚合酶链反应 -
检测诺如病毒的罗氏LightMix(R)Kit方法与行业标准方法(SN/T2626-2010)的比较研究
目的 结合不同标准和规范方法,对罗氏LightMix(R) Kit诺如病毒检测试剂盒(以下简称罗氏方法)进行评价.方法 通过对217份门诊腹泻病人粪便标本和158份市场零售贝类样品中诺如病毒核酸平行检测,对比罗氏方法与我国SN/T 2626-2010《国境口岸诺如病毒检测方法》中逆转录-聚合酶链反应检测诺如病毒核酸方法(以下简称SN/T方法)对粪便标本与贝类样品中诺如病毒核酸检测结果的差异.结果 粪便标本的罗氏方法检测阳性率为27.2％ (59/217),而SN/T方法检测阳性率为17.5％(38/217),两方法结果一致率为85.7％,检出率差异有统计学意义(P＜0.05).贝类样品的罗氏方法检测阳性率为32.9％(52/158),SN/T方法检测阳性率为30.4％(48/158),两方法对诺如病毒检测结果的一致率为87.3％,检出率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 市场零售贝类样品中诺如病毒污染率较高,罗氏方法以其快速、简便、灵敏、可靠的优点值得在食品微生物检测行业推广.
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人宫颈鳞状上皮细胞癌组织中钙激活性中电导钾离子通道的表达
目的 探讨人宫颈鳞状上皮细胞癌(简称鳞癌)组织中电导钾离子通道(IKCa1)mRNA及其蛋白产物与正常宫颈上皮组织中钙激活性的差异.方法 采用免疫组织化学法及RT-PCR法分别检测30例不同分化程度的宫颈鳞癌组织和18例正常宫颈上皮组织中IKCa1 mRNA及其蛋白产物的表达情况.结果 (1)IKCa1 mRNA阳性表达率15例子宫颈鳞癌组织中分别为73.3 %,表达水平为(1.2±0.5),18例正常宫颈上皮组织中分别为11.1%,表达水平为(0.9±0.2),差异均有统计学意义;(2)30例宫颈鳞癌组织细胞核及细胞膜上IKCa1蛋白产物均呈阳性表达;正常宫颈上皮组织中仅1例在鳞状上皮部位细胞膜部位有较弱表达,差异有统计学意义;(3)宫颈鳞癌组织中IKCa1 蛋白产物的表达与癌细胞分化程度呈正相关.结论 IKCa1的高表达与宫颈鳞癌的发生和发展密切相关.
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辽宁省葫芦岛地区鼠类汉坦病毒的分离与鉴定
目的研究葫芦岛地区鼠类中汉坦病毒的感染流行情况以及病毒的型别.方法采用夹夜法捕捉鼠类,间接免疫荧光法检测鼠肺中的汉坦病毒抗原,阳性较强的标本接种到Vero E6细胞分离病毒,RT-PCR对分离的病毒与阳性样品扩增核苷酸片段并测序,构建系统发生树进行分型与系统发生分析.结果在200份鼠肺标本中共检测到11个样品阳性,阳性率为5.5%.选择阳性较强的标本,接种到Vero E6细胞并连续传代后分离到3株病毒.用S片段(620～999 nt)与M片段G1区(180～580 nt)的核苷酸构建的系统发生树,结果表明葫芦岛分离的3株病毒均为S3亚型.用G2区的2003～2302 nt的核苷酸序列构建的系统发生树将来自不同地区的SEO型病毒可分为7个亚型,其中从葫芦岛地区分离的3株病毒与北京地区分离株CP211、ch302、dc501和山东省分离株SD10、SD227株的亲缘关系近.结论葫芦岛地区鼠类中汉坦病毒的携带率较高,主要流行S3亚型SEOV.
关键词： 汉坦病毒 病毒分离 逆转录-聚合酶链反应 系统发生分析 -
应用逆转录-聚合酶链反应方法检测孕妇外周血中胎儿ε/γ血红蛋白基因
目的探索检测孕妇外周血中胎儿特异血红蛋白基因表达的方法.方法提取孕妇全血mRNA,经体外逆转录后,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,应用ε/γ特异引物引导扩增胎儿特异血红蛋白基因片段,经琼脂糖凝胶电泳后,在凝胶成像系统下观察.结果在7名妊娠妇女中,6名扩增出ε/γ基因片段,1名为阴性.结论应用RT-PCR方法可直接从孕妇全血中扩增出胎儿特异血红蛋白基因片段,孕妇全血中微量的胎儿mRNA已基本满足体外逆转录及扩增的要求.利用孕妇外周血进行的无创伤性产前诊断具有可行性.
关键词： 逆转录-聚合酶链反应 ε/γ血红蛋白基因 孕妇 -
SARS患者粪便、痰标本病毒RNAS阳性检出率与病程变化的关系
目的探讨严重急性呼吸综合征(SARS)患者粪便、痰标本中病毒RNA阳性检出率与病程变化的关系.方法采取一步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对不同病程的临床标本进行SARS冠状病毒(SARS-associated coronavirus, SARS-CoV)RNA的扩增和序列测定,并采用趋势χ2检验探讨标本阳性检出率与不同发病时间的关系.结果被检样品中扩增出的特异性片段,经测序验证为 SARS-CoV序列(同源性100%).在检测的临床标本中,粪便标本阳性检出率高( 21.55%).趋势χ2检验显示SARS患者粪便和痰标本中病毒阳性检出率均随着发病时间的增长而下降, χ2＝ 12.55和 16.408, P＝ 0.0004和 P= 0.000 05.结论一步法 RT-PCR可以有效检测SARS患者临床标本存在的 SARS-CoV;SARS患者粪便、痰标本 RT-PCR阳性率随着发病时间的增长而下降.
关键词： 严重急性呼吸综合征 冠状病毒 逆转录-聚合酶链反应 -
北京市某些医院内腹泻暴发与诺如病毒的相关性研究
目的 确定2006年11-12月北京市某些医院内发生的住院患者腹泻爆发性流行的病原及其分子生物学特点.方法 首先检测腹泻标本中轮状病毒抗原并用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行轮状病毒核酸检测,然后用逆转录-聚合酶链反应进行诺如病毒核酸检测,对检测阳性标本进行诺如病毒VP1全基因的扩增;并对其中一例进行全基因克隆、测序和分析.另外对来自不同医院的2份阳性标本中的VP1的5'端部分序列进行测序分析.结果 30份腹泻患者粪便标本中共有17份检测为诺如病毒阳性,总阳性率为56.7%,每一家医院送检标本的阳性率都在42.9%以上.对其中一份标本的诺如病毒VP1全基因序列测定和分析显示为GⅡ-4型诺如病毒.另2份标本中的部分序列测定显示与全基因序列高度保守,只有1个核苷酸的差异,因此也提示为GⅡ-4型诺如病毒.结论 诺如病毒是北京地区医院内腹泻暴发的重要病原,此次暴发极可能是由GⅡ-4型诺如病毒引起.
关键词： 诺如病毒 医院内感染 逆转录-聚合酶链反应 序列分析 -
湿热瘀阻型类风湿关节炎外周血单个核细胞GPImRNA水平的研究
目的：探讨湿热瘀阻型类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）外周血单个核细胞葡萄糖6-磷酸异构酶（GPI）水平与其他证型类风湿关节炎及正常人群之间的关系。方法采用荧光定量PCR方法检测GPImRNA水平，研究对象包括RA患者47例，其中湿热瘀阻型27例，痰瘀互结型20例，其他风湿病患者对照组20例，30名健康体检者。结果 RA湿热瘀阻组GPImRNA的相对表达量是健康对照组的25．9倍，差异有统计学意义（P＜0．05）。RA痰瘀互结组GPImRNA的相对表达量是健康对照组的6．54倍，而RA湿热瘀阻组与RA痰瘀互结组差异也有统计学意义（P＜0．05）。其他风湿病组GPImRNA的相对表达量是健康对照组的0．97倍，差异无统计学意义（P＞0．05）。结论GPI与RA活动性有关，同时证明湿热瘀阻证是RA活动期的证候之一。
关键词： 葡萄糖-6-磷酸异构酶 类风湿关节炎 逆转录-聚合酶链反应 -
基因芯片技术研究环维黄杨星D对大鼠肾脏基因表达的研究
目的:采用基因芯片技术研究环维黄杨星D(CVB-D)对大鼠肾脏基因表达谱的影响,初步探索其对肾脏毒性作用的机制.方法:10只SD大鼠随机分为正常组和CVB-D 10 mg·kg-1组,连续腹腔给药14d,分别从大鼠肾脏组织中提取总RNA,分离纯化后,反转录合成掺人生物素标记的cDNA探针,与基因芯片杂交,扫描芯片荧光信号图像后,统计处理并进行分析.选取5个差异表达基因,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法进行验证.结果:CVB-D组与空白组比较,共筛选出309条差异表达的基因,其中表达上调基因有147条,下调基因有162条,涉及凋亡通路相关基因、细胞周期相关基因、Ca2+信号通路相关基因、MAPK信号级联等.结论:CVB-D的肾毒性可能与凋亡通路、MAPK信号级联、细胞周期及Ca2+信号通路异常调控相关.
关键词： 环维黄杨星D 基因芯片 肾脏 逆转录-聚合酶链反应 -
食管癌中MDR基因表达及其临床意义
目的 探讨食管癌患者肿瘤组织中多药耐药(MDR)基因表达及其在临床上的应用价值.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测50例食管癌组织中的mdr-1基因表达水平,同时检测10例正常食管组织中的mdr-1表达水平.结果 mdr-1基因在食管癌高、中、低分化之间的表达水平具有极显著差异(P<0.01和P<0.001),癌与正常组织中有极显著差异(P<0.001);在不同年龄、性别及临床分期之间无显著差异(P>0.05).结论 mdr-1基因的检测可预测患者对化疗的敏感性,使化疗个体化,也可以评估患者的预后.
关键词： 食管癌 多药耐药基因 逆转录-聚合酶链反应 -
芍药苷对胶原诱导型关节炎大鼠外周血单个核细胞糖皮质激素受体的影响
研究芍药苷(paeoniflorin,PF)对胶原诱导型关节炎大鼠外周血单个核细胞(PBMCs)糖皮质激素受体(GCR)的影响.采用胶原诱导型关节炎(CIA)大鼠模型,初次免疫后第14天灌胃给予PF 25,50,100 mg·kg-1或雷公藤甲素20 μg·kg-1或PF 50 mg·kg-1+RU486 15 mg·kg-1,每天1次,连续给药28 d.末次给药后第2天,除PF+ RU486组外所有实验大鼠摘眼球取血,处死并取所有大鼠未免疫关节,ELISA法检测PBMCs中GCRα,GCRβ表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法分析PBMCs中GCRα,GCRβmRNA表达,免疫组化法分析关节滑膜组织IL-1β,NF-κB p65,TNF-α,PGE2的表达.PF 50,100mg·kg-1可抑制CIA大鼠关节滑膜组织IL-1β,NF-κB p65,TNF-α,PGE2的表达(P ＜0.05,P ＜0.01),而RU486 15 mg· kg-1可明显影响PF 50 mg·kg-1的这一作用(P ＜0.05);PF 50,100 mg·kg-1可上调GCRα,GCRα mRNA的表达、下调GCRβ和GCRβmRNA的表达(P＜0.01),PF抑制CIA大鼠关节滑膜炎性介质可能与其调节GCR表达有关.
关键词： 芍药苷 胶原诱导型关节炎 糖皮质激素受体 逆转录-聚合酶链反应 -
补肾舒脊颗粒对人骨髓间充质干细胞BMP-4、Smad-4mRNA及蛋白表达的影响
目的 研究补肾舒脊颗粒对人骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白(BMP)通路BMP-4、Smad-4mRNA及蛋白表达的影响.方法 体外培养人骨髓间充质干细胞,并将其分为空白组、西药组、模型组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组,向成骨细胞诱导,干预28天后提取mRNA及蛋白,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹试验(Western blot)检测BMP-4、Smad-4 mRNA及其蛋白的表达.结果 (1) RT-PCR结果发现,与模型组比较,中药低剂量组BMP-4 mRNA表达水平降低(P＜0.05),中药中、高剂量组BMP-4、Smad-4 mRNA表达水平降低(P＜0.05).与西药组比较,中药低、中、高各剂量组BMP-4、Smad-4 mRNA水平均降低(P＜0.05).与中药低剂量组比较,中药中剂量组BMP-4 mRNA表达水平降低(P＜0.05),中药高剂量组BMP-4、Smad-4 mRNA表达水平降低(P＜0.05).(2) West-ern blot结果发现,与空白组比较,模型组BMP-4蛋白表达降低(P＜0.05);与模型组比较,西药组、中药低、中剂量组BMP-4、Smad-4蛋白表达均降低(P＜0.05);与西药组比较,中药中剂量组BMP-4、Smad-4蛋白表达水平降低(P＜0.05).结论 补肾舒脊颗粒可能通过BMP通路抑制BMP-4及Smad-4的表达,从而起到延缓强直性脊柱炎异位骨化的作用.其中中药低剂量组可以降低BMP-4表达水平,而中、高剂量组可以降低BMP-4、Smad-4表达水平.
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人肌肉组织褪黑素受体mRNA的表达
为证实褪黑素受体(melatonin receptor, MR)存在于人肌肉组织内, 取人脊柱两侧肌肉组织抽提总RNA, 应用RT-PCR检测MR mRNA并测序.结果表明人脊柱两侧肌肉组织内有褪黑素受体mt1及MT2表达, 测序结果与人类褪黑素受体cDNA相吻合.证明肌肉组织是褪黑素作用的靶器官, 褪黑素可能通过存在于肌肉组织中的mt1及MT2受体, 来调节脊柱两侧肌肉组织的生长发育.
关键词： 褪黑素 受体 逆转录-聚合酶链反应 肌肉组织 -
大鼠蛛网膜下腔出血脑基底动脉内皮素受体mRNA表达的变化
目的探讨实验性蛛网膜下腔出血诱发脑血管痉挛时,内皮素受体-A(ETA)基因在大鼠脑基底动脉的表达变化及在诱发脑血管痉挛中的作用.方法56只Wistar大鼠随机分为正常组、蛛网膜下腔出血组(2、3、7、14 d)、生理盐水组和假手术组,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),以β-actin为内参照基因,分别检测各组实验动物脑基底动脉ETA mRNA的表达变化.结果蛛网膜下腔出血后2、3 d组脑基底动脉ETA mRNA表达较正常组明显增高,7 d组仍增高,14 d组趋于正常.结论ETA在蛛网膜下腔出血诱发脑血管痉挛的病理生理过程中可能起重要作用.
关键词： 蛛网膜下腔出血 脑血管痉挛 内皮素受体-A 逆转录-聚合酶链反应 大鼠 -
shRNAs对胃癌细胞系BGC-823胃泌素表达的抑制效应
目的 研究shRNAs对胃癌细胞系BGC-823胃泌素表达的抑制效应.方法 设计4条针对胃泌素基因不同位点的寡核苷酸序列,通过体外转录法合成相应的shRNAs.以10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L和80nmol/L的终浓度,将4条shRNAs分别转染胃癌细胞BGC-823.应用原位杂交及免疫细胞化学方法检测胃泌素表达的抑制效果,筛选有效的shRNA.应用RT-PCR进一步验证其对胃泌素mRNA的抑制效应.应用MTT法检测4条shRNAs在不同浓度下对BGC-823细胞的增殖抑制效应.结果 转染后24h、48h及72h,胃泌素表达均被明显地抑制,并呈现浓度及时间依赖的趋势.shRNA3转染后72h,mRNA及蛋白水平表现出佳的抑制效率,分别为(54.27±0.042)%和(41.69±0.038)%.RT-PCR结果显示,shRNA3对BGC-823细胞胃泌素mRNA的抑制率为48.1%.MTT结果显示,除shRNA4处理组外,其余3组处理细胞均表现出浓度依赖性的增殖抑制趋势.结论 4条shRNAs在mRNA及蛋白水平均明显地抑制了胃癌细胞BGC-823胃泌素的表达,shRNA3可能为有效的胃泌素-shRNA.shRNA对胃泌素表达的抑制,显著降低了BGC-823细胞增殖能力.
关键词： 胃泌素 shRNA 胃癌 原位杂交 逆转录-聚合酶链反应 -
含人过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因高效真核表达载体的构建及其意义
目的 构建高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体δ(hPPARδ)的真核表达载体,为hPPARδ受体功能和基于hPPARδ受体靶点的药物筛选提供分子研究平台.方法 采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),从HepG2细胞总RNA克隆hPPARδ全长基因,与经BamHI、SalI相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建重组质粒phPPARδ-IRES2-EGFP,经酶切及基因测序鉴定重组质粒中hPPARδ基因的完整性和忠实性;荧光显微镜观察重组质粒转染的293细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞hPPARδ的表达进行荧光定量PCR和免疫细胞化学检测.结果 经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的293细胞中获得hPPAR6的高效表达.结论 成功构建phPPARδ-IRES2-EGFP重组质粒.
关键词： 过氧化物酶体增殖物激活受体δ 基因克隆 真核表达 逆转录-聚合酶链反应 -
尼古丁对脂多糖诱导的小胶质细胞激活及活化后细胞死亡的影响
目的 观察尼古丁对脂多糖(LPS)诱导的小胶质细胞激活及活化后细胞死亡的影响. 方法 建立慢性尼古丁暴露的小鼠动物模型,腹腔注射LPS诱导小胶质细胞激活,应用免疫组织化学方法 观察皮质、海马、黑质CD-11b阳性小胶质细胞表达的变化;BV2细胞(小鼠小胶质瘤细胞系)传代培养,运用CCK-8试剂盒检测细胞活性,一氧化氮检测试剂盒检测一氧化氮(NO)释放情况,RT-PCR分析诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、环氧化酶-2(COX-2)、干扰素调节因子1(IRF-1)、Caspase-11 mRNA的表达,免疫印迹法分析P-I-κB、Caspase-3的表达变化. 结果 尼古丁抑制LPS诱导的皮质、海马、黑质CD-11b阳性小胶质细胞的表达;尼古丁抑制LPS刺激引起的BV2细胞的死亡,NO的释放,iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、IRF-1、Caspase-11 mRNA的表达,P-I-κB、Caspase-3蛋白的表达. 结论 尼古丁可以抑制LPS诱导的小胶质细胞活化及激活诱导的细胞死亡(AICD),对脑内炎症反应具有神经保护作用.
